一種海洋天然抗膠質(zhì)瘤活性物質(zhì)及制備和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及從海洋放線菌菲律賓鏈霉菌（Streptomyces filipinensis ZQ-22)中制備一種新的海洋天然抗膠質(zhì)瘤活性物質(zhì)Bagremycin C的方法W 及該化合物在制備抗膠質(zhì)瘤藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見和死亡率極高的腦腫瘤，約占所有惡性腦腫瘤的 70%。手術(shù)后輔W放療和化療相結(jié)合是目前膠質(zhì)瘤最常用的治療方法。由于膠質(zhì)瘤累及許 多重要腦功能區(qū)，使得膠質(zhì)瘤切除手術(shù)極為困難，所W，與其它腫瘤相比，藥物對膠質(zhì)瘤的 治療就更為重要。但是，目前全球用于治療膠質(zhì)瘤的藥物嚴(yán)重缺乏，只有包括替莫挫胺 (TMZ)、卡氮芥(BCNU)和環(huán)己亞硝脈(CCNU)等為數(shù)不多的幾種?，F(xiàn)有運(yùn)些抗膠質(zhì)瘤藥大多都 是W細(xì)胞毒為治療原理的燒化劑對腦膠質(zhì)瘤的治療存在嚴(yán)重不足，主要包括：（1)毒副作用 大，對患者產(chǎn)生較大的不良反應(yīng)；（2)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對藥物耐藥性的不斷增加嚴(yán)重影響藥物的 療效；（3)血腦屏障的阻礙限制了治療腦膠質(zhì)瘤藥物到達(dá)腦內(nèi)發(fā)揮更有效的療效。很顯然， 臨床上迫切需要療效好、毒副作用小、容易透過血腦屏障、作用機(jī)制獨(dú)特的治療膠質(zhì)瘤新型 藥物。
[0003] 源自天然產(chǎn)物的藥物為人類的健康貢獻(xiàn)巨大，特別是抗感染藥物和抗腫瘤藥物。 據(jù)統(tǒng)計，有超過大約50%的抗腫瘤藥物與天然產(chǎn)物有關(guān)。但是，遺憾的是目前全球還沒有與 天然產(chǎn)物有關(guān)的抗膠質(zhì)瘤藥物在臨床上使用。特殊的生態(tài)環(huán)境使海洋微生物形成了獨(dú)特的 有別于陸生微生物的新陳代謝途徑和適應(yīng)機(jī)制，從而產(chǎn)生眾多結(jié)構(gòu)新穎和生物活性多樣的 代謝產(chǎn)物，是發(fā)現(xiàn)抗膠質(zhì)瘤新藥的重要新資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一株放線菌菲律賓鏈霉菌（Streptomyces filipinensis ZQ-22)，分類命名為Str邱tomyces filipinensis ZQ-22,該菌種已經(jīng)被中國典型培養(yǎng)物保 藏中屯、-武漢中屯、保藏，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號CCTCC N0:M 2015676,保藏日 期:2015年11月12日。
[0005] 本發(fā)明提供的放線菌菲律賓鏈霉菌(Streptomyces filipinensis ZQ-22)是從紅 樹林下±壤中分離的，是具有抗膠質(zhì)瘤活性的海洋菌株ZQ-22,通過W下步驟分離培養(yǎng)得 到：
[0006] (1)菲律賓鏈霉菌(Streptomyces filipinensis ZQ-22)的分離培養(yǎng)
[0007] 取空氣干燥的紅樹林±壤稀釋成一定的濃度，取一定量的樣品稀釋液均勻分散到 含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在室溫條件下培養(yǎng)一定時間后，將不同的菌落分別轉(zhuǎn)移到另 一含有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在室溫條件下繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。最后將單一菌落(ZQ-22) 接種到斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后置4Γ冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[000引所述的紅樹林±壤是從廣東珠海洪澳紅樹林濕地生態(tài)園中獲得;所述樣品稀釋液 的濃度為1 X 10-6~1 X l(T4g/mM所述樣品稀釋液的取樣量為100~30化レ所述培養(yǎng)皿所含 的固體培養(yǎng)基為高氏瓊脂(Gause^s agar)培養(yǎng)基或其它固體培養(yǎng)基;所述的斜面培養(yǎng)基為 高氏瓊脂培養(yǎng)基或其它固體斜面培養(yǎng)基;所述的室溫培養(yǎng)溫度為20~3(TC;所述的培養(yǎng)時 間為7~15天。
[0009] (2)菲律賓鏈霉菌(Streptomyces filipinensis ZQ-22)的菌種鑒定
[0010] 上述步驟（1)分離培養(yǎng)所獲得的菌株ZQ-22使用實驗室目前常用的16S rDNA序列 分析方法鑒定其種類，確定為菲律賓鏈霉菌，分類命名為Str邱tomyces filipinensis ZQ- 22。該菌種已經(jīng)被中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、-武漢中屯、保藏，保藏編號CCTCC NO :M 2015676,保藏日期:2015年11月12日。
[0011]本發(fā)明的再一個目的是提供一種具有抗膠質(zhì)瘤活性的化合物Bagremycin C(l)， 所述的Bagremycin C為一新化合物，該化合物由Streptomyces filipinensis ZQ-22產(chǎn)生， 其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：
[0012]
[OOU]本發(fā)明的第Ξ個目的是提供活性物質(zhì)Bagremycin C的制備方法，通過W下步驟實 現(xiàn)：
[0014] (1)菲律賓鏈霉菌(Streptomyces filipinensis ZQ-22)發(fā)酵菌液的制備
[0015] 取菲律賓鏈霉菌（Streptomyces filipinensis ZQ-22)的菌落接種到含有一定量 的液體菌種培養(yǎng)基的大Ξ角燒瓶中，將含有ZQ-22菌種的培養(yǎng)液在室溫條件下振蕩培養(yǎng)一 定時間后W制備菌種液。最后將菌種液轉(zhuǎn)入含有一定量的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的大Ξ角燒瓶， 在室溫條件下振蕩發(fā)酵培養(yǎng)一定時間后，得到具有抗膠質(zhì)瘤活性的ZQ-22的發(fā)酵菌液。
[0016] 所述的液體菌種培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基均為液體高氏培養(yǎng)基；所述的用量為 100-2001^;所述的大Ξ角培養(yǎng)瓶為250或50〇1^;所述的室溫培養(yǎng)溫度為20~30°C;所述振 蕩的轉(zhuǎn)速為160-18化pm;所述的培養(yǎng)時間為5~15天。
[0017] (2)活性物質(zhì)Bagremycin C的提取分離純化
[0018] 上述步驟(1)所獲得的菌株ZQ-22發(fā)酵菌液過濾后得到菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體用 100%甲醇提取，提取液濃縮后得到浸膏A。發(fā)酵液通過大孔吸附樹脂化IAI0N HP-20)柱層 析，分別用10%和100%的甲醇洗脫，甲醇洗脫液濃縮后得到浸膏B。浸膏A和浸膏B合并的總 浸膏用十八烷基硅烷鍵合硅膠(0DS)柱層析分離，分別用50%、70%甲醇水和100%甲醇洗 脫。70%的甲醇水洗脫液合并后經(jīng)減壓濃縮得到組分C。組分C再用0DS柱層析分離，用60% 的甲醇水洗脫，分段收集洗脫液，并用高效液相化PLC)檢測各組分，將含有單一活性物質(zhì) Bagremycin C的組分合并，減壓濃縮后得純化合物Bagremycin C。
[0019] 所述柱層析的0DS或DIAI0N冊-20的用量與上量的樣品量比例是40~60g:1.0g; 所述的高效液相分離條件是:Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent 1260DAD檢測器， Agilent Zorbax SB-Cis色譜柱(250X4.6mm，5皿），75%甲醇/25%水為流動相，柱溫26°C， 檢測波長256nm，流速為1. OmL/min。
[0020] (3)活性物質(zhì)Bagremycin C的結(jié)構(gòu)鑒定
[0021] 活性物質(zhì)Bagremycin C的結(jié)構(gòu)是根據(jù)它的一維和二維的核磁共振譜(NMR)、高分 辨質(zhì)譜化RMS)和旋光度[α ] D來鑒定的。
[0022] 本發(fā)明的最后一個目的是提供活性物質(zhì)Bagremycin C在制備治療膠質(zhì)瘤藥物中 的應(yīng)用。所述的Bagremycin C可顯著抑制多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡;所 述藥物為Bagremycin C活性成分單獨(dú)，或Bagremycin C與其它藥物或有效成分一起，與藥 學(xué)上可接受的載體組成的藥物;所述藥物的制劑形式為:液體制劑、固體制劑、膠囊制劑、緩 釋制劑、納米制劑。
[0023] 本發(fā)明從紅樹林下±壤中分離到具有抗膠質(zhì)瘤活性的海洋放線菌菲律賓鏈霉菌 (S化eptomyces filipinensis ZQ-22)，并從該菌株中發(fā)現(xiàn)了一種新的抗膠質(zhì)瘤活性化合 物，命名為Bagremycin C。該化合物顯著抑制不同膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，并顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 調(diào)亡和影響腫瘤細(xì)胞周期。Bagremycin C在制備治療膠質(zhì)瘤藥物方面具有良好的應(yīng)用前 景。
【附圖說明】
[0024] 圖 1.菲律賓鏈霉菌(Streptomyces filipinensis ZQ-22)的菌落圖。
[0025] 圖2-4.活性物質(zhì)Bagremycin C的氨譜。
[0026] 圖5-7.活性物質(zhì)Bagremycin C的碳譜。
[0027] 圖8-10.活性物質(zhì)Bagremycin C的服QC譜。
[002引圖 11-13.活性物質(zhì)Bagremycin C的HMBC譜。
[00巧]圖14.活性物質(zhì)Bagremycin C的高分辨質(zhì)譜。
[0030] 圖15.活性物質(zhì)Bagremycin C的HMBC相關(guān)示意圖。
[0031] 圖16.活性物質(zhì)Bagremycin巧Φ制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。
[0032] 圖17.活性物質(zhì)Bagremycin邱且滯膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期于G日/Gi期。
[0033] 圖18.活性物質(zhì)Bagremycin C誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞調(diào)亡。
【具體實施方式】
[0034] W下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。但是，本發(fā)明不限于運(yùn)些實 施例。
[OO%] 實施例1.菲律賓鏈霉菌(Streptomyces filipinensis ZQ-22)的分離培養(yǎng)
[0036] 取空氣干燥的紅樹林±壤1克用海水稀釋成濃度為1 X l(T6g/mL的樣品稀釋液，取 200化的樣品稀釋液均勻分散到含有高氏瓊脂(Gause^ S agar)固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在 28Γ條件下培養(yǎng)7天后，將不同的菌落分別轉(zhuǎn)移到另一含有高氏瓊脂固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿 中，在28Γ條件下繼續(xù)培養(yǎng)7天。最后將生長良好的單一菌落(ZQ-22)接種到高氏瓊脂斜面 培養(yǎng)基培養(yǎng)后置4 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0037] 實施例2.菲律賓鏈霉菌(Streptomyces filipinensis ZQ-22)的菌種鑒定
[0038] 使用16S rDNA序列分析方法鑒定所獲得菌株ZQ-22的種類。
[0039] 2.1實驗試劑及儀器
[0040] PCR試劑：EX Taq酶（TaKaRa)，dNTP(TaKaRa)，引物（Invitrogen合成），引物序列 是：TACGGYTACCTTGTTACGACTT和AGAGTTTGATCMTGGCTCAG;
[0041] Marker：DL5000；
[00創(chuàng)實驗儀器:離屯、機(jī)，電泳儀，PCR儀，ABI 3730化測序儀。
[0043] 2.2實驗步驟
[0044] 細(xì)菌基因組DNA抽提
[0045] 電泳檢測
[0046] PCR 擴(kuò)增
[0047] a.PCR反應(yīng)體系
[004引
[0049] b.PCR反應(yīng)條件
[(K)加 ]
[0化1] C.電泳檢測
[0052] d.測序:切膠純化測序
[0053] e.分析結(jié)果:拼接序列。
[0化4] 2.3實驗結(jié)果
[0055]拼接后的序列為：
[0化6]

[0化7] w上獲得的16S rDNA序列與美國NIH的NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫比較，其結(jié)果表明：菌 株ZQ-22的 16S rDNA序列與GenBank庫中的Streptomyces filipinensis strain NBRC 12860的16S rDNA序列有99%的相似性(登錄號:KJ789323.1)。因此，本發(fā)明所獲得的海洋 菌株ZQ-22定為菲律賓鏈霉菌（Streptomyces filipinensis ZQ-22K附圖1)。菲律賓鏈霉 菌（Sheptomyces filipinensis ZQ-22)菌株已被中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、-武漢中屯、保 藏，保藏編號CCTCC NO:M 2015676,保藏日期:2015年11月12日。
[005引實施例3.菲律賓鏈霉菌(Streptomyces filipinensis ZQ-22)發(fā)酵菌液的制備 [0059] 將菲律賓鏈霉菌（S化eptomyces filipinensis ZQ-22)接種到含有200mL液體高 氏培養(yǎng)基的500mLS角