穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細胞株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬生物技術(shù)、微生物動物細胞系領(lǐng)域，涉及骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細胞株，具體涉及一種穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細胞株及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndeome，MDS)是一組克隆性細胞異常增生的疾病，以無效造血、病態(tài)造血及高風(fēng)險向急性髓系白血病(AML)轉(zhuǎn)化為特點，其中，約20%-30%的MDS患者向AML進展。據(jù)報道，在美國，MDS是最常見的髓系來源的腫瘤，男性發(fā)病率高于女性，平均每15個美國人中有3-4人患有MDS;隨著年齡的增加，MDS的發(fā)病率逐漸增加;在年齡大于60歲的患者中，發(fā)病率高達7-35/10萬，有研究顯示先前行化療及放療治療的患者是MDS發(fā)病的高危人群。有統(tǒng)計顯示，我國MDS的發(fā)病率為1.45/10萬，略低于歐美國家，隨著我國老齡化進程逐漸加劇，MDS的發(fā)病率也呈持續(xù)上升狀態(tài)?；谛螒B(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細胞遺傳學(xué)和免疫表型，世界衛(wèi)生組織(WHO)將MDS分為:難治性血細胞減少癥伴單系病態(tài)造血(RCUD)、難治性血細胞減少伴多系病態(tài)造血(RCMD)、環(huán)形鐵粒幼細胞性難治性貧血(RARS)、難治性貧血伴原始細胞增多I型(RAEB-1)、難治性貧血伴原始細胞增多2型(RAEB-2)、5q-綜合征、不能分類的MDS(MDS-U)。
[0003]研究顯示，在MDS的早期階段，造血細胞過度凋亡導(dǎo)致一系或者多系細胞減少。在MDS中細胞遺傳學(xué)的進一步改變導(dǎo)致造血細胞增殖加速、分化受阻，最終進展為AML。與初發(fā)AML(de novo AML)相比，MDS轉(zhuǎn)化的AML(sAML)患者年齡偏大，治療難度大，常常不能應(yīng)用異基因造血干細胞移植(Al 1-HSCT)和強烈化療進行治療，其預(yù)后不佳;研究還顯示，隨著地西他濱及阿扎胞苷等去甲基化藥物的研發(fā)，治療MDS的手段取得了突破性進展，但該些藥物對高危MDS和sAML的治療作用有限。由于臨床實踐缺乏有效的治療手段，體內(nèi)的白血病細胞難以清除，最終威脅患者的生命;然而，目前國內(nèi)外缺乏有效可靠的體內(nèi)外研究平臺，嚴重制約了MDS的基礎(chǔ)及臨床前研究。
[0004]隨著基因標記技術(shù)的發(fā)展，細胞示蹤在腫瘤的研究中得到了越來越多的應(yīng)用；綠色焚光蛋白(green fluorescent protein,GFP)可以在相應(yīng)波長的紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，與傳統(tǒng)的新霉素耐藥基因(NeoR)和編碼大腸桿菌β-半乳糖苷酶的Lac-Z基因標記技術(shù)相比，GFP標記腫瘤細胞具有動態(tài)直觀、操作簡便、檢測方便、靈敏度高的優(yōu)點，可以靈敏地顯示腫瘤細胞的位置，并進行定量研究，可應(yīng)用于微小殘留病等的研究，而且隨著動物活體成像技術(shù)的發(fā)展，GFP也適合體內(nèi)細胞的觀察；同時，由于其分子量小，GFP可以與其他目的基因表達產(chǎn)物形成融合蛋白，不影響目的蛋白的空間構(gòu)象和功能，用于目的蛋白的位置標記、功能和定量研究;基于以上幾點，以GFP進行細胞示蹤為相關(guān)的腫瘤的研究提供了新的平臺。
[0005]微量殘留白血病(minimal residual leukemia,MRL)是指白血病經(jīng)誘導(dǎo)治療獲得完全緩解后體內(nèi)殘留少量白細胞的狀態(tài)，其是白血病復(fù)發(fā)的根源；由于微小殘留白血病分布隱蔽，通常臨床不易檢測，成為MRL研究的瓶頸。
[0006]基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬提供使GFP高效和穩(wěn)定地在細胞中表達的技術(shù)方案，具體涉及提供一種穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細胞株及其制備方法，進一步用于建立小鼠動物模型，利用熒光在成像上的優(yōu)勢，在動物體內(nèi)長期觀察，明確白血病細胞分布模式;為微小殘留病的研究提供平臺。
[0007]與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有:
[0008]1.Tefferi AjVardiman Jff.Myelodysplastic syndromes.N Engl J Med 2009；361:1872-85.
[0009]2.Garcia-Manero G,Fenaux P.Hypomethylating agents and other novelstrategies in myelodysplastic syndromes.J Clin Oncol 2011;29:516-23.
[0010]3.Morel PjHebbar MjLai 幾，Duhamel AjPreudhomme CjWattel EjBauters F，F(xiàn)enaux P.Cytogenetic analysis has strong independent prognostic value in denovo myelodysplastic syndromes and can be incorporated in a new scoringsystem:a report on 408 cases.Leukemia 1993;7:1315-23.
[0011]4.Lee JJjKim HJjChung IJjKim JSjSohn SKjKim BSjLee KHjKwak JYjParkYH,Ahn JS and others.Comparisons of prognostic scoring systems formyelodysplastic syndromes:a Korean multicenter study.Leuk Res 1999;23:425-32.
[0012]5.Rollison DEjHowlader NjSmith MT,Strom SSjMerritt WDjRies LAjEdwardsBK,List AF.Epidem1logy of myelodysplastic syndromes and chronicmyeloproliferative disorders in the United States，2001—2004,using data fromthe NAACCR and SEER programs.Blood 2008；112:45-52.
[0013]6.Dan C,Chi J,Wang L.Molecular mechanisms of the progress1n ofmyelodysplastic syndrome to secondary acute myeloid leukaemia and implicat1nfor therapy.Annals of Medicine 2015:1-9.
[0014]7.Lubbert Mj Suciu SjBaila LjRuter BHjPlatzbecker UjGiagounidis A，Selleslag D,Labar B,Germing UjSalih HR and others.Low-dose decitabine versusbest supportive care in elderly patients with intermediate—or high-riskmyelodysplastic syndrome(MDS)ineligible for intensive chemotherapy:finalresults of the randomized phase III study of the European Organisat1n forResearch and Treatment of Cancer Leukemia Group and the German MDS StudyGroup.J Clin Oncol 2011;29:1987-96.
[0015]8.Fili C,Malagola MjFollo MYjFinelli C,Iacobucci I,Martinelli G，Cattina FjClissa CjCandoni AjFanin R and others.Prospective phase II Study on5-days azacitidine for treatment of symptomatic and/or erythropoietinunresponsive patients with low/INT-l-risk myelodysplastic syndromes.ClinCancer Res 2013;19:3297-308.
[0016]9.Hoffman R.Green fluorescent protein imaging of tumour growth,metastasis,and ang1genesis in mouse models.Lancet Oncol 2002；3:546-56.
[0017]10.江千里，王健民，江汕，溫麗敏，胡曉霞，周虹，許小平.eGFP標記腫瘤細胞小鼠模型的建立與應(yīng)用.中國腫瘤生物治療雜志2006:296-300.
[0018]11.Chalfie M1Tu Y,Euskirchen G,Ward Wff1Prasher DC.Green fluorescentprotein as a marker for gene express1n.Science 1994;263:802-5.
[0019]12.許小平，費新紅，陳莉，呂書晴，高磊，倪雄，許曉巍，賈新顏.表達綠熒光蛋白的多藥耐藥微小殘留白血病細胞的小鼠模型.中國實驗血液學(xué)雜志2005:1014-1017.
[0020]13.高苒，劉學(xué)麗，馮娟，張連峰.熒光標記技術(shù)在腫瘤模型研究中的應(yīng)用.中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2008:59-61+85-86.
[0021]14.Kayser S,Schlenk RF ,Grimwade D,Yosuico VE,Walter RB.Minimalresidual disease-directed therapy in acute myeloid leukemia.Blood 2015；125:2331-2335.0

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022]本發(fā)明的目的是基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，提供一種穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細胞株及其制備方法，進一步用于建立小鼠動物模型，利用熒光在成像上的優(yōu)勢，在動物體內(nèi)長期觀察，明確白血病細胞分布模式;為微小殘留病的研究提供平臺。
[0023]本發(fā)明中，將綠色熒光蛋白(GFP)導(dǎo)入細胞，使GFP高效和穩(wěn)定地在細胞中表達，建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細胞株。
[0024]本發(fā)明中，以人骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細胞系SKM-1為母系細胞，通過攜帶GFP基因的慢病毒進行轉(zhuǎn)染，以有限稀釋法獲得GFP陽性的單細胞克隆，將擴大培養(yǎng)后的細胞通過皮下注射的方式在小鼠體內(nèi)篩選，致瘤后將瘤塊分離，繼續(xù)進行培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)白細胞株SKM-1/GFP，該細胞系能穩(wěn)定表達GFP。所述的細胞株已于2015年12月28日保藏，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101，保藏編號:CGMCC N0.11798,分類命名:人穩(wěn)定表達綠色熒