一種一體式t細(xì)胞培養(yǎng)提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)療技術(shù)領(lǐng)域，特別針對外周血免疫T細(xì)胞分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染，是一種一體式T細(xì)胞培養(yǎng)提取方法，尤其針對嵌和抗原受體T細(xì)胞(CART)培養(yǎng)、自然殺傷T細(xì)胞培養(yǎng)和腫瘤特異T細(xì)胞受體T細(xì)胞(TCRT)。
【背景技術(shù)】
[0002]外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)是一種常見的體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，其中涉及外周血淋巴細(xì)胞的分離，一般采用FICOLL梯度離心吸取淋巴細(xì)胞層到一個培養(yǎng)皿中，或者用吸附⑶3或⑶28抗體的磁珠特異性吸附T淋巴細(xì)胞在磁珠表面，然后用普通培養(yǎng)皿里培養(yǎng)，用吸管吸取淋巴細(xì)胞到一個培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，這種培養(yǎng)是在一個開放的細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)廚(潔凈工作臺)中完成，空間大轉(zhuǎn)移過程容易受到空氣中的細(xì)菌病毒等微生物的污染，放在37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染時，需要移出來放到通風(fēng)廚里面換液加轉(zhuǎn)染液，然后再放回到37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，中間還需要反反復(fù)復(fù)從細(xì)胞培養(yǎng)箱里面拿出來到潔凈工作臺，又從潔凈工作臺到細(xì)胞培養(yǎng)箱中，一直到培養(yǎng)完成。臨床上CART細(xì)胞培養(yǎng)做這樣的操作程序只能一次一個病人，兩個病人在同一個細(xì)胞培養(yǎng)房內(nèi)是不允許的，因?yàn)闊o法保證兩個病人的血細(xì)胞培養(yǎng)不互相交叉污染，因此目前臨床級別的血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在這種開放培養(yǎng)方式下手續(xù)煩瑣，效率低下，人力物力消耗很大，成本很高，無法大規(guī)模推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對以上不足之處，提供了一體式T細(xì)胞培養(yǎng)提取方法，成本低，占用空間小，將細(xì)胞培養(yǎng)分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染、后續(xù)擴(kuò)增和提取融為一體，避免交叉感染。
[0004]本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的方案是:一種一體式T細(xì)胞培養(yǎng)提取方法，其特征在于，將血液標(biāo)本輸入至一密閉的容器中，所述容器容置于一密閉的37°C的保溫箱內(nèi)，在所述容器中依次完成T細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染、后續(xù)擴(kuò)增和提取，包括以下步驟:
步驟SI:將血液標(biāo)本經(jīng)容器頂部的入口輸入至容器內(nèi)，容器內(nèi)容置有若干個磁珠顆粒，每個磁珠顆粒上附著有用于與血液標(biāo)本中T細(xì)胞或自然殺傷T細(xì)胞結(jié)合的抗體，所述抗體與血液標(biāo)本中的T細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)行充分結(jié)合，完成T細(xì)胞的分離；
步驟S2:通過一電磁鐵將磁珠顆粒吸附聚集于容器內(nèi)側(cè)壁上，將血液標(biāo)本中未與磁珠顆粒反應(yīng)結(jié)合的細(xì)胞經(jīng)容器底部的出口流出至廢液袋，同時往容器中輸入生理鹽水進(jìn)行沖洗；
步驟S3:沖洗結(jié)束后，關(guān)閉容器的出口，將培養(yǎng)液和含有空氣和C02的混合氣體輸入至容器中，同時電磁鐵斷電，磁珠顆粒上吸附的T細(xì)胞在容器中進(jìn)行培養(yǎng)，計算此時T細(xì)胞的數(shù)量為N，N為正整數(shù)，且大于O;
步驟S4:在培養(yǎng)液的作用下，T細(xì)胞在容器中擴(kuò)增，待T細(xì)胞的數(shù)量大于5N時，將病毒轉(zhuǎn)染液輸入至容器內(nèi)，進(jìn)行T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染；
步驟S5:轉(zhuǎn)染后的T細(xì)胞在容器中進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增至特定數(shù)量； 步驟S6:打開容器的出口，容器中的培養(yǎng)液流出至一廢液袋中；
步驟S7:將生理鹽水輸入至容器內(nèi)水加力將T細(xì)胞從磁珠顆粒表面洗脫，將T細(xì)胞提取輸入至一含有生理鹽水的輸液袋中供臨床使用。
[0005]進(jìn)一步的，所述容器的頂部入口處設(shè)有一呈Y型的單向雙入口管，所述容器的底部出口處設(shè)有一用于排液的單向雙出口管;所述電磁鐵設(shè)置于容器的外側(cè)壁且與一控制模塊電連;所述容器的側(cè)壁上還分別設(shè)有用于輸入生理鹽水的進(jìn)液管、用于輸入空氣和C02的混合氣體的進(jìn)氣管和用于輸入培養(yǎng)液的輸液管，所述進(jìn)液管、進(jìn)氣管和輸液管上均設(shè)有一用于調(diào)節(jié)輸入量的調(diào)節(jié)閥，每個調(diào)節(jié)閥均與所述控制模塊電連;所述進(jìn)液管、進(jìn)氣管和輸液管均與所述容器內(nèi)部相連通;所述保溫箱上設(shè)有五個分別與所述單向雙入口管、單向雙出口管、進(jìn)液管、進(jìn)氣管和輸液管對應(yīng)配合穿出的通孔。
[0006]進(jìn)一步的，所述單向雙入口管包括位于單向雙入口管頂端的血液標(biāo)本入口和包裝病毒轉(zhuǎn)染液入口，所述單向雙出口管的底端設(shè)置有第一出口和第二出口，所述第一出口與廢液袋相連通，所述第二出口與輸液袋相連通;所述廢液袋容置有少量防腐劑。
[0007]進(jìn)一步的，所述單向雙入口管的下端和單向雙出口管的上端分別設(shè)有一第一單向閥和第二單向閥，所述第一單向閥和第二單向閥均與控制模塊電連。
[0008]進(jìn)一步的，所述容器的外形為橢圓形或者圓形，所述容器的底面呈水平。
[0009]進(jìn)一步的，在步驟SI中，所述抗體為⑶3單克隆抗體、CD3多克隆抗體、CD28抗體、CD4或CD8。
[0010]進(jìn)一步的，在所述步驟S3中，通過LYTRO ILLUM照相機(jī)拍照計算每個磁珠顆粒上的吸附的T細(xì)胞數(shù)。
[0011]進(jìn)一步的，在所述步驟SI中，通過搖晃容器，使得抗體與血液標(biāo)本中的T細(xì)胞進(jìn)行充分結(jié)合30min-40min，完成T細(xì)胞的分離。
[0012]進(jìn)一步的，所述容器放置于一潔凈室內(nèi)，所述潔凈室的入口處自外向內(nèi)依次設(shè)有一更、二更、三更衣服通道以及貨物通道，所述潔凈室還設(shè)置有傳遞窗。
[0013]進(jìn)一步的，還包括一用于支撐所述電磁鐵的機(jī)械手，所述機(jī)械手設(shè)置于所述容器下方且經(jīng)一電機(jī)驅(qū)動繞所述容器轉(zhuǎn)動;所述機(jī)械手還經(jīng)一縱向驅(qū)動機(jī)構(gòu)上下移動。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下有益效果:本發(fā)明通過將成T細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染、后續(xù)擴(kuò)增和提取在同一密閉的容器中完成，剔除了細(xì)胞培養(yǎng)過程中的煩瑣用人工換液，細(xì)胞培養(yǎng)皿和潔凈工作臺之間的移動互換，不需要單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)皿，不需要細(xì)胞培養(yǎng)潔凈工作臺，不需要細(xì)胞收集管，也不需要吸管和移液相關(guān)的輔助工具，避免了在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的煩瑣用人工換液，T細(xì)胞在所述容器之內(nèi)可以完成所有的細(xì)胞分離、培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和擴(kuò)增的程序，不但節(jié)省空間，節(jié)省耗材，還節(jié)省人力和物力成本。
【附圖說明】
[0015]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明專利進(jìn)一步說明。
[0016]圖1為本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017]圖2為本發(fā)明實(shí)施例的是方法步驟圖。
[0018]圖3為發(fā)明實(shí)施例帶有保溫箱的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019]圖中:1-容器;2-磁珠顆粒;3-單向雙入口管;4-單向雙出口管;5-進(jìn)氣管;6-進(jìn)液管;7-輸液管;8-電磁鐵;9-第一單向閥；10-第二單向閥；11-調(diào)節(jié)閥；12-保溫箱。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0021 ]如圖1-3所示，本實(shí)施例的一種一體式T細(xì)胞培養(yǎng)提取方法，其特征在于，將血液標(biāo)本輸入至一密閉的容器I中，所述容器I容置于一密閉的37°C的保溫箱12內(nèi)，在所述容器I中依次完成T細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染、后續(xù)擴(kuò)增和提取，包括以下步驟:
步驟SI:將血液標(biāo)本經(jīng)容器I頂部的入口輸入至容器I內(nèi)，容器I內(nèi)容置有若干個磁珠顆粒2，每個磁珠顆粒2上附著有用于與血液標(biāo)本中T細(xì)胞或自然殺傷T細(xì)胞結(jié)合的抗體，所述抗體與血液標(biāo)本中的T細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)行充分結(jié)合，完成T細(xì)胞的分離；
步驟S2:通過一電磁鐵8將磁珠顆粒2吸附聚集于容器I內(nèi)側(cè)壁上，將血液標(biāo)本中未與磁珠顆粒2反應(yīng)結(jié)合的細(xì)胞經(jīng)容器I底部的出口流出至廢液袋，同時往容器I中輸入生理鹽水進(jìn)行沖洗；
步驟S3:沖洗結(jié)束后，關(guān)閉容器I的出口，將培養(yǎng)液和含有空氣和C02的混合氣體輸入至容器I中，同時電磁鐵8斷電，磁珠顆粒2上吸附的T細(xì)胞在容器I中進(jìn)行培養(yǎng)，計算此時T細(xì)胞的數(shù)量為N，N為正整數(shù)，且大于O;
步驟S4:在培養(yǎng)液的作用下，T細(xì)胞在容器I中擴(kuò)增，待T細(xì)胞的數(shù)量大于5N時，將病毒轉(zhuǎn)染液輸入至容器I內(nèi)，進(jìn)行T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染；
步驟S5:轉(zhuǎn)染后的T細(xì)胞在容器I中進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增至特定數(shù)量；
步驟S6:打開容器I的出口，容器I中的培養(yǎng)液流出至一廢液袋中；
步驟S7:將生理鹽水輸入至容器I內(nèi)水加力將T細(xì)胞從磁珠顆粒2表面洗脫，將T細(xì)胞提取輸入至一含有生理鹽水的輸液袋中供臨床使用。
[0022]從上述可知，本發(fā)明的有益效果在于:病人新抽取的血標(biāo)本經(jīng)過抗血凝處理緩緩地注入至容器I中，輕輕搖晃讓血中淋巴細(xì)胞充分與磁珠顆粒2混合接觸，T細(xì)胞包括自然殺傷T細(xì)胞由于表面有CD3抗原自然而然與磁珠表面的CD3抗體結(jié)合將T細(xì)胞吸引在磁珠球表面(T細(xì)胞分離)，而血中的非T細(xì)胞成分則用生理鹽水緩緩地沖走，T細(xì)胞就留在一體化的容器I里面，吸附在磁珠表面生長擴(kuò)增，2-3天之后，T細(xì)胞擴(kuò)增到5倍或者以上時即可以做下一步轉(zhuǎn)染。通過密閉的容器I，完成一對一的T細(xì)胞培養(yǎng)，成本低，而且可以避免交叉感染。
[0023]在本實(shí)施例中，所述容器I的頂部入口處設(shè)有一呈Y型的單向雙入口管3，所述容器I的底部出口處設(shè)有一用于排液的單向雙出口管4;所述電磁鐵8設(shè)置于容器I的外側(cè)壁且與一控制模塊電連;所述容器I的側(cè)