一種固定化青霉素?；傅奶崛〖肮潭üに嚨闹谱鞣椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及催化劑制造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固定化青霉素酰化酶的提取及固定工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]固定化青霉素?；甘枪I(yè)上非常重要的生物催化劑，它能水解工業(yè)鹽生產(chǎn)6-APA，也能水解擴(kuò)環(huán)酸生產(chǎn)7-ADCAA-APA和7-ADCA是生產(chǎn)β—內(nèi)酰胺類半合體的兩個(gè)重要中間體。固定化青霉素?；敢部梢源呋孓D(zhuǎn)反應(yīng)，用于催化合成其他半合體。
[0003]顆粒型固定化青霉素酰化酶，應(yīng)用固化PCA生產(chǎn)6-ΑΡΑ，7—ADCA具有操作簡(jiǎn)便，產(chǎn)品收率高、成本低，三廢污染少等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]而制備顆粒型固定化青霉素酰化酶，首先要培養(yǎng)高活性的青霉素?；傅漠a(chǎn)生菌，然后利用產(chǎn)生菌發(fā)酵產(chǎn)生青霉素?；?，再將其提取出來固定在載體上方便應(yīng)用，現(xiàn)有技術(shù)還沒有合適的青霉素酰化酶的提取及固定工藝。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的，是為了解決上述問題，提供一種固定化青霉素?；傅奶崛〖肮潭üに?。
[0006]本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案如下:
一種固定化青霉素酰化酶的提取及固定工藝，包括如下步驟:
①酶的吸附:將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入到吸附罐中，用醋酸將所述發(fā)酵液的PH值調(diào)節(jié)至6.48-6.52之間，向吸附罐中投入氧化鋁，攪拌1.5-2.5小時(shí)，攪拌時(shí)間隔的測(cè)量發(fā)酵液的PH值，并用醋酸將其PH控制在6.48-6.52之間，攪拌完成后，測(cè)量發(fā)酵液中酶的活性，酶的活性大于
0.5umol/ml時(shí)，繼續(xù)投入氧化鋁進(jìn)行攪拌，直至測(cè)量酶的活性小于0.5Umol/ml時(shí)，吸附完畢，排出廢液；
②酶的洗脫:將步驟①中吸附完成的氧化鋁離心甩干，轉(zhuǎn)入洗脫柱中，用PH值為6.8-7.2、濃度為0.08-0.12mol/L的磷酸緩沖液進(jìn)行脫色洗滌，排出脫色洗滌液，再用PH值為
8.0、濃度為0.9-1.lmol/L的磷酸緩沖液進(jìn)行洗脫；
③濃縮:將不周②中的洗脫液栗入濃縮設(shè)備，所述濃縮設(shè)備為超濾過濾設(shè)備，濃縮至洗脫液內(nèi)酶的活性大于250umo Ι/ml時(shí)形成濃縮液，送冷庫冷凍備用；
④除菌:將濃縮液通過細(xì)菌過濾器除菌，所述細(xì)菌過濾器為平均孔徑小于0.22微米的過濾膜；
⑤固定:將濃縮液加入到固定化反應(yīng)罐中，加入帶有環(huán)氧基團(tuán)的多孔固定載體，加入所述多孔固定載體的質(zhì)量為加入濃縮液質(zhì)量的1/4-1/3，在20-25°C的溫度范圍內(nèi)連續(xù)攪拌20-28小時(shí)，之后改為間歇攪拌，每隔3-5小時(shí)攪拌8-12分鐘，直至從開始攪拌起滿72小時(shí)為止；
⑥干燥:將固定完成的濃縮液進(jìn)行干燥，并用無菌水洗滌至少三遍，甩干后即成。
[0007]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述步驟①的廢液經(jīng)殺菌后再排出。
[0008]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述步驟①中吸附完成的氧化鋁經(jīng)無菌水洗滌后，再進(jìn)入步驟②進(jìn)行洗脫，無菌水洗滌液經(jīng)殺菌后再排出。
[0009]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述步驟①中投入氧化鋁的千克數(shù)等于所述發(fā)酵液酶活力的1倍，所述發(fā)酵液酶活力的單位為umo Ι/ml。
[0010]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述步驟①中醋酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36%-38%。
[0011]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述步驟⑤中的多孔固定載體的孔隙率大于30%。
[0012]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，所述步驟⑥中的干燥方法為真空抽濾或離心甩干。
[0013]—種青霉素?；傅漠a(chǎn)生菌的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
①培養(yǎng)基制備:制備固體種子培養(yǎng)基、液體種子培養(yǎng)基或發(fā)酵種子培養(yǎng)基中的一種，在119-123°C下滅菌28-32分鐘，備用；
②菌種活化:將細(xì)菌種子保存液或細(xì)菌種子保存塊加入到培養(yǎng)基中，36.8-37.2°C下進(jìn)行培養(yǎng)，待用；
③制備菌種培養(yǎng)平板:將自來水和培養(yǎng)皿在119-123°C下滅菌28-32分鐘，備用；制備如步驟①中所述的固體種子培養(yǎng)基，在未凝固前，將I體積分?jǐn)?shù)的固體培養(yǎng)基倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，搖勻，冷卻凝固后備用；制備如步驟①中所述的固體種子培養(yǎng)基，并分成若干份在滅菌的試管中形成斜面；
④稀釋種子液:制備如步驟②中活化后的所述的液體種子培養(yǎng)基，分別稀釋1000倍、10000倍、100000倍及 1000000倍備用；
⑤種子液涂制并挑取:將步驟④中配置好的四種濃度的液體種子取0.0066-0.0067體積分?jǐn)?shù)分別滴加到不同的菌種培養(yǎng)平板中，使其涂布均勻，倒扣放置在培養(yǎng)箱中，并在36.8-37.2°C下培養(yǎng)46-50小時(shí)，挑取生長(zhǎng)的菌落，將其置于步驟③中形成固體種子培養(yǎng)基形成斜面的試管中；
⑥菌種培養(yǎng):將步驟⑤中的試管進(jìn)行編號(hào)或直接放入培養(yǎng)箱中，在36.8-37.2°C下培養(yǎng)卜2天；
⑦搖瓶初篩選:將步驟⑥中的試管進(jìn)行編號(hào)，初步培養(yǎng)后，將5%體積分?jǐn)?shù)的固體種子培養(yǎng)基連帶菌落接入搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所述搖瓶?jī)?nèi)設(shè)置有步驟①中所述的發(fā)酵種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中將搖床的轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至230-270轉(zhuǎn)/分鐘，在36.8-37.2°C下培養(yǎng)70-74小時(shí)，檢測(cè)各瓶細(xì)菌所產(chǎn)生的青霉素?；傅幕盍?；
⑧搖瓶復(fù)篩選:挑選經(jīng)步驟⑦檢測(cè)后青霉素酰化酶的活力排名在總數(shù)25%之前的固體種子培養(yǎng)基，并將與之對(duì)應(yīng)的步驟⑥中所述試管篩選出來;重復(fù)步驟⑦的初步培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，再挑選經(jīng)重復(fù)步驟⑦的初步培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)檢測(cè)后青霉素?；傅幕盍ε琶诳倲?shù)50%之前的固體種子培養(yǎng)基，并將與之對(duì)應(yīng)的步驟⑥中所述試管篩選出來，作為生產(chǎn)種子，將所述生產(chǎn)種子轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，形成母種。
[0014]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟①中所述固體種子培養(yǎng)基由I質(zhì)量份蛋白胨、0.6-
0.65質(zhì)量份酵母膏、0.9-1.1質(zhì)量份氯化鈉、1.9-2.1質(zhì)量份瓊脂以及95.2-95.5質(zhì)量份的水混合制成。
[0015]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟①中所述液體種子培養(yǎng)基由I質(zhì)量份蛋白胨、0.6-
0.65質(zhì)量份酵母膏、0.9-1.1質(zhì)量份氯化鈉、93.2-93.5質(zhì)量份的水混合制成。
[0016]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟①中所述發(fā)酵種子培養(yǎng)基由1.5質(zhì)量份蛋白胨、2.9-3.1質(zhì)量份淀粉、2.4-2.6質(zhì)量份酵母膏、0.08-0.12質(zhì)量份檸檬酸鈉、0.28-0.32質(zhì)量份磷酸氫二鉀以及92.3-92.9質(zhì)量份的水混合制成，混合時(shí)，先把淀粉用一半的水加熱溶解，其他成分與另一半水溶解，再將兩份溶液混合。
[0017]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟②中所述的菌種活化方法為將步驟①中所述的固體種子培養(yǎng)基裝入試管或茄子瓶，擺成斜面，所述斜面的長(zhǎng)度為所述試管的1/3-1/2，或，所述茄子瓶中的固體種子培養(yǎng)基頂端距離所述茄子瓶瓶頸的底端的距離大于2cm;將儲(chǔ)存的菌種放置于所述試管或所述茄子瓶?jī)?nèi)，并涂布均勻，36.8-37.2 °C下培養(yǎng)3-4天即可。
[0018]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟②中所述的菌種活化方法為將所述液體種子培養(yǎng)基取5體積份置于試管中，將0.000003-0.000005體積份菌種保存液置于其中，36.8-37.2°C下震動(dòng)培養(yǎng)23.5-24.5小時(shí)即可。
[0019]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟②中所述的菌種活化方法為將所述發(fā)酵種子培養(yǎng)基置于茄子瓶?jī)?nèi)，將儲(chǔ)存的菌種放置于所述茄子瓶?jī)?nèi)，并涂布均勻，36.8-37.2 °C下培養(yǎng)24-48小時(shí);將步驟①中所述液體種子培養(yǎng)基倒入到所述茄子瓶?jī)?nèi)，用刮刀刮下繁殖的菌種，將液相物質(zhì)倒入到接種瓶中即可。
[0020]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟⑦中所述的初步培養(yǎng)為用接種針取存儲(chǔ)的菌種置于內(nèi)含有步驟①中所述的液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，36.8-37.2°C下培養(yǎng)14.5-15.5小時(shí)。
[0021]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟⑦中所述的初步培養(yǎng)為將存儲(chǔ)的菌種置于含有卡那霉素的斜面試管中，所述斜面試管中包含有步驟①中所述的固體種子培養(yǎng)基，36.8-37.2°C下培養(yǎng)1-2天。
[0022]作為上述技術(shù)方案的優(yōu)選，步驟⑧中所述生產(chǎn)種子轉(zhuǎn)接培養(yǎng)方法為小規(guī)模培養(yǎng)方法:在三角瓶中裝入步驟①所述的發(fā)酵種子培養(yǎng)基50體積份，將2.4-2.6體積份的生產(chǎn)種子置于其中，在36.8-37.2 °C、搖床轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘條件下，震動(dòng)培養(yǎng)70-74小時(shí);或，步驟⑧中所述生產(chǎn)種子轉(zhuǎn)接培養(yǎng)方法為中規(guī)模培養(yǎng)方法:涉及培養(yǎng)罐容積200-400L，內(nèi)置150-350L物料，培養(yǎng)罐加熱至119-123°C保持28-32分鐘，再冷卻至88-92°C，加入200質(zhì)量份步驟
①中所述的液體種子培養(yǎng)基、175-185質(zhì)量份水，0.037-0.04質(zhì)量份消泡劑，開啟攪拌，再加入1-1.5質(zhì)量份酵母膏、1.8-2.2質(zhì)量份蛋白胨、1.8-2.2質(zhì)量份氯化鈉、0.01-0.03質(zhì)量份泡敵，加熱至119-123°C保持28-32分鐘，再冷卻至36-38°C，放入生產(chǎn)種子，同時(shí)加入含有2克卡那霉素的卡那霉素溶液，攪拌均勻，保持溫度，并控制培養(yǎng)罐內(nèi)表壓為0.05pa，培養(yǎng)14.5-15.5小時(shí);或，步驟⑧中所述生產(chǎn)種子轉(zhuǎn)接培養(yǎng)方法為大規(guī)模培養(yǎng)方法:涉及2-2.5噸重的物料及與其相配適的培養(yǎng)罐，培養(yǎng)罐加熱至119_123°C保持28-32分鐘，再冷卻至88-92°C，加入2000質(zhì)量份步驟①中所述的發(fā)酵種子培養(yǎng)基、1750-1850質(zhì)量份水，0.37-0.42質(zhì)量份消泡劑，開啟攪拌，再加入45-55質(zhì)量份酵母膏、27-33質(zhì)量份蛋白胨、5.5-6.5質(zhì)量份磷酸氫二鉀、1.8-2.2質(zhì)量份檸檬酸鈉、55-65質(zhì)量份淀粉、0.18-0.22質(zhì)量份泡敵，加熱至119-123°C保持28-32分鐘，再冷卻至36-38 V，放入生產(chǎn)種子，攪拌均勻，保持溫度，并控制培養(yǎng)罐內(nèi)表壓為0.05pa，培養(yǎng)70-74小時(shí)。
[0023]菌種保藏方法:
甘油保藏法:1ml塑料離心管中，裝濃度為50%的甘油溶液5ml，121°C，30分鐘滅菌，冷卻至室溫。用無菌吸管吸取培養(yǎng)15小時(shí)的成熟液體種子5ml(或從斜面用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)2-3天的斜面新鮮細(xì)胞)，放入上述滅菌并冷卻后的甘油管中?；旌途鶆?，置-80°C冰箱冷凍保存。有效保存期I年左右。
[0024]液體石蠟保藏法:
⑴無菌液蠟的制備:將液蠟裝入三角瓶。塞上棉塞。121°C，30分鐘滅菌后，放入培養(yǎng)箱，370C靜置培養(yǎng)I天后，再滅菌一次，培養(yǎng)