[0019] 3)反應(yīng)體系的組成簡單。僅包含引物Mix、2X多重PCR預(yù)混液(市售試劑)和去離子 水巧巾試劑，只需按比例將巧巾試劑混合加入待測樣本DNA模板即可。操作簡便快捷，減少污 染發(fā)生的概率；
[0020] 4)快速高效。W待測全血樣本為例，從DNA提?。?0min)、反應(yīng)體系配制（IOmin)、 PCR擴增反應(yīng)(60mir〇到電泳觀察結(jié)果(20min)，整個檢測過程用時僅需2小時。
[0021] 5)可W發(fā)現(xiàn)其他追原蟲感染進行擴展檢測。本檢測體系同時擴增追原蟲的屬和4 種人體常見追原蟲種特異性基因片段，對于只有屬特異性片段擴增的樣本，應(yīng)高度懷疑是 新型的人類追疾諾氏追原蟲感染或其他追原蟲感染，可W通過基因測序方式進行擴展檢 測。
【附圖說明】
[0022] 圖巧本發(fā)明的多重PCR檢測體系中5個目的片段長度和雙條"帶型"圖。
[0023] 圖2為本發(fā)明的多重PCR檢測4種追疾樣本的不同原蟲密度結(jié)果圖。
[0024] 圖3為本發(fā)明的多重PCR檢測模擬混合感染的敏感性圖。
[0025] 圖4為本發(fā)明的多重PCR檢測其他寄生蟲DNA的特異性圖。
[00%]圖5為本發(fā)明的多重PCR檢測追疾病人和正常人血樣圖。
[0027]附圖標(biāo)記
[00巧]M IOObp分子量標(biāo)準
[00巧]N 陰性對照
[0030] Mp 多重PC郎日性參考的標(biāo)準條帶
[0031] N 陰性對照
[0032] Pv 間日追
[0033] 化 S日追
[0034] Po 卵形追
[003引 Pf 惡性追
[0036] I 樣本原液
[0037] 2 1〇-1 倍稀釋
[003引 3 10-2倍稀釋
[0039] 4 1〇-3 倍稀釋
[0040] 5 1〇-4 倍稀釋
[0041 ] 6 1〇-5 倍稀釋
[0042] 3-1A Pv
[0043] 3-2A Pv+化
[0044] 3-3A Pv+化
[0045] 3-4A Pv+Pf
[0046] 3-5A Pm+化+Pf
[0047] 3-6A Pv+Pm+化
[0048] 3-1B Pf
[0049] 3-2B Pf+Pv
[0050] 3-3B Pf+Pm+Pv
[0051 ] 3-4B 押+化
[0052] 3-5B 押+化
[0053] 3-她 Pf+Pv+Pm+化
[0054] 4-1 血吸蟲感染兔血清
[005日]4-2 血吸蟲病人血清
[0化6] 4-3 RH株弓形蟲血清
[0化7] 4-4 CN株弓形蟲血清
[005引 4-5 隱抱子蟲
[0059] 4-6 利什曼原蟲
[0060] 4-7 囊蟲病人血清
[0061 ] 4-8 肺吸蟲病人血清
[0062] 4-9 卵形追原蟲（陽性對照）
[0063] 5-1 ~5-4、11、15 ~17 間日追
[0064] 5-5 ~5-6、7~10 惡性追
[00化]12~14 卵形追
[0066] 18 ~19 S日追
[0067] 20 惡性追和卵形追混合感染
[0068] 21~40 正常人血樣
【具體實施方式】
[0069] 為了能夠更清楚地描述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施例來進行進一步的 描述。
[0070] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員都掌 握的常規(guī)方法，或按照試劑設(shè)備等制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化 學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。
[0071 ]實施例1、追疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR檢測體系和方法
[0072] 1.1嵌合引物的設(shè)計
[0073] 選擇追原蟲的核糖體18S rRNA和線粒體兩個基因為目標(biāo)序列。利用GenBank公共 數(shù)據(jù)庫資源化ttp: //blast. ncbi . nlm. n;Lh. gov/Blast.)和引物設(shè)計軟件Primer Primer 5.0設(shè)計追原蟲屬和種特異性引物共5對(表1)。其中，追原蟲屬特異性引物擴增產(chǎn)物為線粒 體基因保守區(qū)段，人體4種追原蟲種特異性引物分別擴增核糖體18S rRNA特異性區(qū)段。表1 中基因特異性引物分別與一段共同的非特異性核酸片段（通用引物，5 ' -CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3'）連接。使每一條引物的3'端為序列特異性識別位點，5 '端為一 段21bp的無關(guān)序列，形成嵌合引物。
[0074] 表1.擴增片段特異性引物序列
[0075]
[0076] 1.2模板DNA的提取
[0077] 待測樣本可W為血液(包括濾紙血、全血）、唾液或其他體液。DNA的提取采用目前 實驗室常規(guī)的各種DNA提取方法均可?？蒞用經(jīng)典的酪氯仿抽提法或市售DNA提取試劑盒提 取DNA并純化后，得到DNA模板。本實施例中使用的是QiAamp DNA Mini Kit(Qiagen公司產(chǎn) 品）。4種追疾感染病人血樣每份取20化L，參照試劑盒的說明書操作。提取的DNA用2(K)化去 離子水洗脫，使化L DNA相對應(yīng)于化L全血。提取的DNA置于一20°C保存待用。
[0078] 1.3配制反應(yīng)體系
[00巧]反應(yīng)體系（W20化反應(yīng)體積為例）包括:樣本DNA模板化U引物Mix 1.化L、去離子 水化L和2 X多重PCR預(yù)混液10化。引物Mix中10條嵌合特異性引物的反應(yīng)終濃度為0.0 SiiM/ mL，通用引物的反應(yīng)終濃度為0.25iiM/mL。
[0080] 1.4進行多重PCR擴增反應(yīng)
[0081 ]循環(huán)反應(yīng)條件:95°C 預(yù)變性5111111;94°(：153、581：2〇3、721：2〇3，循環(huán)5次;94°(：153、 621：203、721：203，循環(huán)10次；94°(：153、681：203、721：203，循環(huán)25次；721：3111111，10°(：保持。
[0082] 1.5多重PCR擴增產(chǎn)物的鑒定
[0083] 取PCR產(chǎn)物10化進行2 %瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。W IOObp DNA Marker為參照，確定擴增片段的長度。陽性樣本一般顯示為2個條帶，混合感染2條W上。圖1 示4種追原蟲單一感染樣本的擴增結(jié)果。
[0084] 實施例2、追疾種屬同檢的嵌合引物多重PCR檢測體系的敏感性和特異性分析
[00化]2.1原蟲計數(shù)
[0086] 全血樣本涂制厚薄血膜，干燥、甲醇固定后吉姆薩染色，由有經(jīng)驗的鏡檢人員檢查 追原蟲并進行計數(shù)。追原蟲計數(shù)的方法是，計數(shù)200個白細胞W上，密度很低時計數(shù)1000個 白細胞。用下式算出追原蟲密度:追原蟲數(shù)^白細胞數(shù)X每化血中白細胞數(shù)=追原蟲數(shù)/化 血(如果無法進行白細胞計數(shù)，則W8000個白細胞AiL血計算）。
[0087] 2.2多重PCR檢測不同原蟲密度血樣的敏感性
[0088] 選擇血涂片原蟲計數(shù)不同密度的4種追疾感染全血樣本各3份，分別提取DNAWl: 10連續(xù)稀釋，圖2示4種追疾樣本的不同稀釋度多重PCR檢測結(jié)果。用多重PCR檢測不同樣本 的檢出最高稀釋度，計算最低檢出原蟲數(shù)，3份原蟲密度不同樣本的平均值作為體系的檢出 限（表2)。結(jié)果顯示，多重PCR檢測體系對4種追原蟲的種特異性檢出值分別為4.49(Pv)、 5.45(化）、6.39。〇)、4.07。門個原蟲/化，平均值為4.85個原蟲/化。對追原蟲屬的檢出平 均值為0.41 (0.1~1.07)個原蟲AiL，高于種特異性檢出率11.8倍。
[0089] 表2.多重PCR檢測不同原蟲密度血樣的敏感性
[0090]
[0092] 2.3多重PCR檢測模擬混合感染的敏感性
[0093] 將相當(dāng)于鏡檢和RDT檢測的