利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的PCR檢測(cè)通用引物對(duì)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的PCR檢測(cè)通用引物對(duì)，如序列表SeqIDNo.1及SeqIDNo.2所示。首先設(shè)計(jì)并合成檢測(cè)三種致病菌的特異性引物，分別如序列表SeqIDNo.3-SeqIDNo.8所示；再設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物與之相聯(lián)，如序列表SeqIDNo.1及SeqIDNo.2所示，形成嵌合引物，利用嵌合引物和通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)致病菌。該方法簡(jiǎn)單快速、特異性好，為致病菌的檢測(cè)提供了新的方法。
【專利說(shuō)明】利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的PCR檢測(cè)通用引物對(duì)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的PCR檢測(cè)通用引物對(duì)。
【背景技術(shù)】
[0002]目前對(duì)致病菌的檢測(cè)方法主要有國(guó)標(biāo)法、酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、金標(biāo)試紙法、DNA探針技術(shù)、LAMP恒溫?cái)U(kuò)增法，這些方法都有存在不足之處，即檢測(cè)通量不高。多重PCR方法是提高檢測(cè)通量的基本方法。許多高通量技術(shù)，如基因芯片法、高效液相色譜法都基于多重PCR方法。但多重PCR技術(shù)引物設(shè)計(jì)困難，常常出現(xiàn)擴(kuò)增效率不均衡問(wèn)題，造成假陰性結(jié)果。同時(shí)還容易出現(xiàn)引物二聚體，給檢測(cè)帶來(lái)了難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明針對(duì)多重PCR存在的問(wèn)題，采用靶序列富集多重PCR(target，enrichedmultiplex PCR, Tem-PCR)技術(shù),它的原理是針對(duì)待擴(kuò)增的每一種祀序列,設(shè)計(jì)特異性引物，再編制一個(gè)通用引物(SuperPrimer)與之相聯(lián),形成嵌合引物,利用嵌合引物和通用引物(SuperPrimer)進(jìn)行擴(kuò)增。其獨(dú)特之處在于嵌合引物的濃度極低，用在PCR的最初幾個(gè)循環(huán)中富集目標(biāo)序列。只有超級(jí)引物的濃度足以進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，這樣克服多重PCR的擴(kuò)增偏愛(ài)性問(wèn)題，解決了傳統(tǒng)的多重PCR技術(shù)導(dǎo)致的假陰性結(jié)果問(wèn)題。
[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的PCR檢測(cè)通用引物對(duì)，本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn):
[0005]一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的PCR檢測(cè)通用引物對(duì)，如下:
[0006]上引物Super-F:如序列表Seq ID N0.1所示，
[0007]下引物Super-R:如序列表Seq ID N0.2所示。
[0008]本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的PCR檢測(cè)嵌合引物組，由3對(duì)引物對(duì)組成，其中:
[0009]用于檢測(cè)腸出血性大腸桿菌0157:H7引物對(duì)為:
[0010]上引物0157TEM-F:如序列表Seq ID N0.3所示，
[0011]下引物0157TEM-R:如序列表Seq ID N0.4所示；
[0012]用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌引物對(duì)為:
[0013]上引物單增TEM-F:如序列表Seq ID N0.5所示，
[0014]下引物單增TEM-R:如序列表Seq ID N0.6所示；
[0015] 用于檢測(cè)沙門氏菌引物對(duì)為:
[0016]上引物沙門TEM-F:如序列表Seq ID N0.7所示，
[0017]下引物沙門TEM-R:如序列表Seq ID N0.8所示。
[0018]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的方法，包括如下步驟:[0019](I)、PCR模板的制備；
[0020](2)、合成一對(duì)非同源性通用引物，保證這對(duì)引物與細(xì)菌沒(méi)有同源性，
[0021]上引物Super-F:如序列表Seq ID N0.1所示，
[0022]下引物Super-R:如序列表Seq ID N0.2所示；
[0023](3)、利用NCBI網(wǎng)站，選擇致病菌保守區(qū)域基因設(shè)計(jì)并合成3對(duì)嵌合引物對(duì)；
[0024]確定腸出血性大腸桿菌0157:H7的靶基因?yàn)閞fbE，設(shè)計(jì)引物對(duì):
[0025]上引物0157TEM-F:如序列表Seq ID N0.3所示，
[0026]下引物0157TEM-R:如序列表Seq ID N0.4所示；
[0027]單核細(xì)胞增生李斯特菌的靶基因?yàn)閔ly，設(shè)計(jì)引物對(duì):
[0028]上引物單增TEM-F如序列表Seq ID N0.5所示，
[0029]下引物單增TEM-R:如序列表Seq ID N0.6所示；
[0030]沙門氏菌的靶基因?yàn)閕nvA，設(shè)計(jì)引物對(duì):
[0031]上引物沙門TEM-F:如序列表Seq ID N0.7所示，
[0032]下引物沙門TEM-R:如序列表Seq ID N0.8所示；
[0033](4)、Tem-PCR檢測(cè)多種致病菌的PCR條件的優(yōu)化。
[0034]本發(fā)明還具有如下特征:
[0035]如上所述一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的方法，其中步驟(3)所述
Tem-PCR檢測(cè)多種致病菌的PCR條件的優(yōu)化結(jié)果如下:
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的PCR檢測(cè)通用引物對(duì)，其特征在于， 上引物Super-F:如序列表Seq ID N0.1所示， 下引物Super-R:如序列表Seq ID N0.2所示。
2.一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的PCR檢測(cè)嵌合引物組，其特征在于，由3對(duì)引物對(duì)組成，其中: 用于檢測(cè)腸出血性大腸桿菌0157:H7引物對(duì)為: 上引物0157TEM-F:如序列表Seq ID N0.3所示， 下引物0157TEM-R:如序列表Seq ID N0.4所示； 用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌引物對(duì)為: 上引物單增TEM-F:如序列表Seq ID N0.5所示， 下引物單增TEM-R:如序列表Seq ID N0.6所示； 用于檢測(cè)沙門氏菌引物對(duì)為: 上引物沙門TEM-F:如序列表Seq ID N0.7所示， 下引物沙門TEM-R:如序列表Seq ID N0.8所示。
3.一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)、PCR模板的制備； (2)、合成一對(duì)非同源性通用引物，保證這對(duì)引物與細(xì)菌沒(méi)有同源性， 上引物Super-F:如序列表Seq ID N0.1所示， 下引物Super-R:如序列表Seq ID N0.2所示； (3)、利用NCBI網(wǎng)站，選擇致病菌保守區(qū)域基因設(shè)計(jì)并合成3對(duì)嵌合引物對(duì)； 確定腸出血性大腸桿菌0157:H7的靶基因?yàn)閞fbE，設(shè)計(jì)引物對(duì): 上引物0157TEM-F:如序列表Seq ID N0.3所示， 下引物0157TEM-R:如序列表Seq ID N0.4所示； 確定單核細(xì)胞增生李斯特菌的靶基因?yàn)閔ly，設(shè)計(jì)引物對(duì): 上引物單增TEM-F如序列表Seq ID N0.5所示， 下引物單增TEM-R:如序列表Seq ID N0.6所示； 確定沙門氏菌的靶基因?yàn)閕nvA，設(shè)計(jì)引物對(duì): 上引物沙門TEM-F:如序列表Seq ID N0.7所示， 下引物沙門TEM-R:如序列表Seq ID N0.8所示； (4)、Tem-PCR檢測(cè)多種致病菌的PCR條件的優(yōu)化。
4.如權(quán)利要求3所述一種利用Tem-PCR技術(shù)檢測(cè)多種致病菌的方法，其特征在于，步驟(3)所述Tem-PCR檢測(cè)多種致病菌的PCR條件的優(yōu)化結(jié)果如下:
【文檔編號(hào)】C12R1/42GK103981278SQ201410249870
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】劉忠梅, 徐義剛, 李淑云, 李蘇龍, 曲敏, 莫春生 申請(qǐng)人:黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心