失活FCS和lOOng/ml瘦素的RPMI 中維持Ba/F3-mLR和Ba/F3-mLR-TNFRl A 細(xì)胞。
[0063] 測(cè)定
[0064] 憐酸STATl測(cè)定。
[0065] 從分離自巧7B1/6小鼠的脾制備單細(xì)胞混懸液。使用紅血細(xì)胞裂解緩沖液化onza) 消減紅細(xì)胞。在37 °C下用含小鼠 IFNa/的財(cái)CLl-IFNa2-Q124R融合蛋白的5 %胎牛血清RPMI 處理脾細(xì)胞30分鐘，接著根據(jù)BD Biosciences說明書，用抓曲OSflow PE小鼠抗STATl (pY701)W及Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗小鼠 CDllc(eBioscience#53-0114-80)和APC標(biāo)記 的抗小鼠 CD8a(BD Bioscience#553035)或抗小鼠 CDllc和Alexa 488-標(biāo)記的抗小鼠 CDSa標(biāo) 記。使用抓FACS Canto獲得FACS數(shù)據(jù)，并且使用任一Diva(BD Biosciences)軟件加 W分 析。
[0066] NF-KB報(bào)告基因測(cè)定。
[0067] 為評(píng)估IL-IR活化，我們使用穩(wěn)定表達(dá)IL-IR的HEK-Blue?化-10細(xì)胞 (Invivogen)，并且用NF-KB巧光素酶報(bào)告基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染它們。簡言之，將肥K-Blue? IL-10 細(xì)胞于培養(yǎng)基(DMEM/10%FCS)中接種于96孔板中（10000個(gè)細(xì)胞/孔），并且次日使用憐酸巧 沉淀方法，W指示量的表達(dá)質(zhì)粒和5ng/孔的化B-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒（Vanden Berghe等， 1998)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用饑餓培養(yǎng)基(DMEM)替換培養(yǎng)基，并且轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用 IL1-(XL20融合蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞6小時(shí)。在誘導(dǎo)之后，使細(xì)胞裂解，并且使用Promega巧火蟲巧 光素酶測(cè)定系統(tǒng)（Promega Firefly Luciferase Assay System)在Be;rthold centre LB960光度計(jì)上測(cè)定裂解產(chǎn)物中的巧光素酶活性。
[0068] 細(xì)胞增殖測(cè)定。
[00例通過用pMet7-mLR載體電穿孔Ba/F3細(xì)胞來產(chǎn)生Ba/F3-mLR細(xì)胞系。通過使它們?cè)?瘦素而非IL-3的情況下生長來選擇穩(wěn)定表達(dá)性細(xì)胞。實(shí)際上，Ba/F3細(xì)胞的生長依賴于IL-3,但當(dāng)它們表達(dá)mLR時(shí)，它們也在瘦素的情況下增殖。為獲得Ba/F3-mLR-TNFRl A切t細(xì)胞 系，用pMet7-HA-hTNFRl A 切t和plRESpuro2(Clontech)共同轉(zhuǎn)染Ba/F3-mLR細(xì)胞，隨后進(jìn)行 嚷嶺霉素選擇W及FACS分選表達(dá)hTNFRl A〔八的細(xì)胞。
[0070] 為評(píng)估細(xì)胞增殖，將Ba/F3-mLR和Ba/F3-mLR-TNFRl A切t細(xì)胞洗涂，于RPMI/10% iFCS中接種于96孔板中（10.000個(gè)細(xì)胞/孔），并且用指示量的瘦素或融合蛋白刺激。4天后， 添加 SOiil XTTUTT細(xì)胞增殖試劑盒II，Roche，11465015001 )，并且解育4小時(shí)，隨后在450nm 下測(cè)量吸光度。
[0071] 實(shí)施例1 :X化l/IFNa2-Q124R融合蛋白對(duì)表達(dá)XCRl的細(xì)胞的IF腳舌性被恢復(fù)。
[0072] 用InM X化l-IFNa2-Q124R或用10000個(gè)單位/ml的小鼠 IF化/0處理小鼠脾細(xì)胞30 分鐘。細(xì)胞接著被固定，經(jīng)滲透化處理，并且用抗憐酸STATl (PE)、抗CDl Ic (Alexa Fluor 488)和抗CDSa (APC)染色并通過FACS加 W分析。圖2顯示小鼠 IFNa/0在所有分析的脾細(xì)胞子 組中都誘導(dǎo)STATl憐酸化。相反，X化l-IFNa2-Q124R融合蛋白僅在大多數(shù)屬于CDllc+CD8a吁 組的細(xì)胞中W及在少數(shù)屬于CDllc乂DScT子組的細(xì)胞中誘導(dǎo)IFN應(yīng)答。對(duì)XCLl-IFNa2-Q124R 融合蛋白起應(yīng)答的脾細(xì)胞子組的分布完全匹配于XCLl受體XCRl的預(yù)期分布（Dorner等 2009) O
[0073] 實(shí)施例2: ILie對(duì)表達(dá)CCR6的細(xì)胞的活性被恢復(fù)
[0074] 用NF-KB報(bào)告基因質(zhì)粒(5ng/孔)和空載體或hCCR6表達(dá)質(zhì)粒（IOng/孔)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn) 定表達(dá)化-IR的皿K-Blue?化-10細(xì)胞。接著用野生型或突變IL10-(XL2O融合蛋白（25ng/ ml)處理模擬和CCR6轉(zhuǎn)染細(xì)胞6小時(shí)，此后使細(xì)胞裂解，并且測(cè)定NF-KB報(bào)告基因活性。如從 圖4A顯而易見，表達(dá)CCR6的細(xì)胞相較于模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞W增加的NF-KB報(bào)告基因活性對(duì)所有 探究的突變ILie-(XL20融合蛋白起應(yīng)答。為評(píng)估祀向作用最明顯的a-ie-Q148G突變體的 作用，更詳細(xì)來說，用遞增劑量的WT化-10或化-10Q148G-C化20融合蛋白處理模擬轉(zhuǎn)染或 表達(dá)CCR6的肥K-Blue?比-1齡田胞6小時(shí)。圖4B證明過度表達(dá)CCR6使WT比-10-0X20融合物 的活性增加，但對(duì)化-leQHSG-C化20融合物具有更強(qiáng)烈的增強(qiáng)作用。當(dāng)ILl-e-(XL20在 12.5ng/ml下應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)，祀向作用最突出（圖4C)。
[0075] 實(shí)施例3:瘦素對(duì)表達(dá)TNFR的細(xì)胞的活性被恢復(fù)
[0076] 評(píng)估在用指示量的瘦素或瘦素-scTNF融合蛋白刺激4天之后，Ba/F3-mLR和Ba/F3-mLR-TNFRl A切t細(xì)胞的增殖。如圖6A中所示，兩種細(xì)胞系均不在僅補(bǔ)充有熱失活血清的生 長培養(yǎng)基中增殖。此外，當(dāng)瘦素偶聯(lián)于SCTN即寸，它誘導(dǎo)Ba/F3增殖的能力降低。使WT瘦素內(nèi) 的L86突變成絲氨酸化86S)或天冬酷胺化86N)分別導(dǎo)致對(duì)小鼠瘦素受體的親和力中度或強(qiáng) 烈降低。對(duì)于瘦素 L86S相對(duì)于L86N，運(yùn)種親和力降低分別轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)Ba/F3-mLR細(xì)胞的增殖 的強(qiáng)力性減小3倍相對(duì)于10倍。用缺乏它的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的人TNF-Rl化TNFRl A切t)額外轉(zhuǎn) 染Ba/F3-mLR細(xì)胞會(huì)引入非功能性受體，其可充當(dāng)膜結(jié)合的細(xì)胞外標(biāo)志物。明顯的是，在用 偶聯(lián)于scTNF的L86S和L86N瘦素突變體刺激后，在表達(dá)hTNFRl A切t的Ba/F3-mLR細(xì)胞中，增 殖應(yīng)答被完全恢復(fù)（圖6B)。
[0077] 實(shí)施例4:體內(nèi)祀向表達(dá)XCRl的細(xì)胞群體
[007引 根據(jù)Bachem等化rontiers in Immunology 3,1-12.2012)，表達(dá)XCRl的細(xì)胞代表 大部分CDllc+CD8a+脾細(xì)胞群體和小部分CDllc+CD8a-脾細(xì)胞群體。用指示量的X化I-IFNa 2-Q124R，或用1000000個(gè)單位的天然鼠類IF化/0或PBS靜脈內(nèi)注射巧7B1/6小鼠。在45分鐘 之后，通過FACS，針對(duì)W下細(xì)胞群體中的P-STAT1來分析脾細(xì)胞：CD 11 C-CDSa-、CD 11 C-CDSa +、〔011。+〔080+、〔011。+〔080-。結(jié)果顯示于圖7中。根據(jù)運(yùn)些結(jié)果，明顯的是融合構(gòu)建體可 在群體的小部分(總細(xì)胞的約0.1%)中進(jìn)行祀向并誘導(dǎo)應(yīng)答，而不表達(dá)標(biāo)志物的IFN敏感性 細(xì)胞不受影響。實(shí)際上，野生型IFN也影響CDl lc+CD8a-細(xì)胞，而那些細(xì)胞不受融合構(gòu)建體影 響，從而明確證明融合物的特異性作用。
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