明的方法中，優(yōu)選生物忍片陣列技術(shù)系統(tǒng)(BAT)(可 獲自Randox Laboratories Limi ted)。更優(yōu)選地，可使用Evidence Evolution and Evidence Investigator儀器（可獲自Randox Laboratories)來測(cè)定樣品中生物標(biāo)志物的 水平。
[0070] 在本發(fā)明相關(guān)的第S方面中，本發(fā)明第二方面所述的包含VCAM-I、GFAP和CRP的探 針的基底被用于本發(fā)明第一方面所述的用于協(xié)助鑒別診斷患者的出血性中風(fēng)、缺血性中風(fēng) 和短暫性腦缺血發(fā)作的方法中。
[0071] 根據(jù)第四方面，本發(fā)明設(shè)及VCAM-1、GFAP、CRP、IL-6和/或sTNFRl作為出血性中風(fēng) 的生物標(biāo)志物和/或作為出血性中風(fēng)、缺血性中風(fēng)和短暫性腦缺血發(fā)作的區(qū)分指標(biāo)的用途。
[0072] 本發(fā)明也提供試劑盒，其包含VCAM-I、GFAP和CRP的探針，W及任選地IL-6和/或 sTNFRl的探針，另外的試劑，基底/反應(yīng)表面和/或使用說明書。運(yùn)樣的試劑盒可被用來根據(jù) 本發(fā)明第一方面鑒別診斷患者的中風(fēng)子類型。
[0073] 本發(fā)明將參考W下非限制性實(shí)施例進(jìn)一步描述。 實(shí)施例
[0074] 患者組
[0075] 該研究由被希臘雅典的KAT總醫(yī)院急診室收治的98例顯示中風(fēng)癥狀的患者組成。 在收治時(shí)W及在第1、第2、第3和第7天抽取血液樣品。中風(fēng)癥狀的發(fā)作到醫(yī)院收治之間的平 均時(shí)間是3.2小時(shí)?；颊叩钠骄挲g是75.2歲(標(biāo)準(zhǔn)誤差9.4)。臨床評(píng)估(使用背景部分強(qiáng)調(diào) 的標(biāo)準(zhǔn))和神經(jīng)成像技術(shù)鑒定44例缺血性中風(fēng)(IS )、25例出血性中風(fēng)化S )，29例短暫性腦缺 血發(fā)作(TIA) ;60位健康個(gè)體作為對(duì)照(C)。
[0076] 樣品分析
[0077] 檢驗(yàn)獲自本研究組患者的血液的抓TA血漿樣品中的W下蛋白：VCAM-I、GFAP、CRP、 IL-6和sTNFRl。使用并入生物標(biāo)志物特異性抗體的多路生物忍片和Evidence Investigator(Randc)X Laboratories Ltd,Crumlin，UK)檢測(cè)和定量所述蛋白。根據(jù)開發(fā)商 的說明書進(jìn)行同時(shí)的免疫分析。分析每種生物標(biāo)志物的9點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線和=種參考對(duì)照W允 許結(jié)果的校驗(yàn)。對(duì)于CRP IS與TIA比較的分析，將樣品稀釋十倍。
[0078] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0079] 將單個(gè)生物標(biāo)志物應(yīng)用于ROC曲線分析W評(píng)估敏感性和特異性。使用邏輯回歸來 模擬中風(fēng)和中風(fēng)子類型與多種生物標(biāo)志物組合的濃度的從屬性，隨后通過ROC曲線分析來 評(píng)估模擬的分類準(zhǔn)確性。結(jié)果如圖1 -3所示。
[0080] 性別與用于確定中風(fēng)子類型的每一種生物標(biāo)志物的相關(guān)性如圖4-8所示。
[0081 ] 結(jié)果
[0082] 表3所示的數(shù)據(jù)顯示使用本發(fā)明的生物標(biāo)志物區(qū)分HS與IS/TIA。使用本發(fā)明的生 物標(biāo)志物區(qū)分服與IS和TIA患者的ROC曲線分析如圖3所示。
[0083] 表 3
[0084]
[0085] 此外，圖1-3和表4示例了使用生物標(biāo)志物的組合將所有中風(fēng)患者歸類為TIA、IS或 HS患者，在使用多項(xiàng)式邏輯回歸的該實(shí)例中，得出超過任何單獨(dú)生物標(biāo)志物的改善區(qū)分。
[0086]
N ?s：
[0087]此外，設(shè)計(jì)歸類算法的可選方法，如使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（參見圖9和表5)顯示相似 的性能特點(diǎn)。
[0088] 表 5
[0089] 曲線下的面積
[0090]
[0091] a.非參數(shù)假設(shè)下
[0092] b.零假設(shè):真實(shí)面積= 0.5
[0093] 該表進(jìn)一步示例了在通過本領(lǐng)域已知的任何方法導(dǎo)出的算法中組合目標(biāo)生物標(biāo) 志物的魯棒性。
[0094] 縮寫
[009引 GFAP-膠質(zhì)纖維酸性蛋白
[0096] 比-6-白細(xì)胞介素-6
[0097] ICAM-I-細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1
[0098] VCAM-I-血管細(xì)胞粘附分子-1
[0099] CRP-C-反應(yīng)蛋白
[0100] FABP-脂肪酸結(jié)合蛋白
[0101] sTNFRl-可溶的 TNFa 受體 1
[0102] k選擇蛋白-淋己細(xì)胞細(xì)胞粘附分子(CD62L)
[0103] P-選擇蛋白-血小板細(xì)胞粘附分子
[0104] D-二聚體-纖維蛋白降解產(chǎn)物
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 協(xié)助鑒別診斷已患有或正患有中風(fēng)的患者的出血性中風(fēng)、缺血性中風(fēng)和短暫性腦缺 血發(fā)作的方法，其包括： i)測(cè)定獲自所述患者的離體樣品中生物標(biāo)志物VCAM-1、GFAP和CRP的濃度；以及 i i)建立所述生物標(biāo)志物的濃度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其還包括： i i i)測(cè)定獲自所述患者的離體樣品中生物標(biāo)志物IL-6和sTNFRl的濃度； iv) 確定所述患者的性別；以及 v) 與所述患者的性別結(jié)合，建立五種生物標(biāo)志物的濃度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中將每種生物標(biāo)志物的濃度值輸入統(tǒng)計(jì)學(xué)算法以產(chǎn) 生輸出值，所述輸出值與出血性中風(fēng)、缺血性中風(fēng)或短暫性腦缺血發(fā)作的鑒別診斷相關(guān)。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述方法被用來鑒別診斷出血性中風(fēng)和缺血性中風(fēng)/ 短暫性腦缺血發(fā)作。5. 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述統(tǒng)計(jì)學(xué)算法包括邏輯回歸方程。6. 如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者被診斷為正患有或已患有中 風(fēng)。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述患者通過以下步驟被診斷為已患有或正患有中 風(fēng):測(cè)定獲自所述患者的離體樣品中至少兩種生物標(biāo)志物的濃度，并且通過將每種生物標(biāo) 志物的濃度值與相應(yīng)的對(duì)照值比較，建立所述生物標(biāo)志物的濃度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中所述 至少兩種生物標(biāo)志物選自ICAM-1、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、VCAM-l、IL-6、sTNFRl、D-二聚 體和CRP，并且其中兩種生物標(biāo)志物中至少一種選自ICAM-1、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白和 VCAM-1，其中將患者和對(duì)照的每種生物標(biāo)志物濃度值輸入統(tǒng)計(jì)學(xué)算法以產(chǎn)生輸出值，所述 輸出值指示是否已發(fā)生中風(fēng)。8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品為血液、血清或血漿樣品。9. 基底，其包含VCAM-1、GFAP和CRP的探針，用于權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的協(xié)助鑒別 診斷患者的出血性中風(fēng)、缺血性中風(fēng)和短暫性腦缺血發(fā)作的方法。10. 如權(quán)利要求9所述的基底，其還包含IL-6和sTNFRl的探針。11. 如權(quán)利要求9或10所述的基底，其中所述基底具有固定在其上的探針。12. 如權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng)所述的基底，其中所述基底為生物芯片。13. 包含VCAM-1、GFAP和CRP的探針的基底在權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的協(xié)助鑒別診 斷患者的出血性中風(fēng)、缺血性中風(fēng)和短暫性腦缺血發(fā)作的方法中的用途。14. 如權(quán)利要求13所述的基底的用途，其中所述基底還包含IL-6和sTNFRl的探針。 15. VCAM-l、GFAP、CRP、IL-6和/或sTNFRl作為出血性中風(fēng)的生物標(biāo)志物和/或作為出血 性中風(fēng)、缺血性中風(fēng)和短暫性腦缺血發(fā)作的區(qū)分指標(biāo)的用途。
【專利摘要】本發(fā)明提供協(xié)助鑒別診斷已患有或正患有中風(fēng)的患者的出血性中風(fēng)、缺血性中風(fēng)和短暫性腦缺血發(fā)作的方法。所述方法包括：(i)測(cè)定獲自患者的離體樣品中生物標(biāo)志物VCAM-1、GFAP和CRP的濃度；以及(ii)建立所述生物標(biāo)志物的濃度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。任選地，所述方法還包括以下步驟：(iii)測(cè)定獲自患者的離體樣品中生物標(biāo)志物IL-6和sTNFR1的濃度；(iv)確定所述患者的性別；以及(v)與所述患者的性別結(jié)合，建立五種生物標(biāo)志物的濃度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本發(fā)明也提供基底，其包含VCAM-1、GFAP和CRP的探針，用于協(xié)助鑒別診斷中風(fēng)的方法。
【IPC分類】C12Q1/68, G01N33/68
【公開號(hào)】CN105705652
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480031824
【發(fā)明人】伊凡·麥康內(nèi)爾, 約翰·拉蒙特, 彼得·菲茨杰拉德, 康斯坦提諾斯·馬克里斯
【申請(qǐng)人】蘭道克斯實(shí)驗(yàn)有限公司
【公開日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2014年6月4日
【公告號(hào)】CA2913524A1, EP3004382A1, US20160139147, WO2014195698A1