一種l-脯氨酸-4-羥基化酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及具有k脯氨酸-4-居基化酶 活性的蛋白、編碼該蛋白的基因和包含該酶或其編碼基因的基因工程菌W及它們?cè)谏a(chǎn)反 式-4-居基-k脯氨酸中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 反式-4-居基-k脯氨酸（Trans-4-Hy化O巧-kproline, 4HP)是一種具有獨(dú)特生 理活性的氨基酸，易溶于水。醫(yī)藥方面，4HP作為原料可用于合成碳青霉帰類(lèi)抗生素、消炎 藥、抗腫瘤、降壓藥及新型胃藥等?；瘖y品方面，由于4HP具有抗氧化和抗福射等作用，許多 高級(jí)化妝品中都添加4HP W期延緩衰老。動(dòng)物飼料方面，添加4HP可防止?fàn)I養(yǎng)不良現(xiàn)象。 4HP還可W應(yīng)用于香味料及抗氧化、防腐和保鮮劑等。
[0003] 反式-4-居基-k脯氨酸可W通過(guò)k脯氨酸-4-居基化酶催化k脯氨 酸居基化來(lái)生產(chǎn)，目前用于生產(chǎn)心脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌巧.coli)等，但是送些菌都沒(méi)有編碼k脯氨 酸-4-居基化酶的基因。因此，挖掘能夠在k脯氨酸生產(chǎn)菌中表達(dá)并具有高效催化活性的 k脯氨酸-4-居基化酶是實(shí)現(xiàn)反式-4-居基-k脯氨酸工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵。 「00041
[0005] k脯氨酸-4-居基化酶的催化反應(yīng)
[0006] 日本協(xié)和發(fā)酵公司通過(guò)篩選得到一株脯氨酸4-居基化酶酶活最高的指抱囊 菌，并命名為指抱囊菌RH1，測(cè)序獲得脯氨酸4-居基化酶基因序列（CN96190335);將指 抱囊菌RHl脯氨酸4-居基化酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后置于一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控下，導(dǎo) 入到大腸桿菌中，添加外源k脯氨酸，在發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)化10化后，反式-4-居基-心脯 氨酸的積累量達(dá)到41g/l，轉(zhuǎn)化效率只有87 % (Shibasaki，Takeshi, Hideo Mori, and Akio Oz曰ki. "Enzym曰tic production of tr曰ns-4-hydroxy-L-proline by regio-曰nd stereospecific hydroxyl曰tion of L-proline. "Bioscience, biotechnology,曰nd biochemistry 64. 4(2000) :746-750)。為了進(jìn)一步降低反式-4-居基-k脯氨酸的生產(chǎn) 成本，日本協(xié)和發(fā)酵公司又將密碼子改造的指抱囊菌RHl脯氨酸4-居基化酶基因?qū)氲?k脯氨酸生產(chǎn)菌中，在W葡萄糖為底物的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)9化后反式-4-居基-k脯 氨酸產(chǎn)量達(dá)到25g/l，發(fā)酵過(guò)程k脯氨酸最高積累量達(dá)到7. 8g/l，初步實(shí)現(xiàn)了居脯氨 酸的從頭合成（CN97117929. 8 和 Shibasaki,Takeshi 等，"Construction of a novel hydroxyproline-producing recombinant<i〉Escherichia coli</i〉by introducing 曰 proline 4-hydroxyl曰se gene. "Journ曰I of bioscience 曰nd bioengineering 90. 5(2000):522-525)〇
[0007] 然而，目前報(bào)道的具有工業(yè)應(yīng)用前景的k脯氨酸-4-居基化酶只有來(lái)源于指抱囊 菌RHl的脯氨酸4-居基化酶。指抱囊菌屬于放線菌，是一種高GC含量的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌， 指抱囊菌RHl脯氨酸4-居基化酶基因的GC含量為74 %，并且含有大腸桿菌稀有密碼子。因 此，指抱囊菌的野生型k脯氨酸-4-居基化酶在原核生物，例如大腸桿菌中重組表達(dá)時(shí)主 要W沒(méi)有活性或活性很低的包涵體形式存在，經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化后的突變型k脯氨酸-4-居 基化酶在表達(dá)量和催化性能上依然較差。
[0008] 因此，本領(lǐng)域急需能夠在反式-4-居基-k脯氨酸生產(chǎn)菌株中高效表達(dá)且具有 高催化性能的新型k脯氨酸-4-居基化酶，從而有助于提升從葡萄糖生產(chǎn)反式-4-居 基-心脯氨酸的水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型k脯氨酸-4-居基化酶，該新型k脯氨酸-4-居 基化酶能夠在反式-4-居基-k脯氨酸生產(chǎn)菌株中高效表達(dá)且具有高催化性能。
[0010] 在第一方面，本發(fā)明提供一種用于催化k脯氨酸產(chǎn)生反式-4-居基-k脯氨酸的 k脯氨酸-4-居基化酶，所述k脯氨酸-4-居基化酶為W下蛋白：
[0011] (a)氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白；或
[001引 化）由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而形成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。
[001引在具體的實(shí)施方式中，化）所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列經(jīng) 過(guò)1-50個(gè)，更優(yōu)選1-30個(gè)，還要優(yōu)選1-10個(gè)，最優(yōu)選1-6個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添 加而形成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。
[0014] 在具體的實(shí)施方式中，化）所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列經(jīng) 過(guò)1-50個(gè)，更優(yōu)選1-30個(gè)，還要優(yōu)選1-10個(gè)，最優(yōu)選1-6個(gè)氨基酸殘基的缺失或添加而形 成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。
[001引在具體的實(shí)施方式中，化）所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的 C末端和/或N末端添加或缺失1-50個(gè)，更優(yōu)選1-30個(gè)，還要優(yōu)選1-10個(gè)，最優(yōu)選1-6個(gè) 氨基酸殘基而形成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。
[0016] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于催化心脯氨酸產(chǎn)生反式-4-居 基-k脯氨酸的k脯氨酸-4-居基化酶，所述k脯氨酸-4-居基化酶為氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白。
[0017] 在具體的實(shí)施方式中，所述蛋白在谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutami 州m)、大腸桿菌化coli)、黃色短桿菌度revibacterium fIavum)、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽抱桿菌度acillus subtilis)中表達(dá)。
[0018] 在具體的實(shí)施方式中，所述蛋白在大腸桿菌巧.coli)中表達(dá)。
[0019] 在第二方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明第一方面 所述蛋白的核巧酸序列。
[0020] 在具體的實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體包含SEQ ID N0:2所示核巧酸序列。
[0021] 在第H方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本發(fā)明第二方面所述 的表達(dá)載體，或基因組上整合有編碼本發(fā)明第一方面所述蛋白的核巧酸序列，或基因組上 整合有SEQ ID NO:2所示核巧酸序列。
[0022] 在具體的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞是谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glu tami州m)、大腸桿菌化coli)、黃色短桿菌度revibacterium flavum)、粘質(zhì)沙雷氏 菌（Serratia marcescens)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽抱桿菌 (Bacillus subtilis)。
[0023] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌巧.coli)。
[0024] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞中不受心脯氨酸反饋抑制或心脯 氨酸反饋抑制減弱的谷氨酸激酶（Glutamate-5-kinase)和谷氨酸半醒脫氨酶 (Glutamate-semialdehyde dehy化Ogenase)的活性增強(qiáng)。
[0025] 在第四方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的蛋白或本發(fā)明第二方面所述的 表達(dá)載體或本發(fā)明第H方面所述宿主細(xì)胞的用途，用于催化k脯氨酸產(chǎn)生反式-4-居 基-k脯氨酸及其衍生物。
[0026] 在第五方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物的方法，所 述方法包括W下步驟：
[0027] 1)利用本發(fā)明第H方面所述的宿主細(xì)胞或本發(fā)明第一方面所述的蛋白進(jìn)行發(fā)酵 或轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物；和
[0028] 2)從1)的體系中獲得反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物。
[0029] 在具體的實(shí)施方式中，所述生產(chǎn)反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物的方法是W k脯氨酸為前體生產(chǎn)反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物。
[0030] 在具體的實(shí)施方式中，所述生產(chǎn)反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物的方法是W 葡萄糖或淀粉等糖類(lèi)水解的葡萄糖為前體生產(chǎn)反式-4-居基-k脯氨酸及其衍生物。
[0031] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 圖1顯示了本發(fā)明克隆的基因在大腸桿菌中表達(dá)后的蛋白電泳圖；其中，1為大腸 桿菌化21 (pET21a)無(wú)目的蛋白表達(dá)的對(duì)照，2為大腸桿菌化21 (pSWl)表達(dá)目的蛋白。
[003引 圖2顯示了本發(fā)明的pSW2和pSW3質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)了一種新型心脯氨酸-4-居基化 酶及其編碼基因，該基因的GC%含量適中，可W在基因工程菌中可溶性表達(dá)并維持高催化 活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0035] k脯氨酸-4-居基化酶
[0036] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"k脯氨酸-4-居基化酶"或"本發(fā)明的k脯氨酸-4-居基化酶" 或"本發(fā)明的酶"具有相同的意義，在本文可W互換使用，均是指具有催化k脯氨酸產(chǎn)生反 式-4-居基-k脯氨酸活性的蛋白。在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的k脯氨酸-4-居基化 酶表示氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白質(zhì)，其編碼序列如SEQ ID NO:2所示。
[0037] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)（如果是天然的物 質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核巧酸和多膚是沒(méi)有分離 純化的，但同樣的多聚核巧酸或多膚如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離 純化的。因此，本文所用