2WQR;
[0090] 人類IgGl序列來自GenBank J00228.1;殘基編號來自PDB 10Q0;螺旋化）和折疊 (S)分配來自PDB IOQO;
[0091] 人類IgM序列來自GenBank X14940.1;殘基編號從CMl域開始依序;人類IgM序列中 的報告變化在GenBank CAB37838.1XAC20458.1、AFM37312.1、X57331.1和J00260.1 的IgM 序列下方指出
[0092] 圖5示出實施例1中制備的異二聚體的結構。
[0093] 圖6示出野生型和工程改造 IgM化對2a和2b的非還原SDS-PAGE凝膠。
[0094] 泳道1:野生型IUx:化。
[00巧]泳道2:Rtx2a:Fc2b的混合物，其中Rtx2a主要由與具有〔2915、1350￥^3546和 I397E突變和尾部段缺失的人類y鏈的CMl至CM4融合的嵌合Rituxan(抗CD20)化區(qū)的y鏈組 成；并且化化是人類y鏈CH2至CH4并且具有〔2915、1^3525、了3541(、冊95￥和13971(突變和尾部 段缺失。
[0096] 泳道3: IUx2b:化2a的混合物，其中IUx2b主要由與具有C291S、L352S、T354K、冊95V 和I397K突變和尾部段缺失的人類y鏈的CMl至CM4融合的嵌合Ri化xan(抗CD20)Vh區(qū)的y鏈 組成；并且化2a由具有C291S、T350Y、T354E和I397E突變和尾部段缺失的人類y鏈CH2至CH4 組成。箭頭指示異二聚體。
[0097] 圖7示出野生型和工程改造 IgM Fc對Ia和化的還原SDS-PAGE凝膠，其中名稱與圖6 中相同。
[009引圖8示出野生型和工程改造 IgM化對的非還原SDS-PAGE凝膠：
[0099] 泳道1:野生型Okt: Fc D〇kt，主要由與人類y鏈的CM2至CM4融合的0KT3 (抗CD3抗體） scFv組成。
[0100] 泳道2:0kt2a:Fc2b的混合物，其中0kt2a主要由與具有C291S、T350Y、T354E和 I397E突變和尾部段缺失的人類y鏈的CM2至CM4融合的0KT3(抗CD3抗體)SCFv組成；
[0101] 泳道3: 0kt2b:化2a的混合物，其中Okt 2b主要由與具有C291S、L352S、T354K、冊95V 和I397K突變和尾部段缺失的人類y鏈的CM2至CM4融合的0KT3(抗CD3抗體）SCFv組成。箭頭 指示異二聚體。
[0102] 泳道4-6:野生型Okt: Rtx組合；工程改造0kt2a: IUx2b組合；和0kt2b: 組合， 其中化主要由與具有C291S、T350Y、T354E和I397E突變和尾部段缺失的人類y鏈的CMl至 CM4融合的嵌合Rituxan(抗CD20)Vh區(qū)的y鏈組成，并且Rtx2b主要由與具有C291S、L352S、 T354K、H395V和I397K突變和尾部段缺失的人類y鏈的CMl至CM4融合的嵌合Rituxan(抗 CD20)化區(qū)的y鏈組成。箭頭指示異二聚體。
[0103] 圖9示出與圖8中所示相同的構建體的293F細胞轉染子的SDS-PAGE凝膠上的還原 樣本。
[0104] 圖10說明化3區(qū)中的四個鹽橋如何穩(wěn)定本發(fā)明多特異性結合分子中二硫橋鍵周圍 的兩個鄰近(A.B)ii鏈。
[0105] 表A列舉鈕-孔位置中和用于潛在的電荷引入的人類IgM CM4域界面殘基。
[0106] 表B列舉用于潛在的電荷交換的人類IgM CM4域界面殘基。
[0107] 表C列舉用于潛在的電荷引入的人類IgM CM2域界面殘基。
[0108] 表D列舉用鈕-孔位置中的人類IgM CM2域界面殘基。
[0109] 表E列舉用于潛在的電荷交換的人類IgM CM2域界面殘基。
[0110] 表F列舉用于電荷交換的人類IgM CM2、CM3和CM4域界面殘基。
[011。 發(fā)明詳述
[0112] I.定義
[0113] 術^亢體"包括單克隆抗體(包括具有免疫球蛋白Fc區(qū)的全長抗體）、單鏈分子， W及抗體片段(例如，Fab、F(ab'）2和Fv)。術語"免疫球蛋白"（Ig)在本文可與"抗體"互換使 用?；镜?鏈抗體單元是主要由兩條相同的輕化)鏈和兩條相同的重化)鏈組成的異四聚 糖蛋白。
[0114] 就IgG而言，4鏈單元一般為約150，000道爾頓。各L鏈通過一個共價二硫鍵連接至H 鏈，同時兩條H鏈取決于H鏈同種型通過一個或多個二硫鍵彼此連接。各H鏈和L鏈還具有規(guī) 律間隔的鏈內二硫橋鍵。各H鏈在N末端具有一個可變域(Vh)，接著a和丫鏈各自的=個恒定 域(姑巧化和e同種型的四個姑域。各L鏈在N末端具有一個可變域(化），接著在其另一端具有 一個恒定域。將化與Vh比對并且將Cl與重鏈的第一恒定域(姑1)比對。據悉，具體的氨基酸殘 基形成了輕鏈可變域與重鏈可變域之間的界面。Vh和化的配對一起形成單一抗原結合位點。
[0115] IgM形成多個免疫球蛋白用二硫鍵共價連接在一起的聚合物。IgM主要W五聚體的 形式存在，但還W六聚體的形式存在，并且因此含有10個或12個抗原結合位點。五聚體形式 任選含有額外的多膚，稱為J鏈，但也可在J鏈不存在的情況下制備。五聚IgM分子具有大致 970W)a的分子量。IgM由于它的聚合性質而擁有高親合力并且在補體活化中是尤其有效的。 不同于IgG, IgM單體中的重鏈主要由一個可變域和四個恒定域組成。IgM恒定域在本文指定 為CMl或化1、CM2或化2、CM3或化3、和CM4或化4，其中"CM"和"化"名稱可互換使用。
[0116] IgA抗體W單體形式存在但也可聚合。在它們的分泌形式中，IgA包含2-5個由J鏈 和分泌組分連接的基本的4鏈單元。
[0117] I巧W單體形式存在，并且具有四個恒定域，在本申請中稱為CE1、CE2、CE3和CE4。
[0118] 來自任何脊椎動物物種的L鏈可基于其恒定域的氨基酸序列指定為兩種明顯不同 類型(稱為K和A)中的一者。
[0119] 一些抗體類型還可分成各種子類:IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。
[0120] 關于不同類別抗體的結構和性質的進一步細節(jié)，參見例如，Basic and Clinical Immunology,第8片反，Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(編）， Appleton&Lange,No;rwa化,Conn. , 1994,第71 頁和第6章。
[0121] 除非上下文說明，否則術語"抗體"明確地包括天然人類和非人類IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、I姐、IgA、I曲和IgM抗體，包括天然存在的變體。因此，例如，人類IgM序列可W GenBank 登錄號 X14940.1 購得，同時變體已報告為 GenBank CAB37838. UCAC20458.1、 AFM37312.1、X57331.1和J00260.1。
[0122] 如本文所用的術語"單克隆抗體"是指自大致上均質抗體的群體獲得的抗體，即除 可W少量存在的可能天然存在的突變之外，構成所述群體的個別抗體是相同的。單克隆抗 體是高度特異性的，針對單一抗原位點。此外，與通常包括針對不同決定子(表位)的不同抗 體的常規(guī)（多克?。┛贵w制劑不同，各單克隆抗體針對抗原上的單一決定子。修飾語"單克 隆"指示抗體是從實質上均質的抗體群體獲得的特性，且不應解釋為需要通過任何特定方 法來產生所述抗體。例如，待根據本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過最初由Kohler等（1975) 化化re 256:495描述的雜交瘤方法制備，或可通過重組DNA方法(參見例如，美國專利號4， 816,567)制備。還可W使用例如Clackson等（1991)化Uire 352:624-628和Marks等（1991) J.Mol.Biol.222:581-597中所描述的技術從隧菌體抗體文庫中分離"單克隆抗體"。
[0123] 本文中的單克隆抗體明確包括"嵌合"抗體(免疫球蛋白），其中一部分重鏈和/或 輕鏈與源于特定物種或屬于特定抗體類別或子類的抗體中的相應序列相同或同源，而所述 鏈的剩余部分與源于另一物種或屬于另一抗體類別或子類的抗體中的相應序列相同或同 源；W及所述抗體的片段，只要其展現所需生物活性即可（美國專利號4,816,567;和 Morrison等（1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。
[0124] "人源化"形式的非人類(例如，鼠類)抗體是含有源于非人類免疫球蛋白的最小序 列的抗體。人源化抗體大部分是人類免疫球蛋白（接受者抗體），其中來自接受者的高變區(qū) 的殘基經來自如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物的非人類物種(供體抗體）的高變區(qū)的 具有所需特異性、親和力和能力的殘基置換。在一些情況下，所述人類免疫球蛋白的Fv構架 區(qū)(FR)殘基也由相應非人類殘基置換。另外，人源化抗體可包含在接受者抗體中或在供體 抗體中沒有見到的殘基。進行運些改性W進一步精制抗體性能。通常，所述人源化抗體將包 含至少一個且通常兩個可變域的基本全部，其中全部或基本全部的高變環(huán)對應于非人免疫 球蛋白的那些高變環(huán)且全部或基本全部的FR區(qū)為人免疫球蛋白序列的那些FR區(qū)。所述人源 化抗體任選還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)的至少一部分，通常人類免疫球蛋白的免疫球 蛋白恒定區(qū)（Fe)的至少一部分。更多細節(jié)參見Jones等（1986)化ture321 :522-525; Riechmann等（1988)化1:ure 332:323-329;和Presta(1992)Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596。
[0125] "物種依賴性抗體"是對來自第一哺乳動物物種的抗原的結合親和力比對來自第 二哺乳動物物種的所述抗原的同源物的結合親和力強的抗體。通常，物種依賴性抗體"特異 性結合"至人類抗原（即具有不超過約Ix ICT7M,優(yōu)選地不超過約Ix !(T8M并且最優(yōu)選地不 超過約Ix !(T9M的結合親和力化d)值），但是對來自第二哺乳動物物種的所述抗原的同源物 具有結合親和力，所述結合親和力比其對人類抗原的結合親和力弱至少約50倍、或至少約 500倍、或至少約1000倍。物種依賴性抗體可W是上文所定義的各種類型抗體中的任何一 種，但優(yōu)選地是人源化抗體或人類抗體。
[0126] 如本文所用的"抗體突變體"或"抗體變體"是指參考抗體的氨基酸序列變體，其中 參考抗體的一個或多個氨基酸殘基被修飾。參考抗體可例如是天然抗體，但還可W是天然 抗體的已知變體。所述突變體必然與參考抗體具有小于100%序列同一性或相似性。在優(yōu)選 實施方案中，抗體突變體將具有與參考抗體的重鏈或輕鏈可變域的氨基酸序列具有至少 75 %、更優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少85%、更優(yōu)選地至少90 %并且最優(yōu)選地至少95 %氨 基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列。關于所述序列的同一性或相似性在本文定義為在 比對序列并且引入間隙（必要時）W實現最大序列同一性百分比之后，候選序列中的氨基酸 殘基與參考抗體殘基相同（即相同的殘基)或相似（即基于共同側鏈性質來自相同組的氨基 酸殘基）的百分比。N末端、C末端、或內部延伸、缺失、或插入到可變區(qū)外的抗體序列中都不 應被認為影響序列同一性或相似性。
[0127] 本文中"分離的"雙特異性或多特異性結合分子，諸如雙特異性或多特異性抗體， 是已被鑒定且與它在重組宿主細胞中的天然環(huán)境的組分分離和/或從所述天然環(huán)境的組分 回收的抗體。它的天然環(huán)境的污染物組分是可干擾分子(例如抗體)的診斷或治療用途的物 質，并且可包括酶、激素和其他蛋白質性或非蛋白質性溶質，W及生產的非所需副產物，諸 如像單特異性結合單元(就包含AB結合單元的雙特異性分子而言的AA和/或BB)或具有小于 五個雙特異性結合單元的分子。在優(yōu)選實施方案中，雙特異性結合分子，諸如抗體，將（1)被 純化至如通過SDS-PAGE或SEC-HPLC方法所測定，大于95重量％、或大于98重量％、或大于99 重量％，（2)被純化至足W通過使用氨基酸測序儀獲得N末端或內部氨基酸序列的至少15個 殘基的程度，或(3)通過使用考馬斯藍(Coomassie blue)或優(yōu)選地銀染色法，在還原或非還 原條件下進行SDS-PAGE被純化至均質。通常，分離的多特異性(例如雙特異性)結合分子(例 如抗體)將通過至少一個純化步驟來制備。
[0128] 術語"特異性結合"或"特異性結合至"或"特異于"是指結合分子饋如抗體)對祀 標分子(例如具體多膚或具體多膚上的表位、膚或其他祀標(例如糖蛋白祀標））的結合，并 且意謂可測量地不同于非特異性相互作用（例如，非特異性相互作用可結合至牛血清白蛋 白或酪蛋白）的結合。特異性結合可例如通過相較于抗體對對照分子的結合測定抗體對祀 標分子的結合來測量。例如，特異性結合可通過與類似于標祀(例如，過量未標記祀標)的對 照分子的競爭來測定。就此而言，若標記祀標對探針的結合受到過量未標記祀標的競爭抑 審IJ，則指示為特異性結合。如本文所使用的術語"特異性結合"或"特異性結合至"或"特異 于"具體多膚或具體多膚祀標上的表位可例如由對祀標具有至少約200nM、或者至少約 15化M、或者至少約lOOnM、或者至少約60nM、或者至少約50nM、或者至少約40nM、或者至少約 30nM、或者至少約20nM、或者至少約lOnM、或者至少約8nM、或者至少約6nM、或者至少約4nM、 或者至少約化M、或者至少約InM或更大的Kd的分子來展現。在某些情況下，術語"特異性結 合"是指分子結合至具體多膚或具體多膚上的表位，而不實質上結合至任一其他多膚或多 膚表位的結合。
[0129] "結合親和力"是指分子(例如抗體）的單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原） 之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另外指明，否則如本文所用，"結合親和力"是指 反映結合對的成員（例如，抗體與抗原)之間的1:1相互作用的固有結合親和力。分子X對其 配偶體Y的親和力可通常由解離常數化d)表示。例如，Kd可W是約200nM、150nM、100nM、 60nM、50nM、40nM、30nM、20nM、1 OnM、8nM、6nM、4nM、2nM、1 nM或更強。親和力可通過本領域中 已知的常用方法(包括本文所述的）加 W測量。低親和力抗體通常緩慢地結合抗原并且傾向 于容易解離，而高親和力抗體通常更快地結合抗原并且傾向于保持結合時間更長。測量結 合親和力的多種方法在本領域是已知的。
[0130] 如本文所用的"KcT或"Kd值"是指通過適用于抗體和祀標對的技術，例如使用 BIAcore?-2000 或 BIAcore?-3000(BIAcore 公司，Pisca 化 way，N.J.)，在25°C下，用固定抗 原CM5忍片在約10反應單位(RU)下，例如使用表面等離子體共振測定來測量的解離常數。
[0131] 如本文所用的術語"雙特異性結合單元"是指包含一對IgM重鏈恒定區(qū)多膚的分 子，所述IgM重鏈恒定區(qū)多膚各自至少包含CM4域，并且各自綴合至不同結合祀標的結合區(qū)。 優(yōu)選地，綴合通過融合，優(yōu)選地至IgM重鏈恒定區(qū)多膚序列的N末端。術語"雙特異性結合單 元"明確地涵蓋但不限于"雙特異性IgM抗體結合單元"，如在下文中定義。本發(fā)明結合分子 具有五聚或六聚環(huán)結構并且包含五個或六個雙特異性結合單元。
[0132] 術語"綴合"是指共價或非共價鍵的任何和所有形式，且包括但不限于直接基因融 合或化學融合、通過連接子或交聯劑偶聯和非共價締合。
[0133] 術語"雙特異性IgM抗體結合單元"是W最廣泛的意義使用并且明確涵蓋一對融合 至可變域序列(Vh)的IgM抗體重鏈恒定區(qū)多膚(至少包含CM4恒定域），各可變域序列結合至 不同祀標，與抗體輕鏈可變域(Vl)序列締合或不締合。在一個實施方案中，雙特異性IgM抗 體涵蓋兩個Vh化抗原結合區(qū)，各抗原結合區(qū)能夠結合至一個抗原上的不同表位或兩個不同 抗原上的表位。雙特異性IgM抗體結合單元可W是單一物種的全長結合單元，或可W被嵌合 或人源化。本發(fā)明雙特異性IgM抗體具有五聚或六聚環(huán)結構，其包含五個或六個雙特異性 IgM結合單元。
[0134] "全長IgM抗體重鏈"是在N末端向C末端方向上由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恒定 重鏈恒定域UCMl或化1)、抗體重鏈恒定域2(CM2或化2)、抗體重鏈恒定域3(CM3或化3)和抗 體重鏈恒定域4(CM4或化4)組成的多膚。根據本發(fā)明的雙特異性全長IgM抗體包含五個或六 個各自具有兩個抗原結合位點的單體(結合單元），所述單體特異性結合至兩個不同結合祀 標(表位）。全長抗體的重鏈或輕鏈的C末端表示重鏈或輕鏈的C末端處的最后一個氨基酸。 全長抗體的重鏈或輕鏈的N末端表示重鏈或輕鏈的N末端處的第一個氨基酸。
[0135] 如本文所用的術語"價"表示抗體中存在特定數目的結合位點。因而，術語"二價"、 "立價"和"六價"分別表示存在兩個結合位點、四個結合位點和六個結合位點。在根據本發(fā) 明的雙特異性IgM抗體中，各結合位點是二價的。因此，本文雙特異性IgM抗體具有10個或12 個化合價。所述定義同樣適用于作為非抗體的結合分子。
[0136] 術語"表位"包括能夠特異結合至抗體的任何分子決定子。在某些實施方案中，表 位決定子包括如氨基酸、糖側鏈、憐酷基或橫酷基的分子的化學活性表面集合，且在某些實 施方案中可具有特定=維結構特征和/或特定電荷特征。表位是抗原中由抗體結合的區(qū)域。 "結合區(qū)"是祀標上由結合分子結合的區(qū)。
[0137] "多表位特異性"是指特異性結合至相同或不同祀標上的兩個或更多個不同表位 的能力。"單特異性"是指結合僅一個表位的能力。根據一個實施方案，雙特異性IgM抗體結 合至各表位，其中親和力為至少1(T 7M、或ICT8M或更好。
[0138] 術語"祀標"是W最廣泛的意義使用并且明確包括多膚、核酸、碳水化合物、脂質和 具有當它們在自然界中存在時的生物功能的其他分子。"祀標"可例如是細胞，其中雙特異 性結合單元祀向兩個不同細胞類型、相同細胞類型的不同亞群（例如不同B細胞種群）或單 一細胞上的兩個不同實體。
[0139] 本發(fā)明抗體的"抗原結合位點"或"抗原結合區(qū)"通常含有六個互補決定區(qū)（CDR)， 所述互補決定區(qū)W不同程度促成結合位點對抗原的親和力。存在S個重鏈可變域CDR (CD畑1、CD畑2和CD畑3)和S個輕鏈可變域CDR(CD化1、CDRL巧日CDRL3)。CDR和構架區(qū)（FR)的 范圍通過比較匯編的氨基酸序列數據庫來確定，在所述數據庫中所述區(qū)已根據序列之間的 變化性和/或抗體/抗原復合物的結構信息來定義。本發(fā)明范圍內還包括由較少CDR組成 (即，結合特異性通過=個、四個或五個CDR來確定）的功能抗原結合位點。少于一組完整的6 個CDR可足夠結合至一些結合祀標。因此，在一些情況下，單獨VH或化域的CD時尋是足夠的。 此外，某些抗體可具有針對抗原的非CDR締合結合位點。所述結合位點確切地包括在本定義 內。
[0140] 如文本所使用，術語"界面"用于指代包含第一IgM重鏈恒定區(qū)中與第二IgM重鏈恒 定區(qū)中一個或多個"接觸"氨基酸殘基(或其他非氨基酸基團）相互作用的那些"接觸"氨基 酸殘基(或其他非氨基酸基團，諸如像碳水化合物基團）的區(qū)。
[0141] 術語"不對稱界面"用于指代在兩個抗體鏈諸如第一 IgM重鏈恒定區(qū)與第二IgM重 鏈恒定區(qū)之間和/或IgM重鏈恒定區(qū)與它的匹配輕鏈之間形成的界面(如在上文中定義），其 中第一鏈和第二鏈中的接觸殘基在設計上不同，其包含互補接觸殘基。不對稱界面可通過 鈕/孔相互作用和/或鹽橋偶聯（電荷交換)和/或本領域已知的其他技術，諸如像通過用于 將y重鏈偶聯至它的匹配輕鏈的化ossMab方法來產生。
[0142] 1堅'或"孔"是指至少一個從第二多膚的界面凹入并且因此容納第一多膚的相鄰 界面上的相應突起（"鈕"）的氨基酸側鏈。腔(孔)可存在于原始界面中或可經過化學方式引 入(例如通過改變編碼界面的核酸）。通常，編碼第二多膚的界面的核酸經過改變來編碼腔。 為了實現運一點，