A型口蹄疫病毒單克隆抗體識別的中和表位及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了A型口蹄疫病毒單克隆抗體識別的中和表位及其應(yīng)用，屬于口蹄疫的防治領(lǐng)域。所述中和表位的氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示；其中，X1為任意一種氨基酸；X2為Pro、Ser、Ala、Gln、Val或Thr；X3為Leu、Val、Ala或Thr。所述中和表位與A型口蹄疫病毒抗體陽性血清的特異性反應(yīng)試驗表明其與A型FMDV的陽性血清呈現(xiàn)良好的反應(yīng)能力，而與O型和Asia1型FMDV陽性血清以及A型FMDV陰性血清沒有反應(yīng)，試驗結(jié)果證明該中和表位能夠特異性區(qū)分A型FMDV的陰、陽性血清，在A型口蹄疫的診斷、預(yù)防和治療等方面具有應(yīng)用潛力。CGMCC 1204920160321
【專利說明】
A型口蹄疫病毒單克隆抗體識別的中和表位及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及中和表位，尤其涉及A型口蹄疫病毒單克隆抗體識別的中和表位，本發(fā) 明進一步涉及所述的中和表位在診斷、預(yù)防或治療A型口蹄疫中的應(yīng)用，屬于口蹄疫中和表 位的鑒定以及應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus，F(xiàn)MDV)屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒 屬，F(xiàn)MDV基因組RNA全長約8.5kb?？谔阋撸‵oot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由FMD病毒 (FMDV)引起的，主要侵害牛、豬、羊等家畜及多種野生偶蹄動物的高度接觸性傳染病。該病 的爆發(fā)和流行常常給畜牧業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟發(fā)展帶來巨大的損失，嚴重影響了經(jīng)濟貿(mào)易與畜牧 業(yè)的發(fā)展，備受世界各國的關(guān)注。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)將其列 為A類動物傳染病。
[0003] FMDV有7個血清型，分別為0、六、(：、341'1、34了2、34了3和481&1，各血清型之間無交叉 免疫保護。FMDV的抗原結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，不同血清型、基因型和分離株的抗原位點和抗原表位 都不盡相同。中和性抗原位點不僅決定了的血清型、基因型以及株的特異性，而且成為特異 性中和抗體的靶向位點。對于多數(shù)病毒，中和性抗原位點在感染或免疫個體所建立的保護 性反應(yīng)中具有重要意義。
[0004] 目前，中國主要流行0型、Asial型和A型FMD。近年來，中國部分地區(qū)相繼發(fā)生了A型 FMDV。因此鑒定出A型口蹄疫病毒單克隆抗體識別的中和表位對于該病的診斷和預(yù)防均具 有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是提供A型口蹄疫病毒單克隆抗體識別的中和表位；
[0006] 本發(fā)明的目的之二是將上述的中和表位應(yīng)用于診斷、預(yù)防或治療A型口蹄疫中。
[0007] 本發(fā)明為達到上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明首先公開了能分泌抗A型口蹄疫病毒中和性單克隆抗體的雜交瘤細胞系以 及由該雜交瘤細胞系所分泌的單克隆抗體。
[0009] 本發(fā)明利用滅活并純化的A型口蹄疫病毒免疫BALB/c鼠，制備抗A型FMDV A/JLYS/ CHA/2014株的單克隆抗體，抗體陽性雜交瘤細胞經(jīng)3次有限稀釋法亞克隆，獲得三株能穩(wěn) 定分泌抗體的雜交瘤細胞，分別命名為9A9、8G9和9H4。經(jīng)IFA特異性鑒定，單抗9A9重鏈類型 為IgG2a，輕鏈為κ類型。單抗8G9重鏈類型為IgG2a，輕鏈為κ類型。單抗9H4重鏈類型為 IgG2b，輕鏈為κ類型。
[0010] 微量細胞中和試驗表明，雜交瘤細胞9A9所分泌的單抗具有很高的中和活性，其腹 水中和效價高達1:4096，而雜交瘤細胞8G9所分泌的單抗腹水中和效價僅為1:89，雜交瘤細 胞9H4所分泌的單抗則無中和活性;試驗結(jié)果表明，雜交瘤細胞9A9所分泌的單抗的中和活 性顯著高于雜交瘤細胞8G9分泌單抗的中和活性。
[0011]本發(fā)明用單抗9A9對全病毒進行Western blot分析，顯示明顯的特異性反應(yīng)條帶， 由此認為單抗9A9識別A型FMDV的一個線性表位。將單抗9A9培養(yǎng)上清分別與感染A、0和 Asial型FMDV的BHK-21細胞進行間接免疫熒光檢測，結(jié)果顯示，9A9只與A型毒株呈陽性反 應(yīng)，而與多個〇型和Asial型FMDV分離株均無交叉反應(yīng)，可認定949為六型?1?^血清型特異性 單抗。
[0012] 鑒于雜交瘤細胞系9A9所分泌的抗A型口蹄疫病毒單克隆抗體為A型FMDV血清型特 異性單抗，且有高中和活性，本發(fā)明將該雜交瘤細胞系9A9提交專利認可的機構(gòu)進行保藏， 其微生物保藏編號為:CGMCC 12049;建議的分類命名為:分泌抗A型FMDV的中和性單克隆抗 體雜交瘤細胞株;保藏單位：中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是： 2016年3月21日；保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。 [0013]本發(fā)明將制備的單抗9A9腹水，經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨方法純化，紫外分光光度計測 定9六9濃度為7.64mg/ml。抗體9A9再經(jīng)DEAE-sephadex a-50離子交換層析進一步純化，用改 良過碘酸鈉法標(biāo)記HRP。用方陣滴定法初步確定A型口蹄疫病毒抗體檢測系統(tǒng)中A型口蹄疫 病毒純化抗原的包被濃度為6.4μg/ml，稀釋倍數(shù)為1:1000;!11^-949最適稀釋倍數(shù)為1 : 1500〇
[0014]為了驗證單抗9A9在A型口蹄疫病毒抗體檢測中的診斷價值，用初步建立的A型口 蹄疫病毒抗體檢測方法分別檢測不同稀釋倍數(shù)的A型FMDV強陽性、弱陽性、疑似(臨界值)和 陰性血清，同時設(shè)立0型和Asial型FMDV強陽性血清作為對照，以驗證單抗9A9在A型口蹄疫 病毒抗體檢測方法中與抗原的結(jié)合能力、以及單抗9A9區(qū)分A型口蹄疫病毒陰陽性血清的能 力。用上述檢測結(jié)果繪制強陽性、弱陽性、疑似(臨界值）、陰性血清的抗體滴度曲線，結(jié)果表 明：單抗9六9在厶型?10^抗體檢測方法中與A型FMDV的強陽性、弱陽性和疑似血清呈現(xiàn)良好的 競爭能力，而與0型和Asial型FMDV強陽性血清以及FMDV陰性血清沒有競爭性，能夠特異性 區(qū)分A型FMDV的陰陽性血清，確定了單抗9A9在建立A型口蹄疫病毒抗體檢測方法中的價值 和應(yīng)用潛力。
[0015]本發(fā)明進一步公開了上述單抗9A9識別的中和表位，所述中和表位的氨基酸序列 為SEQ ID NO: 1所示，其中，Xi為任意一種氨基酸，優(yōu)選為Leu;X2為Pro、Ser、Ala、Gln、ValS Thr，優(yōu)選為Pro; X3 為Leu、Val、Ala 或 Thr，優(yōu)選為Leu。
[0016] 更優(yōu)選的，所述中和表位的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、 SEQ ID NO: 11 或SEQ ID NO: 12所示。
[0017]本發(fā)明利用衣殼蛋白的截短表達、表位肽的GST融合表達、系列表位突變肽的GST 融合表達等方式，通過SDS-PAGE電泳和Western blot檢測分析，最終確定了 4Rgdlgplaarl14為單抗9A9識別表位的反應(yīng)活性單元，即單抗9A9識別的中和表位。進一步以 9A9表位 4Rgdlgplaarl14為基礎(chǔ)，用丙氨酸(A)從N端至c端逐個進行氨基酸替換對9A9識別表 位的關(guān)鍵氨基酸進行確定，表明在9A9所識別表位的氨基酸序列中，Gl y147、Leu149為關(guān)鍵氨 基酸，4找143、61 7144)叩145、？仰148^找152和1^11 153為重要氨基酸，1^11146對表位活性無影響。 為驗證9A9表位的保守性，選取了GenBank收錄的753條A型FMDV的VPl氨基酸序列（其中包含 血清A型FMDV三種拓撲型的毒株)進行比對分析，結(jié)果顯示，9A9表位氨基酸序列在A型FMDV 毒株之間是高度保守的。序列比對中發(fā)現(xiàn)，該表位序列中突變最多的是Pro148與Leu153,其中 Pro148 可突變?yōu)?561~41&、6111、￥31和11^，1^11153可突變?yōu)椋?1^13和11^;而617 147和1^11149作 為本發(fā)明鑒定的9A9表位關(guān)鍵氨基酸，在所有的發(fā)表序列中均是保守的。
[0018] 為了確定單抗9A9所針對的抗原表位能否作為診斷抗原來檢測A型口蹄疫病毒抗 體陽性血清，將9A9識別的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL(其氨基酸序列為 SEQ ID勵:2)進行定點誘變:1^11146突變?yōu)?1^(?)或16以]\〇;?仰 148突變?yōu)?61~413、6111、￥&1 或Thr; Leu153突變?yōu)閂al、Ala或Thr，這些突變肽以GST融合的方式表達，分別命名為L146F (其氨基酸序列為SEQ ID N0:3)、L146M(其氨基酸序列為SEQ ID N0:4)、P148S(其氨基酸序 列為SEQ ID NO: 5)、P148A(其氨基酸序列為SEQ ID NO: 6)、P148Q(其氨基酸序列為SEQ ID N0:7)、P148V(其氨基酸序列為SEQ ID N0:8)、P148T(其氨基酸序列為SEQ ID N0:9)、L153V (其氨基酸序列為SEQ ID NO: 10)、L153A(其氨基酸序列為SEQ ID NO: 11)和L153T(其氨基 酸序列為SEQ ID NO: 12)。然后，將這些GST融合的表位肽作為抗原分別包被ELISA板，檢測A 型FMDV陽性和陰性血清，同時設(shè)立0型和Asial型FMDV陽性血清作為對照，以檢測單抗9A9 識別的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL及其突變體與A型口蹄疫病毒抗體的反 應(yīng)能力，由此評價9A9識別的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL在A型口蹄疫診斷 中的價值。結(jié)果表明：單抗9A9識別的A型FMDV中和表位肽及其系列表位突變肽與A型FMDV的 陽性血清呈現(xiàn)良好的反應(yīng)能力，而與0型和Asial型FMDV陽性血清以及A型FMDV陰性血清沒 有反應(yīng)，表明該中和表位能夠特異性區(qū)分A型FMDV的陰陽性血清。
[0019] 本發(fā)明進一步公開了所述的中和表位在制備診斷、預(yù)防或治療口蹄疫的試劑或藥 物中的用途。
[0020] 其中，所述的藥物還包括藥學(xué)上可接受的佐劑。
[0021] 本發(fā)明還公開了一種用于診斷A型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒，包括：用于包被酶 標(biāo)記抗原的檢測板、稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液、酶標(biāo)記的抗原、酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、 陽性對照血清和陰性對照血清。
[0022]其中，所述的酶為辣根過氧化物酶;所述的抗原為SEQ ID NO: 1所示的中和表位 肽，優(yōu)選為SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:11或SEQIDN0:12所示的中 和表位肽；
[0023] 所述的檢測板優(yōu)選為96孔板;所述的稀釋液為pH9.6的Na2C03/NaHC03緩沖液;所述 的洗滌液為PH7.4的PBST;所述的顯色液為(PD底物溶液;所述的終止液為2M H2SO4;所述的 陽性對照血清為A型口蹄疫病毒陽性血清;所述的陰性對照血清為A型口蹄疫病毒陰性血 清。
[0024] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0025] 本發(fā)明A型口蹄疫病毒單克隆抗體識別的中和表位，能應(yīng)用于口蹄疫的診斷、預(yù)防 或治療中，可對口蹄疫的被動免疫起到良好的免疫效果，對于口蹄疫的免疫預(yù)防將具有重 要的意義。
【附圖說明】
[0026] 圖I IFA檢測單抗9A9與A型、0型、Asial型FMDV的反應(yīng)；
[0027]圖2經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨方法和離子交換層析法純化的單抗9A9;
[0028] 圖3用A型口蹄疫病毒抗體檢測方法檢測A型FMDV強陽性、弱陽性、疑似、FMDV陰性、 0型FMDV強陽性和As ial型FMDV強陽性血清的滴度變化曲線；
[0029] 圖4單抗9A9對滅活的A型FMDV全病毒與的Western blot分析；
[0030] 圖5 GST融合蛋白的SDS-PAGE(a，c，e)和Western blot分析(b，d，f);
[0031] 圖6截短肽GST融合蛋白的SDS-PAGE(a)和Western blot分析(b);
[0032] 圖7丙氨酸掃描突變合成肽的SDS-PAGE(a)和Western blot分析(b);
[0033] 圖8 9A9表位肽氨基酸序列的保守性分析；
[0034] 圖9 GST融合表達的系列表位突變肽與A型FMDV陽性、陰性、0型FMDV陽性和Asial 型FMDV陽性血清的免疫反應(yīng)性。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和 形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護范圍。
[0036] 1.材料
[0037] 1.1病毒、細胞、菌株和實驗動物
[0038]用于免疫熒光進行單抗特異性分析的毒株包括：A FMDV A/KT/58(GenBank accession number:AJ131665),AsialFMDV Asial/YS/CHA/05(GU931682),0/YS/CHA/05 (HM008917),0 FMDV 0/Tibet/CHA/99(AJ539138),0/GD/86(AJ131468),0/Akesu/58 (AF511039)(Wang H1Zhao L,Li W1Zhou G,Yu L(2011) I dentificat ion of a conformational epitope on the VPlG-H Loop of type Asialfoot-and-mouth disease virus defined by a protective monoclonal antibody.Veterinary microbiology 148:189-199)。另，口蹄疫病毒株A/JLYS/CHA/2014屬于A型FMDV東南亞97譜系（Sea-97)，其 VPl序列的同源性與A/GDMM/CHA/2013(GenBank accession number:KF450794) (Zheng H， Lian K，Yang F，Jin Y，Zhu Z，Guo J，Cao W，Liu H，He J，Zhang K，Li D，Liu X(2015) Cross-protective efficacy of engineering serotype A foot-and-mouth disease virus vaccine against the two pandemic strains in swine. Vaccine 33:5772- 5778.)高達99%，來源上屬于同一次流行的毒株。上述毒株由本實驗室保存。
[0039] 乳倉鼠腎細胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤細胞為本實驗室保存；
[0040] 質(zhì)粒pGEX-6p-l和受體菌BL21由本實驗室保存；
[0041]清潔級雌性BALB/c小鼠購于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。 [0042] 1.2主要試劑
[0043]融合劑PEG/DMS0(Mw，1450)、HAT鹽（50x)、HT鹽（50x)、HRP或FITC標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自 Southern Biotech公司；
[0044] L-谷氨酰胺(glutamine )、甘氨酸購自Amresco公司；
[0045] 二甲基亞砜(DMSO)、鄰苯二胺(OPD)、PEG6000購自 SoIarbi〇公司；
[0046] 限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI購自TaKaRa公司；
[0047] T4DNA連接酶購自New England Biolabs公司；
[0048] 高糖DMEM干粉購自GIBCO公司；
[0049] 進口優(yōu)級胎牛血清(PAA)購自西班牙Nalgene公司；
[0050] 96孔細胞培養(yǎng)板購自加拿大JET Biochemical公司；
[0051] ELISA 板購自于 Corning 公司；
[0052] DAB顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；
[0053] BL21感受態(tài)購自于天根公司；
[0054] pGEX-6p_l由本實驗保存。
[0055] 實驗例I A型口蹄疫病毒中和性單克隆抗體的制備
[0056] 1、試驗方法
[0057] 1.1鼠免疫與單克隆抗體的制備
[0058] (1)將A型FMDV接種于長滿的BHK-21細胞單層，待75 %以上細胞出現(xiàn)病變后收毒。 將收獲的細胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融三次，初步裂解細胞，釋放病毒。凍融后的病毒液以加入1: 1000TritonX-100和4:10000甲醛裂解與滅活4811以上，取滅活過的病毒液11^上冊1(-21細胞 盲傳三代、檢測滅活是否徹底。將經(jīng)凍融裂解后的培養(yǎng)液9000rpm(Be Ckman高速離心機，JA-10轉(zhuǎn)子）、4°C離心90min，回收病毒液上清，棄去細胞沉淀。按病毒液上清的體積加入80g/L 的PEG6000和40g//L的NaCl，室溫攪拌2h至完全溶解，4°C過夜沉淀。次日將上清9000rpm、4°C 離心90min，棄上清，回收沉淀。用NET緩沖液于低溫下將沉淀輕輕重懸，29000rpm、4°C離心 2h，在冰盒中用適量的NET緩沖液輕輕重懸沉淀。制備15 %~45 %均勻線性蔗糖梯度，對病 毒濃縮液進行蔗糖密度梯度超速離心，利用用紫外分光光度計檢測0D259值，根據(jù)公式計算 146S的抗原含量。
[0059] (2)用純化的A型FMDV抗原，100yg/200uL加等體積弗氏完全佐劑，充分乳化后經(jīng)背 部皮下注射6周齡雌性BALB/c小鼠；2周后進行第2次免疫，佐劑為弗氏不完全佐劑;2周后， 以不加佐劑的等量抗原進行第3次免疫。為刺激小鼠快速產(chǎn)生強烈免疫反應(yīng)，于融合前3d采 用尾靜脈和脾臟注射相結(jié)合的免疫方式進行加強免疫，注射二倍劑量的抗原。
[0060] (3)細胞融合
[0061 ] a)飼養(yǎng)層細胞的制備:細胞融合前一天進行飼養(yǎng)層細胞的制備，眼科剪刀、眼科鑷 子、平皿等試驗用具用前高溫干熱滅菌，HAT完全培養(yǎng)液做無菌檢驗。取2只BALB/c小鼠摘除 眼球放血，按常規(guī)方法分離陰性血清。拉頸脫臼處死小鼠，將其浸泡于75%酒精中，IOmin后 移入超凈工作臺。將小鼠腹部向上固定在鼠架上，用鑷子提起腹正中部皮膚，眼科剪刀橫向 剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和鑷子上下撕開皮膚，充分暴露腹膜。用鑷子輕輕提起腹 膜，將IOmL注射器內(nèi)吸取的8-10mL HAT完全培養(yǎng)液注入腹腔，切勿刺破臟器和腸道，注射器 不要拔出，在腹腔內(nèi)來回抽吸5-10次，然后用鑷子按摩兩側(cè)腹部30秒左右，再進行抽吸，重 復(fù)以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔內(nèi)液體。注意避開腸系膜及脂肪組織，以免堵塞針頭。 將從2只鼠中取出的腹腔細胞加入55mL HAT培養(yǎng)液中，吹散混勻細胞，分裝于6塊96孔培養(yǎng) 板，I OOyL/孔。置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0062] b)骨髓瘤細胞的制備:融合前36_48h，將骨髓瘤細胞擴大培養(yǎng)，使細胞處于對數(shù)生 長期。融合當(dāng)天，用15mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細胞從瓶壁上吹下，收集于50mL離心管中。 1000 rpm離心10min。將細胞沉淀重懸置20mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，混勻。取少量骨髓瘤細胞 懸液，臺盼蘭染色計數(shù)，備用。
[0063] c)免疫脾細胞的制備:融合前摘除小鼠眼球采血，制備陽性血清。將小鼠拉頸脫臼 致死，浸泡于75%酒精中，IOmin后放于超凈臺。無菌打開腹腔，分離結(jié)締組織并取出脾臟， 將脾臟放入裝有滅菌尼龍網(wǎng)和盛有15mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液的平皿中，用滅菌玻璃注射器內(nèi)芯 研磨脾臟，使脾細胞全部通過網(wǎng)孔進入平皿中。將脾細胞溶液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加 DMEM基 礎(chǔ)培養(yǎng)液大約至30mL，混勻。1000 rpm離心8min，棄上清。將細胞沉淀懸于IOmL DMEM基礎(chǔ)培 養(yǎng)液中，混勻。取細胞懸液，臺盼蘭染色計數(shù)，備用。
[0064] d)脾細胞與骨髓瘤細胞融合：取65mLHAT培養(yǎng)液，15mL基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)液和lmL50% PEG于37°C水浴中預(yù)熱，另備盛有37°C水的200mL燒杯。按5份脾細胞數(shù)加1份骨髓瘤細胞數(shù) 取相應(yīng)細胞懸液量，加入50mL玻璃離心管中，補加 DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液至30mL，混勻。I OOOrpm 離心10min，棄上清，盡可能倒干。用手掌輕擊離心管底部，使沉淀細胞松散均勻呈糊狀。將 離心管放入盛有37°C水的200mL燒杯中，一手均勻轉(zhuǎn)動離心管，另一手用ImL巴氏吸管吸取 37 °C 50 % PEG溶液ImL，Imin內(nèi)加完，靜置2min。隨后先慢后快地加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止反 應(yīng)，37 °C水浴靜置IOmin。1000 rpm離心10min，棄上清，加入65mLHAT培養(yǎng)基，輕輕地吹散細 胞，每孔0 . ImL接種于已培養(yǎng)有飼養(yǎng)細胞的6塊96孔培養(yǎng)板，置37°C、5 %的CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)。5d后半量換液，8d后全換液，待克隆長至孔底面積1/4-1/3時取上清進行檢測并換HT培 養(yǎng)液。
[0065] 1.2抗體檢測ELISA
[0066]用提純的病毒抗原包被于96孔板中，加入IOOuL雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，37°C溫育Ih 后洗滌，加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，洗滌后加入底物OPD避光顯色IOmin，于 波長492nm測定吸光值。
[0067] 1.3間接免疫熒光（IFA)
[0068] 微孔板培養(yǎng)BHK-21細胞至單層，接種口蹄疫病毒4X 103TCID5Q/well，出現(xiàn)CPE之前 用冷無水乙醇進行固定，加入50uL雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，37 °C溫育40min后PBS洗滌三次，加 入1:200稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG抗體，37 °C溫育40min，洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察 熒光強度。
[0069] 1.4微量細胞中和試驗
[0070] (1)病毒毒價的測定:將病毒接種于單層細胞，37°C吸附Ih后加入維持液，置溫箱 培養(yǎng);逐日觀察，待細胞病變(CPE)達75%以上，收獲病毒懸液凍融3次，以3 000r/min離心 lOmin，取上清液，定量分裝成Iml小瓶置-70°C保存?zhèn)溆?，選用的病毒必須是對細胞有較穩(wěn) 定的致病力。取置-70 °C冰箱保存的病毒一瓶，將病毒在96孔培養(yǎng)板上作10倍遞進稀釋即 HT1，KT2，HT11……，每孔病毒懸液量為50μ1，每個稀釋度作8孔，每孔加入100細胞懸液，每 塊板的最后一行設(shè)8孔細胞對照，制備細胞懸液的濃度以使細胞在24h內(nèi)長滿單層為度。把 培養(yǎng)板置5 % CO2溫箱37 °C培養(yǎng)，從48-72h逐日觀察細胞病變，記錄結(jié)果。按Reed和Muench兩 氏法計算TCID50。
[0071 ] (2)中和試驗:取單抗腹水在96孔微量細胞培養(yǎng)板上，用不含血清的DMEM作一系列 倍比稀釋，使其稀釋度分別為原腹水的1:4、1:8、1:16、1:32、1:64等等，每孔含量為50μ1，每 個稀釋度作4孔。取一 70 °C冰箱保存的病毒液，按經(jīng)測定的毒價作200TCID5Q稀釋(與等量腹 水混合，其毒價為IOOTCID 5q)。每孔加入50μ1病毒液，封好蓋，置于37°C溫箱中和lh。在制備 細胞懸液時，其濃度以在24h內(nèi)長滿單層為度:血清病毒中和Ih后取出，每孔加入100μΙ細胞 懸液。置5%C02 37°C溫箱培養(yǎng)，自培養(yǎng)48h開始逐日觀察記錄，120h終判。固定病毒稀釋腹 水中和試驗的結(jié)果計算，是計算出能保護50%細胞孔不產(chǎn)生細胞病變的腹水稀釋度，該稀 釋度即為該份血清的中和抗體效價。用Reed和Muench兩氏法(或Karber法)計算結(jié)果。
[0072] 2、試驗結(jié)果
[0073] 2.1針對A型FMDV線性中和表位單克隆抗體的篩選和鑒定
[0074] 免疫小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合的雜交瘤細胞，其培養(yǎng)上清FMD V特異性抗體用 間接ELISA檢測和IFA驗證，陽性判定標(biāo)準(zhǔn)為：以雜交瘤細胞培養(yǎng)上清對FMDV抗原的OD492光 吸收值與正常BALB/c小鼠血清、SP2/0細胞培養(yǎng)上清對FMDV抗原0D492值之比均大于2.1，且 雜交瘤細胞上清與正常BHK-21細胞不產(chǎn)生熒光反應(yīng)，判為陽性?？贵w陽性雜交瘤細胞經(jīng)3次 有限稀釋法亞克隆，獲得三株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞，分別命名為9A9、8G9和9H4。 [0075] 免疫球蛋白亞類鑒定顯示，單抗9A9重鏈類型為IgG2a，輕鏈為κ類型。單抗8G9重鏈 類型為IgG2 a，輕鏈為κ類型。單抗9H4重鏈類型為IgG2b，輕鏈為κ類型。微量細胞中和試驗表 明，9A9具有很高的中和活性，腹水中和效價高達1:4096。8G9腹水中和效價達到1:89。9H4則 無中和活性。
[0076] 鑒于雜交瘤細胞9A9所分泌的單抗是A型FMDV高中和活性的單抗，選取單抗9A9進 行下一步的研究。
[0077] 將單抗9A9培養(yǎng)上清分別與感染A、0和Asial型FMDV的BHK-21細胞進行間接免疫熒 光檢測；檢測結(jié)果顯示（圖1)，9A9只與A型毒株呈陽性反應(yīng)，而與多個0型和Asial型FMDV分 離株均無交叉反應(yīng)，可認定9A9為A型FMDV血清型特異性單抗。
[0078] 上述結(jié)果表明，單抗9A9是A型口蹄疫病毒特異性、高中和性的單抗。
[0079] 本發(fā)明將該雜交瘤細胞系9A9提交專利認可的機構(gòu)進行保藏，其微生物保藏編號 為：CGMCC 12049 ;保藏單位：中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是： 2016年3月21日；保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。
[0080] 實驗例2 A型口蹄疫病毒抗體檢測方法的建立
[0081 ] 1、試驗方法
[0082] 1.1單克隆抗體的純化
[0083]采用辛酸-飽和硫酸銨法對制備的腹水進行純化，操作步驟簡述如下：
[0084] (1)取3ml預(yù)處理過的腹水加 6ml 0.06mol/L pH4.8醋酸緩沖液;腹水中加99ul辛 酸室溫攪拌30分鐘，4°C靜置2小時以上；取出I 1000 rpm離心30分鐘，棄沉淀；上清用2mol/L NaOH 調(diào)pH至7.4。
[0085] (2)在4 °C條件下加入飽和硫酸銨至50 %飽和度，冰浴攪拌作用30分鐘，4 °C靜置2 小時以上；11000轉(zhuǎn)離心30分鐘，棄上清;沉淀溶于5ml 0.1 M的pH7.4的PBS中；
[0086] (3)向沉淀懸浮物中邊攪拌邊加適量飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨溶液中濃度為 30%-40%，冰浴攪拌作用30分鐘，4°C靜止2小時以上；11000轉(zhuǎn)離心30分鐘，取沉淀，將沉 淀融入2ml 0.1M的pH7.4的PBS中；
[0087] (4)將沉淀懸浮液裝入透析帶中，在4°C用0.1 M的pH7.4的PBS透析，2小時換液一 次，透析2天。透析完成后，回收透析袋中的純化腹水，紫外分光光度計測定蛋白濃度，用 SDS-PAGE進行純度檢測。
[0088] 再用DEAE-Sephadex A-50(GE公司）柱層析進一步純化單克隆抗體，回收純化后的 單克隆抗體，紫外分光光度計測定蛋白濃度，用SDS-PAGE進行純度檢測。
[0089] 1.2辣根過氧化物酶標(biāo)記單克隆抗體
[0090] 經(jīng)純化合格后的單克隆抗體用過碘酸鈉法進行標(biāo)記。操作步驟如下：
[0091] ①取5mg HRP溶于0.5ml pH5.6的0.06M HAc-NaAc緩沖液中，加入新配制的 0 · O6M0I/L NaKk溶液0 · 5ml，混勻，置4°C 20-30min;
[0092] @取出后加入0.161〇1/1乙二醇水溶液（101111!120+0.091111乙二醇）0.51111，室溫放置 30min；
[0093] ③加入含IOmg純化抗體的溶液Iml，混勻，調(diào)pH值9左右，并裝入透析袋，用0.05M/L PH9.5的碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析16-24h，使之結(jié)合；
[0094]④加入NaBH4溶液（5mg/ml )0 · 2ml，混勻，置4°C2h;
[0095]⑤在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，4 °C作用3 Om i η， 3000rpm離心30分鐘，去上清，沉淀以少許0.02M〇1/L pH7.4PBS溶解，裝入透析袋，以 0.02M〇1/L pH7.4PBS在4°C透析除鹽過夜；
[0096] ⑥次日取出離心，1000 Orpm離心30分鐘以除去不溶物，即得酶-抗體(HRP-IgG)結(jié) 合物，以〇.〇2Mol/L pH 7.4PBS溶至l-2ml;
[0097] ⑦用紫外分光光度計分別測定OD403和OD28q，鑒定合格后將標(biāo)記的IgG-辣根過氧化 物酶加等量甘油，-20 °C保存。
[0098] 1.3 A型口蹄疫病毒抗體檢測方法中各試劑的最佳使用濃度的滴定
[0099]確定A型口蹄疫病毒純化抗原的包被濃度和HRP標(biāo)記的檢測單抗的使用濃度。試驗 所用的酶標(biāo)板為96孔平底微孔板(Costar酶標(biāo)板，高親和性），試驗采用50ul反應(yīng)體系。分別 用pH9.6的Na2OWNaHCO 3緩沖液稀釋純化的A型FMDV抗原包被ELI SA板，4 °C過夜，用pH7.4的 PBST洗板5次，甩干。然后用PBST的2倍系列稀釋的HRP標(biāo)記檢測單抗（1:100,1:150~1: 12800,1:19200)加入ELISA板孔，37°C溫育1小時，洗板后加入TMB底物溶液避光顯色15~ 20min后，用2M H2S〇4終止反應(yīng)，450nm讀取光密度值(0D值），以酶結(jié)合物的OD值達到1.6~ 2.0時試劑的最高稀釋倍數(shù)為其使用濃度。
[0100]各試劑的使用濃度經(jīng)過方陣滴定初步確定，用于后續(xù)的A型口蹄疫病毒抗體檢測 方法。
[01 01 ] 1.4 A型口蹄疫病毒抗體檢測方法試驗步驟
[0102] A型口蹄疫病毒純化抗原用pH 9.6Na2C〇3緩沖液稀釋至使用濃度包被ELISA板，50μ 1/孔，封板或置濕盒內(nèi)，4°C過夜。取出ELISA板，棄去其中液體，用pH 7.4PBST洗板5次，甩 干。用I3BST對待檢血清做起始為1:2的倍比連續(xù)稀釋后50μ1/孔加入ELISA板中。在ELISA板 中立即加入用PBST稀釋的HRP-9A9，50μ1/孔，封板，充分搖振混勻，37 °C孵育Ih。同上洗板5 次，加入底物溶液，50μ1/孔，封板，室溫避光孵育15min。加入終止液，50μ1/孔，終止反應(yīng)，在 酶標(biāo)儀上讀取450nm0D值。
[0103] 2、試驗結(jié)果
[0104] 2.1單克隆抗體腹水的純化及標(biāo)記
[0105]將本發(fā)明制備的單抗9A9腹水，經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨方法純化，紫外分光光度計測 定9六9濃度為7.64mg/ml?？贵w9A9再經(jīng)DEAE-sephadex a_50離子交換層析進一步純化（圖 2)，用改良過碘酸鈉法標(biāo)記HRP。
[0106] 2.2 A型口蹄疫病毒抗體檢測方法的初步建立
[0107] 首先用方陣滴定法初步確定A型口蹄疫病毒抗體檢測系統(tǒng)中A型口蹄疫病毒純化 抗原的包被濃度和HRP-9A9檢測單抗的使用濃度。結(jié)果表明：A型口蹄疫病毒純化抗原的包 被濃度為6.4μg/ml，稀釋倍數(shù)為1:1000; HRP-9A9最適稀釋倍數(shù)為1:1500。
[0108]為了驗證單抗9A9在A型口蹄疫病毒抗體檢測中的診斷價值，用初步建立的A型口 蹄疫病毒抗體檢測方法分別檢測不同稀釋倍數(shù)的A型FMDV強陽性、弱陽性、疑似(臨界值)和 陰性血清，同時設(shè)立0型和Asial型FMDV強陽性血清作為對照，以驗證單抗9A9在A型口蹄疫 病毒抗體檢測方法中與抗原的結(jié)合能力、以及單抗9A9區(qū)分A型口蹄疫病毒陰陽性血清的能 力。用上述檢測結(jié)果繪制強陽性、弱陽性、疑似(臨界值）、陰性血清的抗體滴度曲線;檢測結(jié) 果表明（圖3):單抗9六9在厶型?1?^抗體檢測方法中與A型FMDV的強陽性、弱陽性和疑似血清 呈現(xiàn)良好的競爭能力，而與〇型和Asial型FMDV強陽性血清以及FMDV陰性血清沒有競爭性， 能夠特異性區(qū)分A型FMDV的陰陽性血清，確定了單抗9A9在建立A型口蹄疫病毒抗體檢測方 法中的價值和應(yīng)用潛力。
[0109]實驗例3 A型口蹄疫病毒單克隆抗體中和表位的確定 [0110] 1、試驗方法
[0111] 1.1衣殼蛋白的截短表達
[0112] 根據(jù)FMDV A/JLYS/CHA/2014株衣殼蛋白序列，設(shè)計9對特異性引物，將蛋白分為9 個截短片段進行表達。所有上下游引物均分別引入EcoRI、Xho頂每切切位點。具體引物序列 見（由Invitrogen公司合成)表1。以病毒RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用表1中設(shè)計合成的9 對引物，通過PCR擴增9個截短基因片段，基因片段的分布如表1所示。將酶切后的基因片段 插入pGEX-6p-l的EcoRI和XhoI之間，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，用PstI酶切鑒定重組質(zhì)粒，挑取 單個陽性菌落過夜培養(yǎng)并測序驗證，然后1:100稀釋接種于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37°C震 蕩培養(yǎng)至〇D 6QQnm=0.6，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0. lmmol/L，37°C繼續(xù)培養(yǎng)5h，收集菌體 并用適量的PBS重懸，融合蛋白分別命名為VP1、VP2、VP3、VP1-1、VP1-2、VP1-3、VP1-4、VP1_5 與VP1-6。
[0113]表1用于衣殼蛋白及其截短片段表達的引物序列

[0116] I · 2表位肽的GST融合表達
[0117] 人工合成編碼表位和截短表位DNA的兩條互補寡核苷酸鏈，上游引入EcoRI粘性延 伸末端，下游引入終止密碼子以及XhoI粘性延伸末端，引物序列見表2,將兩條互補鏈直接 退火形成帶粘性末端的雙鏈DNA，插入pGEX-6p-l的EcoRI和XhoI之間，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細 胞，用PstI酶切鑒定重組質(zhì)粒，挑取單個陽性菌落過夜培養(yǎng)并測序驗證，然后1:100稀釋接 種于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D 6QQnm = 0.6,加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為 lmmol/L，37°C繼續(xù)培養(yǎng)5h，收集菌體并用適量的I3BS重懸，融合蛋白分別命名為VP1-5-1至 ￥卩1-5-4、1-14至1-5、2-15至1卜15、1^0〇^1^^此、1?143厶、6144厶、0145厶、1^46厶、6147八、 P148A、L149A、R152A與L153A。
[0118] 表2截短肽及截短突變體編碼DNA的互補寡核苷酸鏈



[0123] 1.3系列表位突變肽的GST融合表達
[0124] 人工合成編碼表位DNA的兩條互補寡核苷酸鏈，上游引入EcoRI粘性延伸末端，下 游引入終止密碼子以及XhoI粘性延伸末端，引物序列見表3。將兩條互補鏈直接退火形成帶 粘性末端的雙鏈DNA，插入pGEX-6p-l的EcoRI和XhoI之間，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，用PstI酶 切鑒定重組質(zhì)粒，挑取單個陽性菌落過夜培養(yǎng)并測序驗證，然后1:100稀釋接種于新鮮的液 體LB培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至00 6〇()1?=0.6，加入誘導(dǎo)劑1?了6至終濃度為1111111〇1/1，37°(：繼 續(xù)培養(yǎng)5h誘導(dǎo)蛋白的表達，收集菌體并用適量的PBS重懸，表達的GST融合蛋白分別命名為 1?〇11^1^^此、1^146卩、1^1461、？1485、？148厶、？1480、？148￥、？1481'、1^153￥、1^153厶和1^1531'。
[0125] 表3表位肽編碼DNA的互補寡核苷酸鏈

[0128] 1.4 SDS-PAGE電泳和Western blot檢測
[0129] SDS-PAGE電泳（15%Tris-glycine)分離各融合蛋白，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上 (90￥，451^11)，用5%脫脂乳-?83封閉液于4°(：封閉過夜，與單抗949于37°(：溫育111，與!11^標(biāo) 記的羊抗鼠 I gG室溫作用I h，DAB (6mg/1 OmL)顯色。
[0130] 1.5體外篩選單抗中和逃逸突變株
[0131] 將病毒與單抗在37°C共同孵育lh，然后將孵育后的病毒以500TCID5Q的接毒量感染 BHK-21細胞，接毒5h后，更換不含單抗的2%血清的DMEM培養(yǎng)，觀察CPE情況。3天后，收獲病 毒，反復(fù)凍融3次后，增加單抗的濃度，再次接種新鮮的BHK-21細胞，經(jīng)過幾輪篩選，當(dāng)病毒 在最高濃度的單抗作用下仍能使細胞出現(xiàn)CPE，即獲得了能夠逃逸單抗的逃逸突變株。親本 毒在沒有單抗的條件下做平行傳代。
[0132] 1.6 抗體檢測 ELISA
[0133] 用上述試驗方法1.3GST融合表達的表位肽作為抗原包被96孔板，加入IOOuL 100 倍稀釋的A型FMDV陽性血清和陰性血清，37°C溫育Ih后洗滌，加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的 羊抗牛IgG抗體，洗滌后加入底物(PD避光顯色IOmin，于波長492nm測定吸光值。
[0134] 2、試驗結(jié)果
[0135] 2.1單抗9A9識別表位的初步定位
[0136] 用單抗9A9對全病毒進行Western blot分析，出現(xiàn)明顯的特異性反應(yīng)條帶（圖4)， 由此認為單抗9A9識別A型FMDV的一個線性表位。
[0137] 對融合表達的VP1、VP2和VP3蛋白進行SDS-PAGE(圖5-a)分離，并以1:1000稀釋的 單抗9A9作為一抗、1: 5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為二抗進行Western blot分析 (圖5-b)，結(jié)果顯示，9A9所識別的表位位于VPl蛋白上。為了進一步定位9A9識別的表位，將 VPl分為6段截短進行融合表達(VP1-1至VP1-6)，SDS-PAGE(圖5-c)和Western blot分析（圖 5-d)顯示，9A9所識別的表位位于VP1-5短肽上。為進一步鑒定單抗9A9識別的表位，以上下 游引物退火形成目的片段為目的設(shè)計4對引物（表2)進行短肽編碼基因的GST融合表達。 SDS-PAGE電泳（圖5-e)與Western blot(圖5-f)分析表明，單抗9A9與VP1-5-1短肽呈現(xiàn)反 應(yīng)，表明單抗9A9識別的表位位于A型FMDV的VPl蛋白的 14t3QNRRGDLGPLAARLA154肽段。
[0138] 2.2單抗9A9識別表位的精確定位
[0139] 為進一步精確鑒定單抗9A9識別的表位，以上下游引物退火形成目的片段為目的 設(shè)計20對引物(表2)，分別從VP1-5-1短肽的N端和C端以1個氨基酸殘基逐步遞減，直到C末 端或N末端剩下5個氨基酸組成的短肽為止，通過GST融合表達、SDS-PAGE電泳（圖6-a)和 Western blot(圖6-b)分析顯示，單抗9A9與N端的1QNRRGDLGPLAARLA15至 4RgdlgplAARLA15以 及c端的2Nrrgdlgplaarl 14發(fā)生特異性結(jié)合，而與其它融合肽以及GST對照均不反應(yīng)。上述結(jié) 果表明，4Rgdlgplaarl 14為單抗9A9識別表位的反應(yīng)活性單元，即單抗9A9識別的表位肽。
[0140] 2.3 9A9識別表位的關(guān)鍵氨基酸
[0141] 為進一步了解單抗9A9識別表位的各個氨基酸殘基在與單抗結(jié)合過程中所起的作 用，以9A9表位4Rgdlgplaarl 14為基礎(chǔ)，用丙氨酸(A)從N端至c端逐個進行氨基酸替換(表4)， RGDLGPLAARL作為陽性對照、GST空載體作為陰性對照。
[0142] 表4用于本發(fā)明的合成肽及其氨基酸序列
[0145] 注:3 口蹄疫病毒 A/⑶ MM/CHA/13 株 VPl 的 143 ~153aa 肽
[0146] b突變位點氨基酸均加粗并用下劃線標(biāo)出，部分殘基用丙氨酸(A)替換
[0147] 經(jīng)SDS-PAGE(圖7-a)與Western blot分析（圖7-b)表明，在9A9所識別表位的氨基 酸序列中，Gly147、Leu149為關(guān)鍵氨基酸，Arg143Xly 144 ^叩145、？仰148^找152和1^1!153為重要氨 基酸，Leu 146對表位活性無影響。
[0148] 經(jīng)過4輪的單抗9A9加壓篩選，在最高濃度單抗的作用下病毒感染細胞出現(xiàn)CPEJP 確定為病毒能夠逃逸中和單抗產(chǎn)生了中和表位突變株。將獲得的可以完全逃逸單抗9A9的 突變株經(jīng)RNA提取、RT-PCR擴增和測序分析發(fā)現(xiàn)，突變株在VPl的446位堿基發(fā)生T到C的替 換，從而導(dǎo)致149位氨基酸由亮氨酸(Leu)突變?yōu)楦彼?Pro)，這與9A9識別表位鑒定中發(fā) 現(xiàn)的Leu149為關(guān)鍵氨基酸（圖7-b)的結(jié)果相一致，再次證明Leu149是單抗9A9識別表位的關(guān)鍵 氨基酸，是單抗9A9結(jié)合表位的關(guān)鍵位點。
[0149] 2.4 9A9表位是A型FMDV各基因型毒株的保守性表位
[0150] 為驗證9A9表位的保守性，選取了GenBank收錄的753條A型FMDV的VPl氨基酸序 列一(其中包含血清A型FMDV三種拓撲型的毒株)進行比對分析見圖8,結(jié)果顯示，9A9表位氨 基酸序列在A型FMDV毒株之間是高度保守的。序列比對中發(fā)現(xiàn)，該表位序列中突變最多的是 Pro148 與 Leu153,其中 Pro148 可突變?yōu)?561~41&、6111、￥31或11^，1^11153可突變?yōu)椋?1^13或11^; 而Gly147和Leu149作為本發(fā)明鑒定的9A9表位關(guān)鍵氨基酸，在所有的發(fā)表序列中均是保守的。 在鑒另U9A9識別表位關(guān)鍵氨基酸的試驗中（圖7-b)發(fā)現(xiàn)，Arg 143、Gly144、ASp145、Pr〇 148、Arg152 和Leu153為9A9表位的重要氨基酸，其突變可使表位活性呈現(xiàn)一定程度的下降。這些結(jié)果表 明，9A9表位是A型FMDV的一個線性保守性中和表位。
[0151 ]實驗例4單抗9A9識別抗原表位及其突變體與A型口蹄疫病毒抗體陽性血清的特異 性反應(yīng)實驗
[0152]上述研究已經(jīng)鑒定了單抗9A9所識別的表位肽為143Rgdlgplaarl153。為了確定單抗 9A9所針對的抗原表位能否作為診斷抗原來檢測A型口蹄疫病毒抗體陽性血清，首先將9A9 識別的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL(其氨基酸序列為SEQ ID NO:2)進行定 點誘變= Leu146突變?yōu)镻he(F)或Met(M) ;Pro148突變?yōu)?61~41&、6111、￥31或11^;1^11153突變?yōu)?Val、Ala或Thr，這些突變肽以GST融合的方式表達，分別命名為L146F(其氨基酸序列為SEQ ID N0:3)、L146M(其氨基酸序列為SEQ ID N0:4)、P148S(其氨基酸序列為SEQ ID N0:5)、 P148A(其氨基酸序列為SEQ ID N0:6)、P148Q(其氨基酸序列為SEQ ID N0:7)、P148V(其氨 基酸序列為SEQ ID N0:8)、P148T(其氨基酸序列為SEQ ID N0:9)、L153V(其氨基酸序列為 SEQ ID NO: 10)、L153A(其氨基酸序列為SEQ ID NO: 11)和L153T(其氨基酸序列為SEQ ID NO: 12)。然后，將這些GST融合的表位肽作為抗原分別包被ELISA板，檢測A型FMDV陽性和陰 性血清，同時設(shè)立0型和Asial型FMDV陽性血清作為對照，以檢測單抗9A9識別的A型FMDV中 和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL及其突變體與A型口蹄疫病毒抗體的反應(yīng)能力，由此評價 9A9識別的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL在A型口蹄疫診斷中的價值。
[0153] 實驗結(jié)果表明（圖9):單抗9A9識別的A型FMDV中和表位肽及其系列表位突變肽 (1^146卩、1^1461、？1485、？148厶、？1480、？148￥、？1481'、1^153￥、1^153厶與1^1531')與厶型卩]\〇^的陽性 血清呈現(xiàn)良好的反應(yīng)能力，而與0型和Asial型FMDV陽性血清以及A型FMDV陰性血清沒有反 應(yīng)，表明本發(fā)明所確定的中和表位肽及其系列表位突變肽能夠特異性區(qū)分A型FMDV的陰陽 性血清。這些檢測結(jié)果與9A9識別表位鑒定過程中發(fā)現(xiàn)的Arg 143、Gly144、ASp145、Pr〇 148、Arg152 和Leu153為重要氨基酸以及Leu146對表位活性無影響的結(jié)果相一致（圖7-b)，進一步驗證了 單抗9A9識別的A型FMDV中和表位的氨基酸序列RGDLGPLAARL及其系列表位突變肽對于建立 A型口蹄疫診斷方法的價值和應(yīng)用潛力。
【主權(quán)項】
1. A型口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus)單克隆抗體識別的中和表位，其 特征在于:所述中和表位的氨基酸序列為SEQ ID N0:1所示，其中，心為任意一種氨基酸;X2 *Pro、Ser、Ala、Gln、Val^Thr;X3*Leu、Val、AlaSThr〇2. 按照權(quán)利要求1所述的中和表位，其特征在于:所述的XiSLeu。3. 按照權(quán)利要求1所述的中和表位，其特征在于:所述的X2為Pro。4. 按照權(quán)利要求1所述的中和表位，其特征在于:所述的X3為Leu。5. 按照權(quán)利要求1所述的中和表位，其特征在于:所述中和表位的氨基酸序列為SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、 SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:llSSEQIDN0:12m*。6. 權(quán)利要求1-5任意一項所述的中和表位在制備診斷A型口蹄疫的試劑或藥物中的用 途。7. 權(quán)利要求1-5任意一項所述的中和表位在制備預(yù)防或治療A型口蹄疫的試劑或藥物 中的用途。8. 按照權(quán)利要求7中所述的用途，其特征在于：所述的藥物還包括藥學(xué)上可接受的佐 劑。9. 一種用于診斷A型口蹄疫病毒的ELISA試劑盒，包括:用于包被酶標(biāo)記抗原的檢測板、 稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液、酶標(biāo)記的抗原、酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG、陽性對照血清和陰性 對照血清，其特征在于:所述的抗原為權(quán)利要求1-5任意一項所述的中和表位。10. 按照權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于:所述的酶為辣根過氧化物酶;所述的稀 釋液為PH9.6的Na2C0 3/NaHC03緩沖液;所述的洗滌液為pH7.4的PBST;所述的顯色液為(PD底 物溶液;所述的終止液為2M H2S04;所述的陽性對照血清為A型口蹄疫病毒陽性血清;所述的 陰性對照血清為A型口蹄疫病毒陰性血清。
【文檔編號】G01N33/569GK105859842SQ201610183394
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月28日
【發(fā)明人】于力, 周國輝, 王海偉, 楊德成
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所