膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗原肽和融合蛋白以及其組合物和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種靶向CETP的細(xì)胞外形式，但不靶向CETP的細(xì)胞內(nèi)形式的抗原肽，用于降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物)的水平并且增加HDL的水平。因此，本發(fā)明提供一種CETP疫苗，其用于克服CETP的低免疫原性和CETP活性的長期抑制，以便預(yù)防或治療oxLDL或其它LDL衍生物相關(guān)疾病/癥狀。
【專利說明】
膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抗原肽和融合蛋白以及其組合物和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于選擇性抑制血漿膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP)，但不抑制細(xì)胞膽 固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抗原肽、一種包含所述抗原肽的融合蛋白以及一種用于引發(fā)CETP抗體來 降低LDL水平并且增加 HDL水平的方法。具體來說，所述抗原肽是來源于CETP的B細(xì)胞表位。
【背景技術(shù)】
[0002] HDL因?yàn)槠渌脚c心血管疾病的風(fēng)險呈負(fù)相關(guān)而持續(xù)受到關(guān)注。這種負(fù)相關(guān)性可 以歸因于其不同的潛在抗動脈粥樣硬化特性，例如逆向膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)、抗炎性、抗氧化以及抗 血栓作用。臨床研究已經(jīng)顯示，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中也發(fā)現(xiàn)了低HDL-C JASH與 動脈粥樣硬化共享若干特征，包括脂質(zhì)累積、炎癥以及巨噬細(xì)胞浸潤。NASH的發(fā)病機(jī)制涉及 清道夫受體介導(dǎo)ox-LDL在肝臟中被巨噬細(xì)胞吸收。
[0003] 膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP)被認(rèn)為是用于增加 HDL-C的治療目標(biāo)。由于在攜帶純合 缺陷型CETP基因的日本人中觀察到了高HDL-C和低LDL-C，這些日本人盡管患有高膽固醇血 癥，但是未顯示出早熟性動脈粥樣硬化的跡象，所以開始關(guān)注CETP作為治療目標(biāo)。這種CETP 主要結(jié)合到HDL粒子并且將膽固醇酯從HDL轉(zhuǎn)移到富含三酸甘油酯的脂蛋白。CETP活動導(dǎo)致 非HDL脂蛋白的CE富集，這會造成動脈粥樣硬化。處于不同臨床發(fā)展階段的小分子CETP抑制 劑抑制CETP活性并且顯著增加 HDL-C，所述抑制劑包括達(dá)塞曲匹（dalcetrapib)、伊特普 (6￥3061：抑口；[13)和安特普(31^061：抑口；[13)。然而，托徹普（1：01^61：抑口；[13)在3期臨床試驗(yàn)中由 于化合物特異性脫靶效應(yīng)而失敗，并且達(dá)塞曲匹在3期臨床試驗(yàn)中由于不太有意義的結(jié)果 而失敗。其它兩種CETP抑制劑伊特普和安特普還在臨床試驗(yàn)中。誘導(dǎo)針對特異性自體肽的 免疫反應(yīng)可能有益于治療某些疾病?；陔牡拿庖叩娜秉c(diǎn)包括自體肽的低免疫原性、化學(xué) 結(jié)合的低效率以及抗原制劑的不均勻性質(zhì)。
[0004] US 7074407 Bl提供了一種用于通過刺激抑制CETP功能的免疫反應(yīng)來增加哺乳動 物體內(nèi)的HDL膽固醇的方法。US 6284533 Bl提供了一種基于質(zhì)粒的疫苗，所述疫苗基于編 碼膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP)的一或多個B細(xì)胞表位和一或多個大范圍輔助T細(xì)胞表位的DNA 片段的組合。US20090104211提供了一種CETP模擬表位，其氨基酸序列完全不同于CETP或 CETP片段的氨基酸序列。US 6410022 Bl涉及肽，所述肽包含輔助T細(xì)胞表位部分和用于引 發(fā)針對內(nèi)源性膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CETP)活性的免疫反應(yīng)的B細(xì)胞表位部分，用于預(yù)防或治 療心血管疾病，例如動脈粥樣硬化。W02014003531提供了一種由CETP肽免疫原的羧基末端 組成的膠束納米粒子的新穎疫苗組合物，用于鼻內(nèi)投藥以便治療和/或預(yù)防由循環(huán)脂質(zhì)的 異常代謝引起的動脈粥樣硬化疾病或非酒精性脂肪肝。雖然研發(fā)出了大量抗原，但是其免 疫原性和效率仍然不夠。
[0005] 因此，仍然存在研發(fā)具有優(yōu)越免疫原性的CETP肽免疫原的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及產(chǎn)生選擇性抑制血漿CETP的活動以通過降低LDL(包括oxLDL和LDL的 其它衍生物)的水平并且增加 HDL的水平來產(chǎn)生健康益處的療法。治療性組合物中的一種是 有效疫苗，其中至少五個一致B細(xì)胞表位被安排為用于活化B細(xì)胞的串聯(lián)重復(fù)序列。本發(fā)明 還涉及呈串聯(lián)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)形式的多價抗原和其用于研發(fā)針對CETP的對健康有益的疫苗 的用途。
[0007] 本發(fā)明提供一種用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)分離抗原肽，其包含由PEHLLVDFLQSL (SEQ ID NO: 1)組成的氨基酸序列的至少一個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。經(jīng)分 離抗原肽的實(shí)施例包括(但不限于）以下各者:包含氨基酸序列SEQ ID N0:1的至少兩個、三 個、四個或五個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽的經(jīng)分離抗原肽;包含2個到10 個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽的經(jīng)分離抗原肽;包含4個到8個重復(fù)序列或 其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽的經(jīng)分離抗原肽。優(yōu)選地，經(jīng)分離抗原肽包含5個到7個重 復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。更優(yōu)選地，經(jīng)分離抗原肽包含6個重復(fù)序列或其 用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。
[0008] 本發(fā)明還提供一種用于引發(fā)CETP抗體的抗原融合蛋白，其包含如下抗原融合蛋 白，所述抗原融合蛋白包含融合到用于通過抗原遞呈細(xì)胞(APC)增加吸收的結(jié)構(gòu)域的本發(fā) 明抗原肽或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，用于通過抗原遞呈細(xì) 胞(APC)增加吸收的結(jié)構(gòu)域選自包括以下的群組：IgG的Fc片段、IgM的Fc片段和IgA的Fc片 段。優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)域是IgG的Fc片段。更優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)域是人類或兔IgG的Fc片段。
[0009] 本發(fā)明還提供一種治療劑，所述治療劑通過選擇性抑制血漿CETP，但不抑制細(xì)胞 CETP來降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物）的水平并且增加 HDL的水平。在一個實(shí)施例 中，所述治療劑是結(jié)合到本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白的抗體。在一些實(shí)施例中， 所述抗體是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種藥劑或組合物，其包含本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合 蛋白或抗體。在一個實(shí)施例中，所述藥劑或組合物是疫苗組合物。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于引發(fā)或活化個體體內(nèi)的CETP抗體的方法，其包含向所 述個體投與有效量的本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白。所引起的CEPT抗體靶向CETP 的細(xì)胞外形式，但不靶向CETP的細(xì)胞內(nèi)形式，以便降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物） 的水平并且增加 HDL的水平。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白 或抗體用于制造醫(yī)藥的用途，所述醫(yī)藥用于引發(fā)或活化個體體內(nèi)的CETP抗體。
[0012] 在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于降低個體體內(nèi)的LDL水平并且增加 HDL水平 的方法，所述方法包含向所述個體投與有效量的本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白或 抗體。因此，本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防oxLDL或LDL衍生物相關(guān)疾病的方法，所述方法 包含向所述個體投與有效量的本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體。另一方面， 本發(fā)明提供本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體用于制造醫(yī)藥的用途，所述醫(yī)藥 用于降低個體體內(nèi)的LDL水平并且增加 HDL水平。此外，本發(fā)明提供本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽 或抗原融合蛋白或抗體用于制造醫(yī)藥的用途，所述醫(yī)藥用于治療或預(yù)防個體內(nèi)oxLDL或LDL 衍生物相關(guān)疾病。
【附圖說明】
[0013] 圖I(A)及(B)示出了Fc-CETP6疫苗的制備。（A)Fc-CETP6的示意圖。（B)接頭PCR的產(chǎn) 物。（C)經(jīng)His標(biāo)記的Fc-CETP6免疫原的純度。
[0014] 圖2(A)及(B)示出了抗CETP抗體在用Fc-CETP6免疫的兔體內(nèi)的表征（實(shí)驗(yàn)Ih(A) 針對CETP的血漿抗體滴度。（B)血漿CETP活性。
[0015] 圖3(A)至(E)示出了，用FC-CETP6進(jìn)行疫苗接種減少了主動脈病變和炎癥（實(shí)驗(yàn) 1)。(A)在第24周結(jié)束時，代表性蘇丹(Sudan) IV染色的主動脈樣本。（B)主動脈病變面積的 定量。（C)來自正常兔、對照兔和Fc-CETP6兔的主動脈的NF-kB和RAM-Il (放大倍數(shù)，X 200) 的表達(dá)。（D)主動脈的RAM-11和NF-kB陽性面積的定量。
[0016] 圖4(A)至(E)示出了用Fc-CETP6進(jìn)行疫苗接種減弱了高HFC飲食誘發(fā)的脂肪變性 和NASH。（A)、（B)用H&E染色的代表性肝臟切片（放大倍數(shù)，X 200)。（C)來自對照兔和Fc-CETP6兔的肝臟的RAM-11 (放大倍數(shù)，上圖X 100并且下圖X 400)的表達(dá)。（D)來自對照兔和 Fc-CETP6兔的肝臟的NF-κΒ(放大倍數(shù)，上圖X 100并且下圖X400)的表達(dá)。（E)對照兔（黑 條)和Fc-CETP6兔（白條)體內(nèi)的炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。
[0017]圖5(A)及(B)示出了，用FC-CETP6進(jìn)行疫苗接種減少了炎癥相關(guān)基因和纖維化相 關(guān)基因表達(dá)譜(實(shí)驗(yàn)2) JA)用馬森三色染色(Masson's trichrome stain)進(jìn)行染色和針對 活化的星形細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的代表性肝臟切 片。（B)對照兔(黑條)和FC-CETP6兔（白條)體內(nèi)的纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 本發(fā)明至少部分地基于靶向CETP的細(xì)胞外形式，但不靶向CETP的細(xì)胞內(nèi)形式的抗 原肽來降低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物）的水平和增加 HDL的水平。因此，本發(fā)明提 供一種CETP疫苗，其用于克服CETP的低免疫原性和CETP活性的長期抑制，以便預(yù)防或治療 oxLDL或其它LDL衍生物相關(guān)疾病/癥狀。
[0019] 定義
[0020] 在以下描述中，使用了大量術(shù)語并且提供以下定義來促進(jìn)對所要求的主題的理 解。在本文中未進(jìn)行明確定義的術(shù)語根據(jù)其常見的和普通的含義使用。
[0021] 應(yīng)注意，除非上下文另外清楚地指示，否則如本說明書和所附權(quán)利要求書中所用， 單數(shù)形式"一個/ 一種(a/an)"和"所述(the)"包括多個指示物。因此，舉例來說，對"一個肽" 的提及包括兩個或兩個以上這類肽的混合物等。
[0022] 如本文中所用，除非另外說明，否則使用"或"意味著"和/或"。在多項(xiàng)從屬權(quán)利要 求的情況下，使用"或"只能以擇一的方式引用前述獨(dú)立權(quán)利要求或從屬權(quán)利要求。
[0023]應(yīng)注意，在本發(fā)明中并且尤其是在權(quán)利要求書和/或段落中，例如"包含 (comprises)"、"包含（comprised)"、"包含（comprising)" 等術(shù)語可以意指"包括 (includes)"、"包括（included)"、"包括（including)"等；并且例如"基本上由......組成 (consisting essentially of)"和"基本上由......組成（consists essentially of)"的術(shù) 語考慮到未明確敘述的要素，但不包括現(xiàn)有技術(shù)中所發(fā)現(xiàn)的或影響本發(fā)明的基本或新穎特 征的要素。
[0024]如本文中所用，當(dāng)術(shù)語"經(jīng)分離"提及多肽時，意指所指示的分子與天然存在所述 分子的整個生物體分離并且獨(dú)立，或存在所述分子，但基本上不存在相同類型的其它生物 大分子。術(shù)語"經(jīng)分離"就多核苷酸來說是完全或部分不含通常在自然界中與其有關(guān)的序列 的核酸分子;或以其天然狀態(tài)存在，但具有與其相連的異源序列的序列;或從染色體脫離下 來的分子。
[0025] 如本文中所用，術(shù)語"抗原"是指含有表位(線性表位、構(gòu)象表位或兩者）的分子，例 如蛋白質(zhì)、多肽或其片段，所述表位將刺激宿主的免疫系統(tǒng)作出體液和/或細(xì)胞抗原特異性 反應(yīng)。所述術(shù)語可與術(shù)語"免疫原"互換地使用。例如抗獨(dú)特型抗體（ant i-idiotype antibody)或其片段的抗體以及可以模擬抗原或抗原決定簇的合成肽模擬表位也包括在如 本文中所用的抗原的定義中。類似地，體內(nèi)表達(dá)抗原或抗原決定簇(例如在DNA免疫應(yīng)用中） 的寡核苷酸或多核苷酸也包括在本文中的抗原的定義中。
[0026] 如本文中所用，術(shù)語"表位"泛指抗原上由T細(xì)胞受體和/或抗體識別的位點(diǎn)。優(yōu)選 地，其為來源于蛋白質(zhì)抗原或作為蛋白質(zhì)抗原的一部分的短肽。單個抗原分子可以攜帶若 干不同表位。術(shù)語"表位"還包括刺激識別整個生物體的反應(yīng)的經(jīng)修飾的氨基酸序列。
[0027] 如本文中所用，"免疫原性"蛋白質(zhì)、多肽或肽意指包括一或多個表位并且因此可 以調(diào)變免疫反應(yīng)的分子。這類肽可以使用任何數(shù)量的本領(lǐng)域中眾所周知的表位作圖技術(shù)來 鑒別。例如表位作圖方案（Epitope Mapping Protocols)分子生物學(xué)方法（Methods in Molecular Biology)，第66卷(格倫Ε·莫里斯(Glenn E.Morris)編，1996)胡馬納出版社 (Humana Press)，新澤西州特圖瓦市（Totowa，N.J.)。
[0028] 如本文中所用，對組合物或疫苗的"免疫反應(yīng)"是在宿主體內(nèi)發(fā)展出對相關(guān)組合物 或疫苗的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。通常，"免疫反應(yīng)"包括(但不限于）以下作用中的 一或多者:產(chǎn)生特異性地針對相關(guān)組合物或疫苗中所包括的抗原的抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞 和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主將展現(xiàn)治療性或保護(hù)性免疫反應(yīng)，使得對新感染的抗性 將得到增強(qiáng)和/或疾病的臨床嚴(yán)重程度下降。所述保護(hù)將通過以下得到證實(shí):被感染的宿主 通常所展現(xiàn)的癥狀和/或臨床疾病征象減少或缺乏、恢復(fù)時間加快和/或被感染的宿主體內(nèi) 的病毒滴度降低。
[0029] 如本文中所用，術(shù)語"肽"是指氨基酸殘基通過肽鍵彼此連接的聚合物分子。
[0030]術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)"是指氨基酸殘基的聚合物并且不限于產(chǎn)物的最小長度。因 此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在所述定義內(nèi)。全長蛋白質(zhì)和其片段均由所述定義涵 蓋。所述術(shù)語還包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙?；?、磷酸化等。此外，出于本發(fā)明 的目的，"多肽"是指包括對天然序列的修飾的蛋白質(zhì)，所述修飾例如缺失、添加和取代，只 要蛋白質(zhì)維持所要活性即可。這些修飾可以是故意的，如通過定點(diǎn)誘變;或可以是偶然的， 例如通過產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)的宿主的突變或由于PCR擴(kuò)增所引起的錯誤。
[0031] 如本文中所用，術(shù)語"疫苗"可與"免疫保護(hù)性組合物"互換地使用并且是指在接種 到宿主生物體內(nèi)后可以誘導(dǎo)出針對病原體的完全或部分免疫性或可以減少與病原體相關(guān) 的疾病的影響的免疫原。
[0032] 如本文中所用，術(shù)語"病狀"、"疾病"、"癥狀"和"病癥"可互換地使用。
[0033] 如本文中所用的術(shù)語"投與（administer)"、"投與（administering)"或"投與 (administration)"是指將本發(fā)明的藥劑或其藥物組合物吸收、攝入、注射、吸入或以其它 方式引入個體體內(nèi)或個體上。
[0034]如本文中所用，"治療有效量"意指免疫原/抗原/表位將誘導(dǎo)出免疫反應(yīng)的量。 [0035]如本文中所用，術(shù)語"預(yù)防（prevent)"、"預(yù)防（preventing)"和"預(yù)防 (prevention)"是指預(yù)防疾病或病癥或其一或多種癥狀的發(fā)作、復(fù)發(fā)或擴(kuò)散。在某些實(shí)施例 中，所述術(shù)語是指在存在或不存在一或多種其它額外活性劑的情況下，在癥狀發(fā)作之前，尤 其是對有本文中所提供的疾病或病癥的風(fēng)險的患者來說，用抗原或蛋白質(zhì)或抗體治療或投 與抗原或蛋白質(zhì)或抗體。所述術(shù)語涵蓋特定疾病的癥狀的抑制或減少。在這點(diǎn)上，術(shù)語"預(yù) 防"可以與術(shù)語"預(yù)防性治療"互換地使用?！?br>[0036] 如本文中所用，術(shù)語"個體"被定義為包括動物，例如哺乳動物，包括(但不限于)靈 長類動物(例如，人類）、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠等。在特定實(shí)施例中，個體 是人類。術(shù)語"個體"和"患者"在本文中在例如提及哺乳動物個體(例如人類)時可互換地使 用。
[0037] 抗原肽和抗原融合蛋白
[0038] -方面，本發(fā)明提供一種用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)分離抗原肽，其包含由 PEHLLVDFLQSL(SEQ ID N0:1)組成的氨基酸序列的至少一個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗 體的經(jīng)修飾肽。
[0039]在一個實(shí)施例中，經(jīng)分離抗原肽包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1的至少兩個、三個、 四個或五個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。在一些實(shí)施例中，經(jīng)分離抗原肽 包含2個到10個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。在另一個實(shí)施例中，經(jīng)分離抗 原肽包含4個到8個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。優(yōu)選地，經(jīng)分離抗原肽包 含5個到7個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。更優(yōu)選地，經(jīng)分離抗原肽包含6個 重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。
[0040]另一方面，本發(fā)明提供一種用于引發(fā)CETP抗體的抗原融合蛋白，其包含融合到用 于通過抗原遞呈細(xì)胞(APC)增加吸收的結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明抗原肽或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng) 修飾蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，用于通過抗原遞呈細(xì)胞(APC)增加吸收的結(jié)構(gòu)域選自包括以 下的群組：IgG的Fc片段、IgM的Fc片段和IgA的Fc片段。在另一個實(shí)施例中，所述結(jié)構(gòu)域是 IgG的Fc片段。優(yōu)選地，所述結(jié)構(gòu)域是人類或兔IgG的Fc片段。
[0041 ]人類IgG的Fc片段的多核苷酸序列（SEQ ID N0:2):
[0042] atggcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccg gacccctgaggtcacatgc
[0043] gtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgc caagacaaagccgcgg
[0044] gaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaagga gtacaagtgcaaggtctc
[0045] caacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtaca ccctgcccccatcccg
[0046] ggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagt gggagagcaatgggcag
[0047] ccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgt ggacaagagcaggtggca
[0048] gcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgt ctccgggtaaaggatcccct
[0049] tgttgtggatgctgcggttgcggatgcccttgttgtggatgctgcggttgcggatgcccttgttgtggatgctgcgg ttgcggatgcccttgttgtggatg
[0050] ctgcggttgcggatgcccttgttgtggatgctgcggttgcggatgcccttgttgtggatgctgcggttgcggatgcc cttgttgtggatgctgcggttgc
[0051 ] ggatgcaagcttcatcaccaccatcaccatgagctteatcatcatcatcatcattaa
[0052] 人類IgG的Fe片段的多肽序列（SEQ ID N0:3):
[0053] MAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV SVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEff ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGSPCCGCCGCGC PCCGCCGCGCPCCGCCGCGCPCCGCCGCGCPCCGCCGCG CPCCGCCGCGCPCCGCCGCGCKLHHHHHHELHHHHHH stop
[0054] 兔IgG的Fe片段的多核苷酸序列（SEQ ID N0:4):
[0055] gccccctcgacaagc agcaagcccacgt gcccaccccc tgaactcctg gggggaccgt ctgtcttcat
[0056] cttccccccaaaacccaagg acaccctcat gatctcacgc acccccgagg tcacatgcgt ggtggtggacgtgagccagg atgaccccga
[0057] ggtgcagttc acatggtaca taaacaacga gcaggtgcgcaccgcccggc cgccgctacg ggagcagcag ttcaacagca cgatccgcgt
[0058] ggtcagcaccctccccatca cgcaccagga ctggctgagg ggcaaggagt tcaagtgcaa agtccacaac cgagaaaacc atctccaaag
[0059] ccagagggca gcccctggagccgaaggtct acaccatggg ccctccccgg gaggagctga gcagcaggtc ggtcagcctgacctgcatga
[0060] tcaacggctt ctacccttcc gacatctcgg tggagtggga gaagaacgggaaggcagagg acaactacaa gaccacgccg gccgtgctgg
[0061 ] acagcgacgg ctcctacttcctctacaaca agctctcagt gcccacgagt gagtggcagc ggggcgacgt cttcacctgctccgtgatgc
[0062] acgaggcctt gcacaaccac tacacgcaga agtccatctc ccgctctccgggtaaa
[0063] 兔IgG的Fe片段的多肽序列（SEQ ID N0:5):
[0064] APSTSSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMIS RTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLRE QQFNSTIRVVSTLPITHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPI EKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMING FYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYNKL SVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGKGS PCCGCCGCGCPCCGCCGCGCPCCGCCGCGCPCCGCCGCG CPCCGCCGCGCPCCGCCGCGCPCCGCCGCGCKLRSGHHH HHHGRSGHHHHHHG
[0065] 在一些實(shí)施例中，抗原融合蛋白包含融合到包含至少兩個、三個、四個或五個氨基 酸序列SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的Fe片段或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。在 一些實(shí)施例中，抗原融合蛋白包含融合到包含2個到10個氨基酸序列SEQ ID NO: 1的線性重 復(fù)序列的Fe片段或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。在另一個實(shí)施例中，抗原融合蛋 白包含融合到包含4個到8個氨基酸序列SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的Fe片段或其用于引 發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，抗原融合蛋白包含融合到包含5個到7個氨基酸序列 SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的Fe片段或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地， 抗原融合蛋白包含融合到包含6個氨基酸序列SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的Fe片段(Fc-CEPT6)或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，抗原融合蛋白包含融合 到包含6個氨基酸序列SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的兔IgG的Fe片段(rFc-CETP6)，或融合 到包含6個氨基酸序列SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的人類IgG的Fe片段(hFc-CETP6)。所述 rFc-CETP6及hFc-CETP6的多核苷酸序列描述如下。
[0066] hFc-CETP6的多核苷酸序列（SEQ ID N0:6h_
[0067] CATOTG GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGAC CCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCG TGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACC GTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGA GAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGA CCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAAT GGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACT ACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA GGATCC
[0068] CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC AAGCTT \GA TCA GGT CAT CAT CAC CAC CAT CAC GGT AGA TCA GGT CAT CAT CAC CAC CAT CAC GGT TAA GAATTC
[0069] 粗體:限制酶切位
[0070] rFc-CETP6的多核苷酸序列（SEQ ID N0:7h_
[0071] CATATG GCCCCCTCGACAAGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCC AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACC CCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTC AACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCACGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAA AGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGG TCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTAC CCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGA CAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAACAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCT GCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAA6GATCC
[0072] CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGC CCT TGT TGT GGA TGC TGC GGT TGC GGA TGCAAGCTT AGA TCA GGT CAT CAT CAC CAC CAT CAC GGT AGA TCA GGT CAT CAT CAC CAC CAT CAC GGT TAA GAATTC
[0073] 粗體:限制酶切位
[0074] 因此，所述抗原融合蛋白包含由SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:7編碼的序列。
[0075] -般來說，我們知道，肽中一或多個氨基酸的修飾不影響肽的功能，或在一些情況 下，甚至增強(qiáng)初始蛋白質(zhì)的所要功能。實(shí)際上，已經(jīng)知道，經(jīng)修飾肽（即，由通過使初始參考 序列取代、缺失、插入或添加一個、兩個或若干個氨基酸殘基來加以修飾的氨基酸序列組成 的肽)保留了初始肽的生物活性（馬克(Mark)等人，美國國家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad Sci USA) 1984，81:5662-6 ;佐勒（ZolIer)和史密斯（Smith)，核酸研究（Nucleic Acids Res) 1982，10:6487-500;達(dá)爾巴蒂?麥克法蘭(Dalbadie-McFarland)等人，美國國家科學(xué) 院院刊1982，79:6409-13)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，本發(fā)明的用于引發(fā)CETP抗體的 抗原肽包含由SEQ ID NO: 1組成的氨基酸序列的至少一個重復(fù)序列，在所述序列中，添加、 缺失、插入和/或取代了一個、兩個或甚至更多個氨基酸。
[0076] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，對氨基酸序列所作的更改單個氨基酸或整個氨 基酸序列的一小部分的單獨(dú)修飾(即，缺失、插入、添加或取代)促成了初始氨基酸側(cè)鏈的特 性的保守；因此，其被稱為"保守取代"或"保守修飾"，其中蛋白質(zhì)的更改產(chǎn)生了具有類似功 能的蛋白質(zhì)。提供功能上類似的氨基酸的保守取代表在本領(lǐng)域中眾所周知。氨基酸側(cè)鏈特 性的實(shí)例是疏水性氨基酸以、1^小、？、1、￥、￥)、親水性氨基酸(1?、0川、(：4、〇、6、!1、1(、3、1') 以及具有以下官能團(tuán)或共同特征的側(cè)鏈:脂肪族側(cè)鏈(G、A、V、L、I、P);含羥基側(cè)鏈(S、T、Y); 含硫原子側(cè)鏈(C、M);含羧酸和酰胺的側(cè)鏈(D、N、E、Q);含堿基側(cè)鏈(R、K、H);以及含芳香族 基的側(cè)鏈(H、F、Y、W)。這類經(jīng)保守修飾的肽也被認(rèn)為是本發(fā)明的抗原肽。然而，本發(fā)明肽不 限于這些并且可以包括非保守修飾，只要所得經(jīng)修飾肽保留初始未修飾肽的CETP抗體引發(fā) 功能即可。
[0077] 本發(fā)明的抗原肽或抗原融合蛋白可以使用眾所周知的技術(shù)制備。舉例來說，所述 肽或蛋白質(zhì)可以通過重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成，以合成方式制備。本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)可以 單獨(dú)地或以包括兩個或兩個以上肽的較長多肽形式合成。所述肽或蛋白質(zhì)可以經(jīng)分離，即 經(jīng)純化或經(jīng)分離成基本上不含其它天然存在的宿主細(xì)胞蛋白和其片段或任何其它化學(xué)物 質(zhì)。
[0078] 本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)可以通過肽或蛋白質(zhì)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的若干技術(shù) 中的任一種進(jìn)行化學(xué)合成。一般來說，這些方法采用向正在生長的肽鏈依序添加一或多個 氨基酸。通常，通過合適的保護(hù)基保護(hù)第一個氨基酸的氨基或羧基。然后可以通過在允許形 成酰胺鍵的條件下，在具有互補(bǔ)基團(tuán)（氨基或羧基）的適當(dāng)?shù)丶右员Ｗo(hù)的序列中添加下一個 氨基酸，使被保護(hù)或衍生的氨基酸連接到惰性固體載體或用于溶液中。然后去除新添加的 氨基酸殘基的保護(hù)基并且然后添加下一個氨基酸(適當(dāng)?shù)丶右员Ｗo(hù)），以此類推。在已經(jīng)按 恰當(dāng)序列連接所要氨基酸之后，依序或并行地去除任何其余保護(hù)基(和任何固體載體，如果 使用了固相合成技術(shù)），得到最終多肽。通過簡單修改這個通用程序，有可能一次性向生長 鏈添加一個以上氨基酸，例如通過使受保護(hù)的三肽與恰當(dāng)?shù)丶右员Ｗo(hù)的二肽偶合(在不會 使手性中心外消旋的條件下），從而在脫除保護(hù)基之后形成五肽。參見例如J.M.斯圖爾特 (J.M.Stewart)和J.D.楊（J.D.Young),固相肽合成（Solid Phase Peptide Synthesis)(皮 爾斯化學(xué)公司(Pierce Chemical Co.)，伊利諾斯州羅克福德(Rockford, 111. )1984);以及 G.巴拉尼（G.Barany)和R.B.梅里菲爾德（R.B.Merrif ield)，肽：分析、合成、生物學(xué)（The Peptides: Analysis，Syn thesis，Biology),編者 Ε·格羅斯（Ε· Gr oss)和 J.門恩費(fèi)爾 (J.Meienhofer)，第2卷，（學(xué)術(shù)出版社（Academic Press)，紐約（New York)，1980)，第3-254 頁，關(guān)于固相肽合成技術(shù)；以及Μ.博丹斯基（M. Bodansky)，肽合成原理（PrincipIes of Peptide Synthesis)，（施普林格出版社（Springer-Verlag)，柏林（Berlin)1984);以及Ε· 格羅斯和J.門恩費(fèi)爾編，肽:分析、合成、生物學(xué)，第1卷，關(guān)于經(jīng)典的溶液合成。
[0079]或者，本發(fā)明肽或蛋白質(zhì)可以通過改編任何已知用于產(chǎn)生肽或蛋白質(zhì)基因工程方 法(例如，重組表達(dá)、從細(xì)胞培養(yǎng)物純化、化學(xué)合成等)并且以各種形式(例如，天然的、突變 體、融合體等)獲得。用于制備所述肽和蛋白質(zhì)的方式在本領(lǐng)域中眾所周知。優(yōu)選地以實(shí)質(zhì) 上純的形式（即實(shí)質(zhì)上不含其它宿主細(xì)胞或非宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)）制備肽和蛋白質(zhì)。（例如，莫 里森J(Morrison J),細(xì)菌學(xué)雜志（J Bacteriology)1977,132:349-51;克拉克?寇蒂斯 (Clark-Curtiss)和寇蒂斯（Curtiss),酶學(xué)方法(Methods in Enzymology)(吳(Wu)等人 編）1983，101:347-62)。舉例來說，首先，制備具有編碼所述肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸的呈可 表達(dá)形式(例如，對應(yīng)于啟動子序列的調(diào)控序列的下游)的合適載體并且將其轉(zhuǎn)型到合適的 宿主細(xì)胞中。所述載體和宿主細(xì)胞也由本發(fā)明提供。然后培養(yǎng)宿主細(xì)胞，產(chǎn)生相關(guān)的肽或蛋 白質(zhì)。所述肽或蛋白質(zhì)還可以采用體外翻譯系統(tǒng)于體外產(chǎn)生。
[0080]本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白是來源于CETP的外顯子9的多肽的B細(xì)胞 表位。本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽可以選擇性地阻斷血漿CETP的活動，但不阻斷細(xì)胞CETP的活 動，并且因此比阻斷CETP的兩種形式的活動的藥劑有效。
[0081 ] 抗體
[0082] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于通過選擇性抑制血漿CETP但不抑制細(xì)胞CETP來降 低LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物）的水平并且增加 HDL的水平的治療劑。
[0083] 在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種結(jié)合到本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白 的抗體。本發(fā)明的抗體可以按任何形式使用，例如單克隆抗體或多克隆抗體，并且包括通過 用本發(fā)明的肽使例如兔的動物免疫獲得的抗血清、所有種類的多克隆抗體和單克隆抗體、 通過基因重組產(chǎn)生的人類抗體和人類化抗體。如本文中所用，抗體是與CEPT肽的全長或片 段反應(yīng)的蛋白質(zhì)。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體識別CETP的外顯子9上的片段肽;優(yōu) 選地，具有氨基酸序列SEQ ID NO: 1的CEPT的片段。用于合成寡肽的方法在本領(lǐng)域中眾所周 知。在合成之后，肽可以在用作免疫原之前任選地加以純化。在本發(fā)明中，寡肽可以與用于 通過抗原遞呈細(xì)胞增加吸收的結(jié)構(gòu)域結(jié)合或連接或融合到所述結(jié)構(gòu)域來增強(qiáng)免疫原性。用 于使所述結(jié)構(gòu)域和肽結(jié)合的方法在本領(lǐng)域中也是眾所周知的。
[0084] 任何哺乳動物都可以用抗原進(jìn)行免疫。一般來說，使用嚙齒目、兔形目或靈長類動 物。嗤齒目動物包括例如小鼠、大鼠和倉鼠。兔形目動物包括例如兔。靈長類動物包括例如 狹鼻猴（舊大陸猴），例如食蟹猴(Macaca fascicular is)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒 (sacred baboon)以及黑渥渥(chimpanzee)。
[0085] 用抗原對動物進(jìn)行免疫的方法在本領(lǐng)域中是已知的?？乖母鼓?nèi)注射或皮下注 射是哺乳動物免疫的標(biāo)準(zhǔn)方法。更具體來說，抗原可以經(jīng)稀釋并且懸浮于恰當(dāng)量的磷酸鹽 緩沖鹽水(PBS)、生理鹽水等中。必要時，可以將所述抗原懸浮液與恰當(dāng)量的標(biāo)準(zhǔn)佐劑(例如 弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant))混合，制成乳液并且然后向哺乳動物投與。 優(yōu)選地，緊接著每4到21天投與跟恰當(dāng)量的弗氏不完全佐劑混合的抗原若干次。還可以使用 恰當(dāng)載劑進(jìn)行免疫。如上免疫之后，通過標(biāo)準(zhǔn)方法檢查血清中所要抗體的量的增加情況。
[0086] 針對本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)的多克隆抗體可以通過從經(jīng)檢查血清中的所要抗體增 加的經(jīng)免疫哺乳動物采集血液，并且通過任何常規(guī)方法從血液中分離出血清來制備。多克 隆抗體可以包括含有多克隆抗體的血清，含有多克隆抗體的部分也可以從血清中分離出 來。免疫球蛋白G或M可以從僅識別本發(fā)明肽的部分如下制備:使用例如與本發(fā)明肽偶合的 親和柱，并且使用蛋白A或蛋白G柱進(jìn)一步純化這個部分。
[0087] 為了制備單克隆抗體，從如上所述用抗原免疫并且經(jīng)檢查血清中的所要抗體的水 平增加的哺乳動物采集免疫細(xì)胞，并且使所述免疫細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞融合。用于細(xì)胞融合的免 疫細(xì)胞優(yōu)選地從脾細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞獲得。以上免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞可以根據(jù)已知方法 (例如米爾斯坦（Mi Iste in)等人（加爾弗（Ga If re)和米爾斯坦，酶學(xué)方法（Methods Enzymol) 73:3-46( 1981)的方法)融合。通過細(xì)胞融合獲得的所得雜交瘤可以通過在標(biāo)準(zhǔn)選 擇培養(yǎng)基中對其進(jìn)行培養(yǎng)來加以選擇。然后，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)有限稀釋法，篩選并且克隆出產(chǎn)生所 要抗體的雜交瘤細(xì)胞。
[0088] 由此獲得的單克隆抗體也可以使用基因工程技術(shù)（參見例如波勒柏克 (Borrebaeck)和拉里克（Larrick),治療性單克隆抗體（Therapeutic Monoclonal Antibodies)，由麥克米倫出版公司(MacMillan Publishers LTD)在英國出版（1990))以重 組方式制備。舉例來說，可以從免疫細(xì)胞(例如產(chǎn)生抗體的雜交瘤或經(jīng)免疫淋巴細(xì)胞)克隆 編碼抗體的DNA，將其插入到恰當(dāng)載體中，并且引入宿主細(xì)胞中，從而制備出重組抗體。本發(fā) 明還提供如上所述制備的重組抗體。此外，本發(fā)明抗體可以是抗體或經(jīng)修飾抗體的片段，只 要其結(jié)合到本發(fā)明肽中的一或多者即可。舉例來說，抗體片段可以是?&13、？(&13'）2、？7或單 鏈Fv (s cFv )，其中來自H鏈和L鏈的Fv片段通過恰當(dāng)連接子接合(休斯頓(Hus ton)等人，美國 國家科學(xué)院院刊85:5879-83( 1988))。
[0089] 或者，本發(fā)明抗體可以按介于來源于非人類抗體的可變區(qū)與來源于人類抗體的恒 定區(qū)之間的嵌合抗體形式或以人類化抗體形式獲得，所述人類化抗體包含來源于非人類抗 體的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)、來源于人類抗體的框架區(qū)（FR)和恒定區(qū)。這類抗體可以根據(jù)已知技 術(shù)制備。人類化可以通過用人類抗體的CDR序列取代嚙齒動物的對應(yīng)序列來進(jìn)行(參見例如 韋荷恩(Verhoeyen)等人，科學(xué)(Science)239:1534-1536(1988))。因此，所述人類化抗體是 嵌合抗體，其中實(shí)質(zhì)上不到完整的人類可變結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被來自非人類物種的對應(yīng)序列取 代。
[0090] 還可以使用除了人類框架區(qū)和恒定區(qū)之外還包含人類可變區(qū)的完全人類抗體。所 述抗體可以使用本領(lǐng)域中已知的各種技術(shù)產(chǎn)生。舉例而言，體外方法涉及使用展示于噬菌 體上的人類抗體片段的重組文庫(例如，霍根布姆(Hoogenboom)和溫特(Winter )，分子生物 學(xué)雜志（J.Mol.Biol .)227:381( 1991)。
[0091] 如上獲得的抗體可以被純化為均質(zhì)的。舉例來說，可以根據(jù)用于一般蛋白質(zhì)的分 離和純化方法執(zhí)行抗體的分離和純化。舉例來說，可以通過經(jīng)過恰當(dāng)選擇和組合使用的柱 色譜，例如親和色譜、過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳以及等電點(diǎn)聚焦來分 開和分離抗體(抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊(Antibodies:A Laboratory Manual )·哈洛(Harlow)和大 衛(wèi)?萊恩（David Lane)編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室（Cold Spring Harbor Laboratory)(1988))，但 所述柱色譜不限于此。
[0092] 含有所述肽或蛋白質(zhì)或抗體作為活性成分的藥劑或組合物
[0093] 另一方面，本發(fā)明提供一種藥劑或組合物，其包含本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原 融合蛋白或抗體。
[0094] 本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)或抗體可以按藥劑或組合物形式直接投與，或必要時，可以 通過常規(guī)調(diào)配方法調(diào)配。在調(diào)配過程中，除了本發(fā)明的肽之外，適當(dāng)時還可以不受特定限制 地包括載劑、賦形劑以及常用于藥物的物質(zhì)。
[0095] 待投與的藥劑或組合物可以按藥物學(xué)上可接受的溶液形式提供，例如水溶液，常 常是生理鹽水或緩沖溶液，或者所述藥劑或組合物可以按粉末形式提供。存在本發(fā)明藥物 組合物的各種合適的調(diào)配物。參見例如利伯曼（Lieberman )，藥物劑型（Pharmaceuti cal Dosage Forms),馬塞爾?德克爾出版社(Marcel Dekker),第1-3卷（1998);雷明頓的藥物 科學(xué)（Remington's Pharmaceutical Science),第17版，馬克出版公司（Mack Publishing Company)，賓夕法尼亞州伊斯頓(Easton，Pa.) (1985)以及類似出版物。適用于口服的調(diào)配 物可以由以下各者組成：（a)液體溶液，例如有效量的重組細(xì)菌懸浮于稀釋劑中，所述稀釋 劑例如緩沖水、生理鹽水或PEG 400; (b)膠囊、藥囊或片劑，各自含有預(yù)定量的活性成分，呈 凍干粉末、液體、固體、顆?；蛎髂z形式；（c)在恰當(dāng)液體中的懸浮液；以及(d)合適的乳液。 片劑形式可以包括以下各者中的一或多者:乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸鈣、玉米 淀粉、馬鈴薯淀粉、黃蓍膠、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、膠態(tài)二氧化硅、交聯(lián)羧甲纖維素 鈉、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸以及其它賦形劑、著色劑、填充劑、粘合劑、稀釋劑、緩沖劑、濕潤 劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料、崩解劑以及藥理學(xué)上兼容的載劑?？诤问娇梢园钚猿煞?于調(diào)味劑中，所述調(diào)味劑通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠，片劑也包含活性成分于例如明 膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠乳液、凝膠等惰性基質(zhì)中，除了活性成分之外還含有本領(lǐng)域中 已知的載劑。應(yīng)認(rèn)識到，減毒疫苗在經(jīng)口投與時，必須防止其消化。這通常通過使疫苗與組 合物復(fù)合而使得其對酸性水解和酶促水解具有抵抗性或通過將疫苗包裝在例如脂質(zhì)體或 腸溶包衣膠囊的具恰當(dāng)抗性的載劑中來實(shí)現(xiàn)。防止減毒細(xì)菌消化的方式在本領(lǐng)域中眾所周 知。藥物組合物可以例如封裝在脂質(zhì)體中或封裝在提供活性成分的緩釋的調(diào)配物中。
[0096]本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)或抗體可以按組合形式制備，所述組合包括本發(fā)明的肽、蛋 白質(zhì)或抗體中的兩者或兩者以上。組合中的肽或蛋白質(zhì)或抗體可以相同或不同。肽或蛋白 質(zhì)或抗體可以呈混合物形式，或在肽或蛋白質(zhì)的情況下，本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)可以使用標(biāo) 準(zhǔn)技術(shù)彼此結(jié)合。通過投與本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)，所述肽或蛋白質(zhì)在APC上以高密度遞呈。 [0097] 所述藥劑或組合物可以用于通過選擇性抑制血漿CETP，但不抑制細(xì)胞CETP來降低 LDL(包括oxLDL和LDL的其它衍生物）的水平并且增加 HDL的水平，所述藥劑或組合物包括任 何本發(fā)明肽作為活性成分。在另一個實(shí)施例中，所述藥劑或組合物可以另外包括佐劑，使得 將有效地建立細(xì)胞免疫性，或其可以與其它活性成分一起投與。已知合適的佐劑的實(shí)例包 括明鞏、磷酸錯、氫氧化錯和MF59(4.3%w/v角藍(lán)稀、0 · 5%w/v吐溫(Tween)80、0 · 5%w/v斯 潘(Span) 85)、弗氏佐劑、N-乙?；?胞壁?；?L-蘇氨酰基-D-異谷酰胺（thr-MDP)、N-乙酰 基-去甲-胞壁?；?L-丙氨?；?D-異谷酰胺(CGP 11637，稱為11(^-1?^)4-乙?；邗?基-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺?；?L-丙氨酸-2-( Γ，2二棕櫚?；?sn-甘油-3-羥基磷 酰氧基）_乙胺（CGP 19835A，稱為MTP-TO)以及RIBI、海藻糖二霉菌酸酯以及細(xì)胞壁骨架 (MPL+TDM+CWS)于2%角鯊烯/吐溫80乳液中或卡介苗(Bacille Calmette-Guerin;BCG)。佐 劑的有效性可以通過測量針對免疫原性抗原的抗體的量來測定。
[0098] 必要時，本發(fā)明的藥劑或組合物可以任選地包括第二活性成分，只要第二成分可 以降低LDL水平或增加 HDL水平即可。舉例來說，第二活性成分是史他汀類藥物（statins) (例如：阿托伐他汀（atorvastatin;立普妥（Lipitor))、氟伐他?。╢ Iuvastatin;益脂可 (Lescol)、洛伐他汀（Iovastatin;美降脂(Mevacor)，Altocor)、匹伐他汀(pitavastatin; 力清之（Livalo))、普伐他?。╬ravastatin;美百樂（Pravachol))、瑞舒伐他汀 (rosuvastat in;冠脂妥(Cres tor))及辛伐他?。╯imvastatin;舒降之(Zocor)))或煙堿酸 類(例如肌醇及煙堿酸鹽(nicotinate))。本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)還可以與第二活性成分依序 或并行地投與。
[0099] 本發(fā)明的藥劑或組合物的量取決于例如所用藥物組合物的類型、待治療的疾病以 及投藥的療程和途徑。
[0100] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易認(rèn)識的，考慮到所討論的調(diào)配物的類型（例如，賦形劑、 填充劑、粘合劑、稀釋劑等），除了本文中特別提到的成分之外，本發(fā)明的藥劑或組合物可以 進(jìn)一步包括本領(lǐng)域中的其它常規(guī)物質(zhì)。
[0101 ]本發(fā)明的肽、蛋白質(zhì)或抗體的使用方法
[0102]另一方面，本發(fā)明提供一種用于引發(fā)或活化個體體內(nèi)的CETP抗體的方法，所述方 法包含向所述個體投與有效量的本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白。所引起的CEPT抗 體靶向CETP的細(xì)胞外形式，但不靶向CETP的細(xì)胞內(nèi)形式，以便降低LDL(包括oxLDL和LDL的 其它衍生物）的水平并且增加 HDL的水平。
[0103]在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于降低個體體內(nèi)的LDL水平并且增加 HDL水平 的方法，所述方法包含向所述個體投與有效量的本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白或 抗體。
[0104] 因此，本發(fā)明提供一種用于治療或預(yù)防oxLDL或LDL衍生物相關(guān)疾病的方法，所述 方法包含向所述個體投與有效量的本發(fā)明的經(jīng)分離抗原肽或抗原融合蛋白或抗體。
[0105] OXLDL或LDL衍生物相關(guān)疾病包括(但不限于）神經(jīng)變性病、心血管疾病、膽固醇代 謝相關(guān)癥狀、炎癥性疾病、肝病和腎病、哮喘、脊髓損傷以及創(chuàng)傷性腦損傷。在一些實(shí)施例 中，代謝相關(guān)癥狀是高血壓、脂肪肝或糖尿病;炎癥性疾病是關(guān)節(jié)炎或非酒精性脂肪性肝炎 (NASH);并且心血管疾病是中風(fēng)。
[0106] 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明方法中所用的個體選自包括以下各者的群組:人類、狗、 貓、牛、兔和豬。
[0107] 本文中所述的本發(fā)明實(shí)施例選擇性地阻斷血漿CETP的活動，但不阻斷細(xì)胞CETP的 活動，因此其比阻斷CETP的兩種形式的活動的藥劑有效。因此，本文中所述的實(shí)施例可以降 低LDL水平并且增加 HDL水平，以便治療或預(yù)防oxLDL或其它LDL衍生物相關(guān)疾病/癥狀。
[0108] ^lJ
[0109]材料和方法
[0110]構(gòu)造出用于編碼人類CETP表位的6個重復(fù)序列的DNA片段，緊接著使其與兔Fc融合 并且在大腸桿菌(E.C0li)BL21(DE3)中表達(dá)融合蛋白。
[0111] 如先前所描述(許(Hsu)等人2000，癌癥研究（Cancer Res · )60: 3701-3705)，通過 模板重復(fù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（TR-PCR)產(chǎn)生用于編碼人類CETP表位肽TOHLLVDFLQSL(高福 (Gaofu)等人2004,疫苗(Vaccin e)22: 3187-3194)的6個重復(fù)序列的DNA片段（圖1)。然后使 用接頭引物(表1)使TR-PCR產(chǎn)物經(jīng)歷接頭PCR以在5'端和3'端形成限制位點(diǎn)，從而促進(jìn)進(jìn)一 步亞克隆。將200-300bp接頭PCR產(chǎn)物（圖IB)洗脫出來并且克隆到T-Easy載體(普洛麥格 (Promega))中。通過測序并且在編碼兔I gG的Fc結(jié)構(gòu)域的區(qū)域的3 '端亞克隆到經(jīng)修飾的質(zhì) 粒pET21b載體(諾瓦根(Novagen))中來鑒別含有CETP表位的6個拷貝的克隆體。通過測序并 且引入大腸桿菌BL21(DE3)中證實(shí)所得質(zhì)粒pFc-CETP 6,并且通過His結(jié)合柱(諾瓦根)色譜 純化所表達(dá)的融合蛋白（Fc-CETP6)。
[0112] 表1用于構(gòu)造中的引子
[0114] 分析抗CETP抗體滴度
[0115] 使GST和GST-CETP蛋白在大腸桿菌ToplO(英杰公司（Invitrogen))中表達(dá)，并且通 過親和色譜純化。使用涂有GST-CETP或作為標(biāo)記對照的GST的培養(yǎng)板應(yīng)用ELISA，從而測定 CETP的血漿抗體滴度。滴度被定義為在405nm下的光密度為1.0的血漿稀釋度。
[0116] 動物實(shí)驗(yàn)
[0117] 執(zhí)行兩個動物研究；在兩個研究中，使16周齡的雌性新西蘭白兔(約2kg)適應(yīng)2周 時間，并且然后進(jìn)行如下處理。
[0118] 在第一個實(shí)驗(yàn)中，將所述兔隨機(jī)地分成正常組(n = 4)、對照組(n = 7)或Fc-CETP6 組(η = 8)。正常組中的兔喂以常規(guī)飼料，而對照組和Fc-CETP6組中的兔喂以HFC飼料(補(bǔ)充 有5%豬油和0.25%膽固醇的食物）。在研究期期間，每只動物每天喂以100g飼料并且允許 其開放攝取自來水。Fc-CETP 6組中的兔在第1天以及在第2周、第4周、第6周和第8周結(jié)束時 皮下注射〇. Img Fc-CETP6(第一次注射完全弗氏佐劑并且其它的全部注射不完全弗氏佐 劑），而喂以HFC飼料的對照組用含PBS的佐劑經(jīng)歷相同的注射時程。在第1周、第8周、第12 周、第20周和第24周結(jié)束時采集血漿樣品并且測量CETP活性和抗CETP抗體的滴度。在第24 周，使所述兔禁食過夜，并且次日早晨通過吸入異氟烷麻醉并且還采集兔的主動脈進(jìn)行動 脈粥樣硬化病變分析。
[0119] 在第二個實(shí)驗(yàn)中，除了Fc-CETP6組兔（n = 8)在第24周和第28周結(jié)束時接受含 0.1 mg FC-CETP6的不完全弗氏佐劑的強(qiáng)化注射并且在第52周結(jié)束時殺死之外，如第一個實(shí) 驗(yàn)中那樣處理所述兔。在禁食過夜之后，如上所述使兔麻醉并且在灌注生理鹽水之后移出 其肝臟。然后獲得三個右葉樣品（每個約lcm 3)，固定在4%多聚甲醛中，并且包埋在石蠟中。
[0120] 有關(guān)研究動物的照護(hù)和使用的所有程序都是根據(jù)行政院衛(wèi)生署的臺灣食品和藥 物管理局動物中心（the animal center of the Taiwan Food and Drug Administration,Department of Health,Executive Yuan)的指南，并且得到所述動物中 心的批準(zhǔn)。
[0121] 檢測CETP活性
[0122] 使用CETP活性分析試劑盒(生物視野(BioVision))，根據(jù)制造商的指南，測量血漿 CETP活性。數(shù)據(jù)按占治療前水平的百分比形式呈現(xiàn)。
[0123] 分離脂蛋白部分并且測量膽固醇水平
[0124] 用于分離脂蛋白部分的程序先前已有描述（常（Chang)等人2004,脂質(zhì)研究雜志 (J.Lipid Res. )45:2116-2122)。簡單來說，通過在4°C下低速離心制備血漿，然后通過密度 梯度超速離心法分離VLDL、LDL和HDL，并且根據(jù)制造商的指南，以酶促方式（朗道(Randox)) 測定血漿和脂蛋白部分中的膽固醇濃度。
[0125] 主動脈中的動脈粥樣硬化病變的定量
[0126] 用冰冷的PBS灌注主動脈20分鐘，并且然后用冷的甲醛-蔗糖溶液（10%中性福爾 馬林(formalin)、5%蔗糖、20mM丁基化羥基甲苯以及2mM EDTA，pH 7.4)加壓固定。然后將 整個主動脈切開并且縱向打開主動脈，在70%乙醇中簡單地沖洗，并且用蘇丹IV(0.5%蘇 丹IV于35%乙醇/50%丙酮中）染色，并且用80%乙醇脫色5分鐘。然后將每個主動脈安裝在 平坦表面上并且使用數(shù)碼相機(jī)獲得其表面的圖像。用蘇丹IV染色的面積(脂質(zhì)斑塊)表示為 占主動脈總表面積的百分比。
[0127] 免疫組織化學(xué)分析
[0128] 所用程序先前已有描述(蔣(Chiang)等人2012,疫苗30:7573-7581)。簡單來說，通 過免疫組織化學(xué)染色，使用小鼠抗NF-kB和抗RAM-11抗體(達(dá)科(Dako))測定NF-κΒ和RAM-11 在主動脈和肝臟組織中的表達(dá)水平。從每只動物的截面和在顯微鏡（奧林巴斯(Olympus)， BX60)下拍攝的每個截面的十個隨機(jī)視野(放大倍數(shù)，X200)分析主動脈。從每只動物的三 個右葉組織切片和在顯微鏡(奧林巴斯，BX60)下拍攝的每個切片的十個隨機(jī)視野(放大倍 數(shù)，X200)分析肝臟組織。
[0129] 肝臟組織學(xué)和肝臟中的脂肪變性和纖維化的定量
[0130]用蘇木精和曙紅(H&E)以及馬森三色染色對肝臟切片(4μπι)進(jìn)行染色。病理學(xué)專家 用非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的組織學(xué)評分系統(tǒng)評定組織學(xué)脂肪變性和纖維化階段(克 萊納(Kleiner)等人2005,肝臟病學(xué)（Hepatology)41:1313-1321)。分析來自每只動物的三 個組織切片和在顯微鏡(奧林巴斯，BX60)下拍攝的每個切片的十個隨機(jī)視野(放大倍數(shù)，X 200)。
[0131 ] 測量血衆(zhòng)ApoA-I和氧化的LDL水平
[0132]根據(jù)制造商的指南，使用分別來自華美生物(CUSABIO) (CSB-E09804Rb)和麥可蒂 亞(Mercodia) (10-1158-01)的夾心ELISA試劑盒，測量血衆(zhòng)ApoA-I和血漿ox-LDL。
[0133]統(tǒng)計(jì)分析
[0134] 所有數(shù)據(jù)都以平均值土 SEM形式呈現(xiàn)。通過柯爾莫哥羅夫-斯米爾諾夫檢驗(yàn) (Kolmogorov-Smirnov test)檢查正態(tài)性，并且當(dāng)數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布時，用獨(dú)立t檢驗(yàn)和單向 方差分析并且通過使用SPSS統(tǒng)計(jì)程序，版本17進(jìn)行相關(guān)與回歸分析來評定差異的統(tǒng)計(jì)顯著 性。當(dāng)數(shù)據(jù)不呈正態(tài)分布時，應(yīng)用曼-惠特尼U檢驗(yàn)(Mann-Whitney U test)。在所有分析中， 認(rèn)為P〈〇. 05的值為統(tǒng)計(jì)顯著的。
[0135] 實(shí)例1產(chǎn)生Fc-CETP6疫苗
[0136] 產(chǎn)生編碼CETP表位的6個重復(fù)序列的DNA并且在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中誘導(dǎo)和 表達(dá)融合蛋白，如圖1中所示。通過在組氨酸(His)結(jié)合柱上的親和色譜法純化融合蛋白Fc-CETP6。通過考馬斯藍(lán)(Coomassie Blue)染色和蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢查Fc-CETP6融合蛋白的純度，所述純度達(dá)到95 %。所述經(jīng)組氨酸結(jié)合純化的Fc-CETP6的純度:道1 至3分別顯示考馬斯藍(lán)對于流經(jīng)(flow-through)、清洗及洗出（elutes)劃分的染色結(jié)果，而 道4顯示洗出液使用抗-兔IgG(Fc)的蛋白質(zhì)印跡法分析(圖1C)。
[0137] 實(shí)例2.在喂以HFC飼料的兔中，F(xiàn)c-CETP6疫苗引發(fā)針對CETP的抗體并且降低CETP 活性
[0138] 為了證實(shí)產(chǎn)生了抗CETP抗體并且所述抗體與循環(huán)中的CETP反應(yīng)，測量血漿抗CETP 滴度和血漿CETP活性。圖2A顯示，在Fc-CETP6組中從第12周開始檢測到抗CETP抗體并且滴 度一直增加直到在第24周研究結(jié)束為止。圖2B顯示，在兩個喂以HFC飼料的組中，血漿CETP 活性均以時間依賴性方式增加，但在Fc-CETP6組中，血漿CETP活性明顯更低。這些結(jié)果顯 示，注射Fc-CETP 6誘導(dǎo)產(chǎn)生針對CETP的抗體，所述抗體然后降低了 CETP活性。
[0139] 實(shí)例3. Fc-CETP6疫苗對總膽固醇和HDL膽固醇的血漿水平的影響
[0140] 用Fc-CETP6進(jìn)行疫苗接種對總C和HDL-C的水平以及體重的影響匯總在表2中。在 體重方面，在對照組與Fc-CETP 6之間無顯著差異。兩個組中的總C和HDL-C的水平均以時間 依賴性方式增加。在第12周和第24周，F(xiàn)c-CETP 6組中的總C水平明顯低于對照組，并且HDL-C 水平明顯高于對照組。另外，在第12周和第24周，F(xiàn)c-CETP6組中的非HDL-C/HDL-C比率低于 對照組。這些結(jié)果顯示，F(xiàn)c-CETP 6免疫引起致動脈粥樣硬化脂蛋白譜減少。
[0141] 表2.在喂以HFC飼料的兔中，在存在或不存在疫苗接種的情況下，體重以及血漿總 膽固醇和HDL-C的改變.
[0143] 對照η = 7; Fc-CETP6n = 8。1值是平均值土 SEM。*同時相比于對照，p〈0.05
[0144] 實(shí)例4 · Fc-CETP6增加了 ApoA-I水平并且降低了 ox-LDL水平
[0145] ApoA-I是HDL中的主要蛋白質(zhì)并且已知具有消炎作用（納瓦布(Navab)等人2005， 心血管醫(yī)學(xué)趨勢（Trends Cardiovasc .Med.) 15:158-161);已經(jīng)顯不，高水平的ApoA-I可減 慢動脈粥樣硬化的進(jìn)展并且甚至誘導(dǎo)消退，指示ApoA-I可直接預(yù)防動脈粥樣硬化(史密斯 JD(Smith JD)2010，研究藥物當(dāng)前觀點(diǎn)（Curr .Opin. Investig.Drugs)ll :989-996)。另外， ox-LDL在動脈中被巨噬細(xì)胞吸收并且將其轉(zhuǎn)化成富含膽固醇的泡沫細(xì)胞，所述泡沫細(xì)胞已 經(jīng)顯示為參與了NASH的發(fā)展（察拉沙尼（Chalasani)等人2004,美國胃腸病學(xué)雜志 (Am.J.Gastroenterol .)99:1497-1502)。因此，我們測量了兔體內(nèi)的ApoA-I和ox-LDL的血 漿水平(表3)并且發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)c-CETP 6組中的ApoA-I水平明顯高于對照組，并且ox-LDL水平明顯 低于對照組。另外，免疫熒光染色顯示，F(xiàn)c-CETP 6組中的肝臟靜脈區(qū)域周圍的ox-LDL的表達(dá) 水平明顯低于對照組(數(shù)據(jù)未示出）。這些結(jié)果可以幫助解釋用Fc-CETP 6進(jìn)行疫苗接種為何 緩解了 HFC飼料誘發(fā)的動脈粥樣硬化和NASH的發(fā)展。
[0146] 表3 · ApoA-I和ox-LDL的血漿水平·
[0148] 對照η = 7; Fc-CETP6n = 8。1值是平均值土 SEM。*相比于對照，p〈0 · 05。
[0149] 實(shí)例5.Fc-CETP6改善了主動脈中的HFC飼料誘發(fā)的動脈粥樣硬化病變和炎癥 [0150]為了檢查用Fc-CETP6進(jìn)行疫苗接種是否可以改善動脈粥樣硬化斑塊的形成，從每 只兔中分離出主動脈并且用蘇丹IV染色。每個組的代表性蘇丹IV染色的主動脈示出在圖3A 中，并且整個主動脈中的動脈粥樣硬化的程度使用圖像分析系統(tǒng)定量，示出在圖3B中。在正 常的兔中，僅約1 %的主動脈表面積被蘇丹IV染色。相比之下，維持HFC飼料持續(xù)24周的兔在 對照組中發(fā)展出了覆蓋62.9 ± 4.3 %的主動脈表面的動脈粥樣硬化病變，但在FC-CETP6組 中僅28.5±6.2% (圖3B)。因?yàn)閯用}粥樣化形成涉及長期炎癥并且巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是主動 脈局部炎癥的關(guān)鍵介導(dǎo)者(莉比P(Libby P)2002,自然(Nature)420:868-874)，所以執(zhí)行免 疫組織化學(xué)分析來檢測主動脈中炎癥標(biāo)志物NF-kB和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物RAM-Il的存在情況。 圖3C顯示，在正常兔的主動脈中未檢測到NF-κΒ或RAM-Il染色，然而在對照組中，HFC飼料引 起了內(nèi)膜中強(qiáng)烈的RAM-Il和NF-κΒ染色。通過用Fc-CETP 6進(jìn)行疫苗接種，兩種影響均顯著減 ?。▓D3D)(圖3E)?？偠灾?，我們的結(jié)果顯示，用Fc-CETP6進(jìn)行免疫降低了主動脈炎癥和巨 噬細(xì)胞浸潤的程度，并且因此減小了對兔主動脈中動脈粥樣硬化進(jìn)展的易感性。
[0151] 實(shí)例6. Fc-CETP6緩解HFC飼料誘發(fā)的NASH和纖維化
[0152] NASH的特征在于肝脂質(zhì)累積以及炎癥，其可以最終進(jìn)展成肝硬化。在被設(shè)計(jì)成用 于檢查所述疫苗是否能夠緩解HFC飼料誘發(fā)的動脈粥樣硬化的第一個實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到， 對照組的肝臟的顏色是淺色，而正常組和Fc-CETP 6組的肝臟的顏色是紅色，表明Fc-CETP6注 射緩解了 HFC誘發(fā)的非酒精性脂肪性肝病。小川（Ogawa)等人發(fā)現(xiàn)，通過喂以補(bǔ)充有0.75% 膽固醇和12%玉米油的飼料，在兔中誘發(fā)出了人類型NASH與晚期纖維化(小川等人2010,美 國病理學(xué)雜志(Am. J.Pathol. )177:153-165)。在第二個實(shí)驗(yàn)中，為了測試Fc-CETP6疫苗是 否可以減小喂以HFC飼料的兔中的NASH和纖維化的易感性，我們通過用H&E和馬森三色對肝 臟切片進(jìn)行染色，檢查了在喂了 12個月的HFC飼料之后的兔中Fc-CETP6疫苗對肝脂質(zhì)累積 和NASH的影響。如圖4B中所示，對照組的肝臟切片顯示出了實(shí)質(zhì)性脂質(zhì)累積、伴隨著靜脈周 圍區(qū)域中的氣球樣變性的小泡型脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤以及馬洛氏小體（M a 11 〇 r y hyaline)的證據(jù)（圖4B)，然而Fc-CETP6組的肝臟切片顯示僅具有輕度脂肪累積的肝細(xì)胞， 并且正常組的肝臟切片未顯示脂肪變性的證據(jù)。為了進(jìn)一步評估Fc-CETP 6對肝臟炎癥的影 響，使用針對識別活化的庫普弗細(xì)胞(kupffer cell)(巴桑(Buyssens)等人1996,肝臟病學(xué) (Hepatology)24:939-946)的RAM-Il和炎癥標(biāo)志物NF-κΒ的抗體來執(zhí)行免疫組織化學(xué)染色。 相比于對照兔的肝臟，F(xiàn)c-CETP 6的肝臟顯示，在中央靜脈區(qū)域周圍在其中肝細(xì)胞的脂肪變 性明顯的位點(diǎn)處，RAM-Il陽性細(xì)胞的數(shù)量減少。正常組顯示為RAM-Il陰性對照（圖4C)。在更 高的放大倍數(shù)下，大RAM-11陽性細(xì)胞含有液泡(脂滴）。此外，NF-κΒ給對照兔肝臟中的中央 靜脈區(qū)域周圍的細(xì)胞進(jìn)行染色，并且在Fc-CETP 6組中，NF-κΒ染色細(xì)胞明顯減少。正常組顯 示為NF-κΒ陰性對照（圖4D)。炎癥和纖維化的改變通過檢測促炎性細(xì)胞因子和與纖維化相 關(guān)的基因的肝臟mRNA表達(dá)水平得到進(jìn)一步證實(shí)。圖4E顯示，F(xiàn)c-CETP 6組中的腫瘤壞死因子α (TNFa)和白介素-6(IL-6)的mRNA水平明顯低于對照組;然而（白介素1β)IL-Ιβ在兩個組之 間沒有不同。這些結(jié)果支持Fc-CETP6減少喂以HFC飼料的兔中的肝臟炎癥。
[0153] 對照組的肝臟切片顯示陽性三色染色，顯著的橋接纖維化，其中纖維帶從靜脈周 圍區(qū)域延伸到細(xì)胞周圍區(qū)域，然而Fc-CETP 6組顯示減少的或無橋接纖維化。纖維化間隔由 a-SMA陽性細(xì)胞構(gòu)成，a-SMA是活化星形細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物（圖5A);然而Fc-CETP6組顯示限于中央靜脈區(qū)域中的減少的橋接纖維化。并且Fc-CETP 6兔肝臟中的纖維化相 關(guān)基因轉(zhuǎn)化生長因子m(TGF-m)、膠原蛋白1厶1(0)11厶1)、3厶1(0)13厶1)以及金屬蛋白酶-1 (??ΜΡ-1)的組織抑制劑的肝臟mRNA水平全都明顯低于對照兔肝臟中（圖5B)。這些結(jié)果支持 Fc-CETP6減少喂以HFC飼料的兔中的肝纖維化。
[0154] 脂肪變性和纖維化的級別匯總在表3中。就脂肪變性來說，結(jié)果顯示，對照組的肝 臟樣本中沒有〇級或1級，7 %是2級并且93 %是3級，然而Fc-CETP6組的值中12 %是0級，56 % 是1級，32%是2級，并且沒有3級。就纖維化來說，在對照組中，沒有0級或1級，同時25%是2 級，62.5 %是3級，并且12.5 %是4級，然而在Fc-CETP6組中，14 %的肝臟樣本未展現(xiàn)纖維化， 同時29 %是Ia級，43 %是Ib級，14%是2級，并且沒有3級或4級(參見表4)。
[0155] 表4.在52周，F(xiàn)c_CETP6痔苗對肝腫組織學(xué)的影晌
L0158J *肝性脂肪變性的嚴(yán)里程度的等級劃分如卜：〈5%(0);5%-33%(1);34%-66% (2);并且 >66%(3)。
[0159] ?肝纖維化的嚴(yán)重程度的等級劃分如下：沒有(0);竇周（la);門靜脈周（lb);門靜 脈周和竇周(2);橋接纖維化(3);并且肝硬化(4)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)分離抗原肽，其包含由PEHLLVDFLQSL(SEQ ID N0:1)組 成的氨基酸序列的至少一個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原肽，其包含所述氨基酸序列SEQ ID NO: 1的至少兩 個、三個、四個或五個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾肽。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原肽，其包含2個到10個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP 抗體的經(jīng)修飾肽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原肽，其包含5個到7個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP 抗體的經(jīng)修飾肽。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原肽，其包含6個重復(fù)序列或其用于引發(fā)CETP抗體的 經(jīng)修飾肽。6. -種用于引發(fā)CETP抗體的抗原融合蛋白，其包含如下抗原融合蛋白，所述抗原融合 蛋白包含融合到用于通過抗原遞呈細(xì)胞APC增加吸收的結(jié)構(gòu)域的根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗 原肽或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白，其中所述用于通過抗原遞呈細(xì)胞APC增加吸收 的結(jié)構(gòu)域選自包括以下的群組：IgG的Fc片段、IgM的Fc片段以及IgA的Fc片段。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白，其中所述結(jié)構(gòu)域是IgG的Fc片段。9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白，其中所述結(jié)構(gòu)域是人類或兔IgG的Fc片段。10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含融合到包含至少兩個氨基酸序列SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的Fc片段或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。11. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含融合到包含2個到10個氨基酸序列SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的Fc片段或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。12. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含融合到包含5個到7個氨基酸序列SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的Fc片段或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。13. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含融合到包含6個氨基酸序列SEQ ID NO: 1的線性重復(fù)序列的Fc片段(Fc-CEPT6)或其用于引發(fā)CETP抗體的經(jīng)修飾蛋白質(zhì)。14. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白，其包含由SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:7編碼的 序列。15. -種抗體，其結(jié)合到根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原肽或根據(jù)權(quán)利要求6所述的 經(jīng)分離融合蛋白。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體，其為多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、人類化抗體 或人類抗體。17. -種藥劑或組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原肽或根據(jù)權(quán)利要求6 所述的抗原融合蛋白或根據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體。18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥劑或組合物，其為包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原 肽或根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白的疫苗組合物。19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥劑或組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。20. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的藥劑或組合物，其進(jìn)一步包含第二活性劑。21. -種用于引發(fā)或活化個體中的CETP抗體的方法，其包含向所述個體投與有效量的 根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原肽或根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白。22. -種用于降低個體中的LDL水平并且增加 HDL水平的方法，其包含向所述個體投與 有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原肽或根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白或根 據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體。23. -種用于治療或預(yù)防oxLDL或LDL衍生物相關(guān)疾病的方法，其包含向所述個體投與 有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離抗原肽或根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗原融合蛋白或根 據(jù)權(quán)利要求15所述的抗體。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述oxLDL或LDL衍生物相關(guān)疾病是神經(jīng)變性病、 心血管疾病、膽固醇代謝相關(guān)癥狀、炎癥性疾病、肝病和腎病、哮喘、脊髓損傷以及創(chuàng)傷性腦 損傷。25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述代謝相關(guān)癥狀是高血壓、脂肪肝或糖尿??； 所述炎癥性疾病是關(guān)節(jié)炎或非酒精性脂肪性肝炎NASH;并且所述心血管疾病是中風(fēng)。
【文檔編號】A61P9/00GK105859837SQ201510687752
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年10月21日
【發(fā)明人】黃昭蓮
【申請人】臺北醫(yī)學(xué)大學(xué)