專利名稱：：新型鼻病毒中和免疫原(nimiv)及其在疫苗中的應(yīng)用的制作方法新型鼻病毒中和免疫原(NIMIV)及其在疫苗中的應(yīng)用發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及預(yù)防或治療人鼻病毒感染的方法和組合物。
背景技術(shù)：
：人鼻病毒(HRV)是普通感冒唯一最重要的病原體(Arruda等，C"".Mcra&W.35:2864-2868(1997);Couch,"Rhi麗i畫s."In:Fields,B.N.，Knipe,D.M,(主編)，KVo/ogy.RavenPress,NewYork,607-629(1990);Turner,顛Wr49(1):1-14(2001)。導(dǎo)致約1/3普通感冒爆發(fā)的HRV約有100種血清型，來自被HRV感染患者恢復(fù)期血清不完全交叉中和。盡管HRV引起的上呼吸道疾病通常輕微并且具有自限性，然而工作和學(xué)習(xí)停頓所造成的社會(huì)經(jīng)濟(jì)影響以及不恰當(dāng)使用抗生素的程度是顯著的。據(jù)估計(jì)，每年在美國(guó)上呼吸道疾病導(dǎo)致至少2500萬次請(qǐng)假和2300萬次缺課(Anzueto等，C/^W123(5):1664誦1672(2003);Rotbart,j""w>.53:83-98(2002))。越來越多的證據(jù)表明HRV感染和更嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)并發(fā)癥之間的聯(lián)系。例如HRV引起的感冒是急性中耳炎和鼻竇炎重要的易感因素，并且是引起成人和小孩哮喘惡化的主要因素。HRV感染也與患有嚢性纖維病、支氣管炎和其他潛在的呼吸系統(tǒng)病癥的個(gè)體的下呼吸道綜合癥相關(guān)(Gern，尸e&a纊/"/e".ZXs./.23:S78-S86(2004);Anzueto等，123(5):1664-1672(2003);Gern等，C"w.Mz'cra&o/.化v.12(1):9-18(1999);Pitkamnta等，C/Z".M'c油'o/.35:1791-1793(1997);Pitkaranta等，Pe^Wncs102:291-295(1998);Rotbart,爿w"vki仏53:83-98(2002))。迄今為止，預(yù)防或治療HRV感染引起的疾病還沒有經(jīng)批準(zhǔn)的有效抗病毒療法。因此，存在尋找可以起以下作用藥劑的顯著未滿足的醫(yī)藥需求預(yù)防HRV感染、縮短HRV引起的疾病的持續(xù)時(shí)間、減輕癥狀的嚴(yán)重性、減少繼發(fā)細(xì)菌感染和減輕潛在疾病(underlyingdisease)的惡化、減少病毒傳播。預(yù)防性HRV疫苗應(yīng)針對(duì)多種血清型起保護(hù)作用，以減少HRV感染數(shù)量并縮小其臨床影響。制備基于對(duì)應(yīng)單獨(dú)結(jié)構(gòu)蛋白的保守區(qū)(McCray等，A^w^329:736-738(1987))或作為生物融合體的一部分(Brown等，F(xiàn)"acdwe9:595-601(1991);Francis等，iVoc.扁.t/.S乂87:2545-2549(1990))的合成多肽HRV疫苗的嘗試僅取得有限成功，因?yàn)樗x肽免疫原性低，這可部分通過它們較少接觸病毒表面(有限接觸抗體)或構(gòu)象局限性來解釋。本發(fā)明克服了這些限制，并展示了誘發(fā)保護(hù)血清型交叉反應(yīng)的中和抗體應(yīng)答從而預(yù)防和治療HRV感染的疫苗。發(fā)明概述本發(fā)明提供分離的鼻病毒中和免疫原IV(NimIV)肽。這些肽可以來自鼻病毒的任何血清型，例如人鼻病毒(例如HRV14)。這些肽可以包括例如人鼻病毒的病毒結(jié)構(gòu)蛋白1(VP1)的羧基末端區(qū)域的第277-283位氨基酸(例如第275-285位氨基酸)。例示性的序列包括以下序列PVIKKR、PVIKKRK(HRV14)、PVIKKRE(HRV6和HRV72)、PVIKKRS(HRV92)、PVIEKRT(HRV83)、PKIIKKR(H謂6)、PVIKRRE(HRV35)、PIIAKRE(HRV79)、TIIKKRT(HRV3)、NTEPVIKKRKGDIKSY(HRV14)和A-X-X2-I-X3-X4-R-X5-B,其中X!=P或T;X2=V、K或I;X3=K、E、I或A;X4=K或R;X5=S、E、D、T、R、T或K;A=0-10個(gè)附加氨基酸；和B-O-IO個(gè)附加氨基酸。本發(fā)明還包括分離的編碼NimIV肽的核酸分子或其互補(bǔ)核酸分子(complement)。此外，本發(fā)明包括含有本發(fā)明的肽和核酸分子的載體(例如HRV14載體)。該載體可以是例如人鼻病毒載體，例如與可NimIV肽所獲自的人鼻病毒血清型不同的人鼻病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，NimIV肽分子或核酸分子存在于上述人鼻病毒載體，代替了最初存在于上述載體的NimIV序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NimIV肽所獲自的人鼻病毒是人鼻病毒6(HRV6)或者人鼻病毒72(HRV72)。HRV72的NimIV肽可包含在例如人鼻病毒14(HRV14)載體中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NimIV肽所獲自的人鼻病毒的VP1蛋白或者核酸取代了載體中的VP1蛋白或者核酸分子。在另外的實(shí)施方案中，該載體包括與NimIV肽交聯(lián)的滅活人鼻病毒或者與NimIV序列融合的乙型肝炎核心序歹'j(參見例如Fiers等，VirusRes.103:173-176,2004;WO2005/055957;US2003/0138769Al;US2004/0146524A1;US2007/0036826Al)。本發(fā)明還包括藥物組合物，其包含本文描述的肽、核酸分子和載體。該藥物組合物還任選包括一種或多種可藥用稀釋劑、賦形劑、載體和/或佐劑。例示性的佐劑包括幾丁質(zhì)微粒和鋁化合物。此外，該組合物可以任選包括一種或多種附加人鼻病毒中和免疫原。本發(fā)明還包括在被試者中誘導(dǎo)鼻病毒免疫應(yīng)答的方法。這些方法包括給予被試者分離的NimIV肽或核酸分子。在一些實(shí)施方案中，所述被試者沒有受感染但存在發(fā)生鼻病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。在其他實(shí)施方案中，被試者已經(jīng)感染鼻病毒。定義"給藥"或"給予"是指給予哺乳動(dòng)物(例如人)一定劑量本發(fā)明組合物的方法，所述方法是例如鼻內(nèi)給藥、表面(topical)給藥、全身給藥、吸入給藥、口服給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、血管內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、瘤內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、心室內(nèi)給藥、硬腦膜內(nèi)(intraepidural)給藥、鼻腔給藥、直腸給藥、鞏膜內(nèi)(intrascleral)給藥、眼部給藥、目艮內(nèi)給藥或肌肉給藥。根據(jù)不同的因素，例如藥物組合物的組分、潛在和實(shí)際疾病位點(diǎn)(例如待治療的腫瘤或血管病癥的位置)和疾病的嚴(yán)重程度，優(yōu)選的給藥方法可以不同。"人鼻病毒(humanrhinovirus)"(HRV)是指小RNA病毒科(/^<^*"<3^>7'0^6)鼻病毒屬(7^/"01//^^)的<壬<可成員。HRV可以才艮才居血清型進(jìn)行分類，已知其存在的血清型約有100種。例如，HRV14、HRV6、HRV37和HRV92分別是指血清型編號(hào)為14、6、37和92的人鼻病毒。"可藥用載體"是指被治療的哺乳動(dòng)物生理學(xué)上可接受、同時(shí)保留了與其一起給予的化合物預(yù)防或治療特性的載體。一種例示性的可藥用載體是生理鹽水。其他生理上可接受的載體和其制劑已為本領(lǐng)域才支術(shù)人員所熟知，實(shí)例參見例如7emZ"gtow尸/mrmacew"ca/5Wewcas，(第18版),A.Gennaro主編，1990,MackPublishingCompany,Easton,PA，通過引用結(jié)合到本文中。"中和免疫原(neutralizingimmunogen)"(Nim)是指在引入人體之后誘發(fā)抗-HRV中和抗體的人鼻病毒(HRV)序列。對(duì)于本文描述的重組HRV疫苗，NimIV血清型置于上標(biāo)處，以明確說明Nim的來源(例如NimlvHR^是指來源于HRV6血清型的NimIV序列)。"中和免疫原IV肽"或"NimIV肽"為具有鼻病毒結(jié)構(gòu)蛋白1(VP1)羧基末端區(qū)域序列的肽(例如第274-289位氨基酸，使用HRV14(NTEPVIKKRKGDIKSY)作為參考；見圖12B)。NimIV肽可以包括下述的特定序列、附加側(cè)翼序列、或者僅核心、保守序列。此外，該肽可不經(jīng)修飾，因此與天然存在的NimIV序列相同，或者可包括一個(gè)或多個(gè)置換、缺失、插入或其他修飾(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)置換、缺失或插入)，前提是基本維持該肽的免疫原性。此外，NimIV肽可包含L型或D型氨基酸，或其混合物。可以用于本發(fā)明的NimIV肽序列的實(shí)例列舉如下。例如，肽可以具有5-30、8-25、10-20、14-19、15-18或16-17個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。該肽可包含核心NimIV序列，并任選在側(cè)翼具有附加NimIV序列或連接序列(例如在氨基末端和/或羧基末端有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸)。核心NimIV序列的實(shí)例包括PVIKKR、PVIKKRK(HRV14)、PVIKKRE(HRV6和HRV72)、PVIKKRS(HRV92)、PVIEKRT(HRV83)、PKIIKKR(HRV86)、PVIKRRE(HRV35)、PIIAKRE(HRV79)、TIIKKRT(HRV3)、TIVKKRT(HRV3)、TAIVTRP(HRV2)、VAIRPRT(HRV16)、TAIVRRN(HRV1A)、NTEPVIKKRKGDIKSY(HRV14)，和其他與這些序列比對(duì)的HRV序列(例如，參見圖11)。核心序列可定義為例如式A-X,-X2-I-X3-X4-R-X5-B，其中X!-P或T;X2=V、K或I;X3=K、E、I或A;X4-K或R;X5=S、E、D、T、R、T或K;A-O-IO個(gè)附加氨基酸；B=0-10個(gè)附加氨基酸。A和/或B的序列可以為天然存在的NimlV/VPl序列、人工合成序列(例如連接序列)、或其混合物。"中和免疫原IV核酸分子"或"NimIV核酸分子"為本文定義的編碼NimIV肽的核酸分子或其互補(bǔ)核酸分子。如果NimIV肽或核酸分子不包括與其在天然存在病毒上鄰接的側(cè)翼序列，則它是"分離的(isolated)"。此肽或核酸分子可限定為例如VP1全長(zhǎng)序列、VP1羧基末端的一半、VP1羧基末端的四分之一、或VP1的羧基末端15-30個(gè)氨基酸、或核酸序列的相應(yīng)區(qū)域(參見例如Laine等，,Ge".Wra/.87:129-138，2006)。在以下情況中NimIV肽"基本由特定序列組成"其只包含此序列，并在氨基和/或羧基端可能包含最少量側(cè)翼序列(例如1-10、2-9、3-8、4-7或5-6個(gè)氨基酸)，所述側(cè)翼序列可為天然存在的序列、人工序列(例如連接序列)、或其組合。這樣的序列可以存在于更大序列(例如異源病毒或其他載體序列)中。在以下情況中NimIV核酸分子"基本由特定序列組成"其只包含此序列，并在5，和/或3'端可能包含最少量側(cè)翼序列(例如3-30、6-27、9-24、12-21或15-18個(gè)核苷酸)，所述側(cè)翼序列可為天然存在的序列、人工序列(例如連接序列)、或其組合。這樣的序列可以存在于更大序列(例如異源病毒或其他載體序列)中。本發(fā)明其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在以下發(fā)明詳述、附圖和權(quán)利要求中顯而易見。附圖簡(jiǎn)述圖1是CR6基因組的結(jié)構(gòu)區(qū)(下圖)和HRV6與HRV14的NimIV序列的氨基酸比對(duì)(上圖)的圖。圖2A和2B是顯示用豚鼠多克隆抗體抗-HRV14(圖2A)和抗-HRV6(圖2B)進(jìn)行的CR6(NimIV序列為HRV6序列的嵌合體，其包含除NimIV序列以外的HRV14序列，；本文還稱之為CR6;每對(duì)柱中的右柱(綠色))和HRV14(每對(duì)柱中的左柱(棕色))的蝕斑減少中和試驗(yàn)結(jié)果的圖。20K、40K、60K、80K對(duì)應(yīng)的抗體效價(jià)分別為2xl04、4xl04、6xl()4和8xl04。上面(綠色)和下面(棕色)的虛線分別表示HRV14和HRV650%減少的蝕斑數(shù)。圖3A-3D是HRV14和CR6的三維模型。圖3A和3B是基于已知晶體結(jié)構(gòu)(Che等，fW72:4610-4622(1998))使用嵌合體軟件(Chimerasoftware)(http:〃www.cgl.ucsf.edu/chimera/)設(shè)計(jì)的HRV14病毒顆粒的3D模型。VP1、Vp2和VP2分別用深藍(lán)色、紅紫色和灰色表示。HRV14顆粒用空間填充模型表示，其中Nim在其范德華表面(Van-der-Vaalssurface)用顏色標(biāo)明。分別用綠線、藍(lán)線和紅紫色線圍起的面分別表示NimIII、NimIV和NimII。圖中顯示NimIV與NimIII的接觸通過K287來提供。注意到在此模型的Niml被用深綠色表示的Niml-特異性Fabl7所覆蓋。圖3C和3D是"f吏用AccelrysDiscoveryStudiov1.5.1(AccelrysSoftware,Inc.)制作的3D模型。圖3C—HRV14顆粒的Niml、NimII、NimIII和NimIV的空間填充^t型。通過范德華立體表面(Van-der-Vaalssolidsurface)展示Nim的氨基酸殘基。分別用藍(lán)色和9紅色表示正電荷表面和負(fù)電荷表面。圖3D-HRV14和CR6病毒的空間填充模型的比較(僅顯示NimIII和NimIV)?；谝阎木w結(jié)構(gòu)(見上文)和蛋白質(zhì)序列CR6的信息(見圖l)預(yù)測(cè)了CR6的結(jié)構(gòu)。注意HRV14的NimIV的正電荷K287與NimIII的負(fù)電殘基緊密接觸，然而在CR6中因?yàn)镵287T置換這種聯(lián)系被廢止。圖4顯示CR6與鼠抗-HRV37、鼠抗-HRV92和鼠抗-HRV6血清中和的結(jié)果。圖4A是HRV14、HRV37、HRV6和HRV92的NimIV比對(duì)。氨基酸按照HRV14模板(下面)進(jìn)行編號(hào)。相同的區(qū)域用矩形(藍(lán)色)表示。圖4B是顯示用由相應(yīng)純化病毒產(chǎn)生的抗-HRV37、抗-HRV92和抗-HRV6小鼠抗體進(jìn)行的HRV14(每對(duì)柱中的左柱，棕色)和CR6(每對(duì)柱中的右柱，綠色)的蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)研究結(jié)果的一組圖表。50%中和效價(jià)用圖中的虛線或相應(yīng)圖表下的圖中方框內(nèi)數(shù)字(50。/oNUT)表示。圖5顯示基于NimlvH麵和NimlvHRv"特異性合成肽的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖5A是用豚鼠抗-HRV14(GP14)和抗-HRV6(GP6)多克隆抗體檢測(cè)KLH-連接肽H6(NimlvHRV6)和H14(NimlvH,4)的蛋白質(zhì)印跡。圖5B是用相同抗體檢測(cè)的游離H6和H14肽的蛋白質(zhì)印跡，泳道(l)-蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記，泳道(2)-H6-KLH(A)或H6(B)，泳道(3)-H14-KLH(A)或H14(B)。圖5C是顯示用GP6和GP14進(jìn)行H6和H14的ELISA分析結(jié)果的圖。圖6是顯示用鼠抗-HRV14-NimlvHRV6血清進(jìn)行的HRV14和HRV6的蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)研究結(jié)果的圖。這些數(shù)據(jù)顯示NimlvHRV6在HRV14殼體(capsid)本底下的免疫優(yōu)勢(shì)。圖7是顯示HRV14和CR6的蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)研究結(jié)果的圖，該圖顯示了被NimIII單克隆抗體(Mab5)中和的CR6比HRV14少約十倍。圖8是顯示HRV14和CR6的蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)研究結(jié)果的圖，該圖顯示了被NimII單克隆抗體(Mabl6)中和的CR6比HRV14多約五倍。圖9是顯示HRV14和CR6的蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)研究結(jié)果的圖，該圖顯示了被Niml單克隆抗體(Mabl7)中和的CR6比HRV14少約1.5倍。圖10是顯示NimIV影響NimI、NimII和NimlII(50。/o中和效價(jià))的表。圖11顯示NimIII和NimIV序列的比對(duì)，以及這些序列在HRV結(jié)構(gòu)蛋白中的位置。圖12A是CR6和CR72嵌合體的VP1序列的比對(duì)。圖12B是表示HRV基因組的簡(jiǎn)圖，對(duì)HRV6、HRV72和HRV14的NimIV進(jìn)行了比對(duì)。圖13是一對(duì)顯示NimIV賦予嵌合重組體的供體血清型中和特性圖。圖13A顯示用GP72抗體中和CR72(空柱)和HRV14(黑柱)的效價(jià)。圖13B顯示用GP6抗體中和CR6(空柱)和HRV14(黑柱)的效價(jià)。注意GP6和GP72-分別針對(duì)HRV6和HRV72的豚鼠多克隆抗體(ATCC)。圖14是顯示NimIV置換對(duì)HRV14主鏈(backbone)其他Nim(針對(duì)HRV14、CR6和CR72的Niml、II、IIIMab(中和作用))影響的表格。圖15是顯示的抗-CR6和抗-CR72鼠抗血清針對(duì)HRV14、HRV6、HRV72、CR6和CR72的50%中和效價(jià)的表格。發(fā)明詳述總的來講，本發(fā)明涉及人鼻病毒(HRV)的新型免疫原性基因座，以及其在預(yù)防和治療HRV感染的疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明基于我們對(duì)新型HRV中和免疫原(Nim)NimIV發(fā)現(xiàn)，其可作為疫苗^f吏用。如下文所述，此疫苗包括幾種實(shí)施方案。這些實(shí)施方案包括展示異源NimIV抗原的一種或多種重組HRV、單獨(dú)的合成NimIV肽或在病ii毒、蛋白或化學(xué)連接載體中的合成NimIV肽、以及在生物載體中的血清型不同的NimIV肽的生物或化學(xué)融合物的混合物。這樣的HRV疫苗誘發(fā)對(duì)多種HRV血清型產(chǎn)生NimIV-特異性免疫反應(yīng)，可用于預(yù)防性和治療性治療HRV感染。NimIV抗原、包含NimIV的疫苗組合物以及此組合物的使用方法在下文中進(jìn)一步描述。中和免疫原IV(NimIV)鼻病毒(HRV)的三種主要表面中和免疫原(NeutralizingIinmunogen)(Niml、NimII和NimIII)誘發(fā)高特異性中和免疫應(yīng)答。Nim特異性抗體阻斷病毒吸附于細(xì)胞受體(ICAM-1)。本發(fā)明基于新型Nim(NimIV)的發(fā)現(xiàn)，其包括在結(jié)構(gòu)蛋白VP1C末端的一段約17-25個(gè)氨基酸序列并經(jīng)過分子進(jìn)化實(shí)驗(yàn)鑒定。我們證實(shí)了NimIV可在不同HRV血清型之間交換。例如，當(dāng)供體血清型HRV(例如HRV6或HRV72)的NimIV被引入另一種血清型宿主病毒(例如HRV14)中時(shí)，其將供體血清型的中和特征賦予得到的嵌合重組體，從而顯著改變宿主病毒的中和特性。將NimIV摻入重組HRV疫苗會(huì)導(dǎo)致定向針對(duì)(directedagainst)多種HRV血清型的血清交叉反應(yīng)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。利用嵌合型NimIV抗體的重組HRV疫苗理想HRV疫苗的一個(gè)特征是保護(hù)人類免受廣范圍HRV血清型的HRV感染風(fēng)險(xiǎn)的能力。本發(fā)明疫苗的特征在于能夠誘發(fā)針對(duì)引起人類疾病的眾多HRV血清型(例如大部分或更理想的是所有HRV血清型)的保護(hù)性和治療性免疫應(yīng)答。這可以通過在疫苗中使用多種NimIV序列來實(shí)現(xiàn)，包括例如將供體血清型的NimIV抗原添加(addition)到一小群宿主血清型HRV中。如我們?cè)谙挛乃?，轉(zhuǎn)移的NimIV抗原引起血清型特異性的強(qiáng)烈中和抗體反應(yīng)。在嵌合型疫苗或重組疫苗中，第一血清型NimIV抗原與第二血清型宿主HRV結(jié)合12(combination)會(huì)誘發(fā)定向針對(duì)這兩種HRV血清型的中和抗體，因而與不是在NimIV基因座嵌入的疫苗相比，得到更廣泛的保護(hù)性或治療性益處。例如，用NimIVHRV6置換HRV14的NimlvHRv"(即在HRV血清型14中的NimIV抗原)得到HRV疫苗CR6(下文進(jìn)一步討論)。此疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生同時(shí)定向針對(duì)HRV14和HRV6血清型的中和抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用NimIVHRV72置換HRV14的NimlvHRv"得到HRV疫苗CR72(下文進(jìn)一步討論)。此疫苗產(chǎn)生同時(shí)定向針對(duì)HRV14和HRV72血清型的中和抗體。由此構(gòu)建的重組HRV混合物(其包含眾多供體血清型NimIV抗原和有限宿主血清型HRV組合)代表用于預(yù)防或治療HRV感染的理想疫苗。NimIV肽本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案是人工合成或天然來源的NimIV肽的應(yīng)用，此NimIV肽與NimIV基因座的氨基酸序列相對(duì)應(yīng)。本文其他地方提供了此肽的實(shí)例(見例如發(fā)明概述和實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例)。給予由許多HRV血清型合并的肽混合物，誘發(fā)對(duì)預(yù)防或治療HRV感染的廣泛保護(hù)性中和抗體應(yīng)答。NimIV肽混合物可以單獨(dú)給藥或與可藥用佐藥或免疫系統(tǒng)刺激劑聯(lián)合給藥(見下文)。NimIV融合分子本發(fā)明另一方面是NimIV抗原與生物載體的化學(xué)或生物融合用作HRV疫苗。在上下文中，來源于一種或多種血清型的NimIV肽與合適的生物載體(例如乙型肝炎核心抗原)結(jié)合(bond)，以延長(zhǎng)NimIV肽降解半衰期，提高其組織滲透率(penetrance)和特異性、可探測(cè)性或免疫原性。此NimIV融合分子的混合物(取自(drawnfrom)許多HRV血清型)可用于接種人以預(yù)防或治療HRV感染。在其他實(shí)施方案中，NimIV肽(其可來源于許多不同血清型)與HRV載體交聯(lián)。給藥和劑量本發(fā)明還提供組合物，該組合物包含本文描述的預(yù)防上或治療上有效量的一種或多種人鼻病毒疫苗。HRV疫苗的混合物可在相同的藥物組合物(單一劑型)或分開的藥物組合物(分開劑型)中存在，其可伴隨(concomitantly)給藥或分不同次數(shù)給藥。該組合物可經(jīng)配制用于多種遞藥系統(tǒng)。組合物還可以包含一種或多種生理上可接受的賦形劑或載體用作合適的制劑。病毒可以凍干形式或溶解在生理上可容的溶液或緩沖液(例如鹽水或水)中。制備和配制的標(biāo)準(zhǔn)方法可以應(yīng)用在例i口Remington'sPharmaceuticalSciences(第18片反)，A.Gennaro(主編)，1990,MackPublishingCompany,Eastern,PA中所描述的方法。該組合物預(yù)期用于鼻內(nèi)給藥、胃腸外給藥、表面(topical)給藥、口服給藥或局部給藥用以預(yù)防性和/或治療性治療。一^:而言，該組合物是鼻內(nèi)給藥(例如通過噴霧法或滴鼻劑)、胃腸外給藥(例如通過肌肉、皮下或靜脈注射)、或口服法、或通過表面施用或關(guān)節(jié)內(nèi)注射。另外的給藥途徑包括血管內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、瘤內(nèi)給藥、腹腔內(nèi)給藥、心室內(nèi)給藥、硬腦膜內(nèi)給藥，以及眼部給藥、鞏膜內(nèi)給藥、眼眶內(nèi)給藥、直腸給藥或表面給藥。本發(fā)明還特別地包括緩釋纟合藥，通過如長(zhǎng)效注射(depotinjection)或可蝕性4直入物(erodibleimplant)或可蝕性成分的方法。因此，本發(fā)明提供用于粘膜給藥或胃腸外給藥的組合物，其包含溶解或懸浮在可接受載體、優(yōu)選含水的載體(例如水、緩沖水、鹽水、PBS等等)中的上述作用劑。該組合物可含有根據(jù)接近生理?xiàng)l件所需的可藥用輔助物質(zhì)，如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張度調(diào)節(jié)劑、濕潤(rùn)劑和去污劑等等。本發(fā)明還提供用于經(jīng)口遞送的組合物，其可含有惰性成分，例如用于配制片劑和膠嚢等等的粘合劑或充填劑。另外，本發(fā)明提供局部給藥的組合物，其可含有惰性成分，例如用于配制霜?jiǎng)┖蛙浉鄤┑鹊鹊娜軇┗蛉榛瘎＿@些組合物可通過常規(guī)滅菌技術(shù)滅菌或過濾除菌。所得到的水溶液可包裝待使用或進(jìn)行凍干，凍干制劑與無菌水載體結(jié)合后再給藥。制劑的pH通常在3-ll之間，例如5-9、6畫8或7-8,如7隱7.5。得到的固體組合物以多個(gè)單劑量單元包裝，每單元含有固定量的上述藥劑(agent或agents),例如以密封包裝的片劑或膠嚢的形式。該組合物還可以包括凍干形式的有效成分，其在給藥時(shí)重新溶解(reconstitute)。包含有效量疫苗的該組合物可經(jīng)給藥用以預(yù)防性和/或治療性治療。在預(yù)防性應(yīng)用中，組合物可以以對(duì)HRV感染敏感性增加的量給予對(duì)象(例如人類對(duì)象)。本發(fā)明的組合物以足夠量給予對(duì)象(例如人)以延緩、減少或防止臨床或亞臨床疾病的發(fā)病。在治療性應(yīng)用中，組合物以足夠量給予受HRV感染的患者(例如人)，以治愈或至少部分阻止此病癥的癥狀及其并發(fā)癥。足以達(dá)到此目的的量被定義為"治療有效量"。適宜的劑量和服法可容易由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。此應(yīng)用的有效量可取決于疾病的嚴(yán)重性或患者的病況、體重和一般狀況，而通常每名患者每劑量在約0.5mg-約3000mg藥劑的范圍。疫苗只能一次性給藥或按初次/加強(qiáng)服法給藥。用于初次給藥和加強(qiáng)給藥的適宜服法是指在初次給藥后，隨后以一個(gè)或多個(gè)小時(shí)、一天或多天、一周或多周或者一個(gè)或多個(gè)月的間隔給予重復(fù)劑量。存在于本發(fā)明組合物中的有效總量的藥劑可以作為單劑量給予哺乳動(dòng)物(以彈丸注射(bolus)或在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)注入)，或者可以^使用分段治療(fractionatedtreatment)方案給藥，即在更長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)分多劑給藥(例如每4-6、8-12、14-16或18-24小時(shí)一劑，或每2-4天、1-2周、每月一劑)。法中使用的治療有效量的一種或多種藥劑，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮了哺乳動(dòng)物的年齡、體重、免疫系統(tǒng)完整性和病況的個(gè)體差異后確定。本發(fā)明的藥劑以有效量給予對(duì)象(例如哺乳動(dòng)物，如人類、小鼠、家畜(例如牛、羊或豬)、家庭寵物(例如貓或狗)，此有效量為在治療患者時(shí)達(dá)到所期望的結(jié)果的量(例如預(yù)防易感個(gè)體的HRV感染或減輕感染個(gè)體的癥狀)。此治療有效量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員15通過經(jīng)驗(yàn)來確定。本發(fā)明疫苗可以與其他接種方法和其他治療方法(例如基于小分子的方法)聯(lián)用。例如，病毒可以聯(lián)合包括相同或不同抗原的其他重組疫苗給藥。本發(fā)明的聯(lián)合方法包括本發(fā)明疫苗與其他抗原形式共給藥。或者，本發(fā)明的疫苗可與其他方法(如亞單位法或HBc法(HBc-M2e;Fiers等，VirusRes.103:173-176，2004;WO2005/055957;US2003/0138769Al;US2004/0146524A1;US2007/0036826Al))以初次-加強(qiáng)策略聯(lián)用，本發(fā)明的疫苗或另一種方法用作初次，然后另一種方法用作加強(qiáng)，或相反。另外，本發(fā)明包括將本發(fā)明疫苗同時(shí)用作初次劑和加強(qiáng)劑的初次-加強(qiáng)策略。本發(fā)明的疫苗可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法給予對(duì)象，例如哺乳動(dòng)物(例如人類對(duì)象)。對(duì)于鼻內(nèi)給藥，載體可以以滴鼻劑形式給藥或通過吸入霧化或噴霧制劑給藥。本發(fā)明的載體可以作為活疫苗或滅活疫苗給予對(duì)象(例如人類)。活疫苗可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法鼻內(nèi)給藥(見例如GrUnberg等，Am.J.Respir.CritCar.Med.156:609-616,1997)。適宜的劑量和服法可容易通過本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。作為實(shí)例，劑量范圍可以為每劑103-108pfU。該疫苗以單劑量給藥會(huì)有利，然而如果本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為有需要，還可給予加強(qiáng)劑量。至于滅活疫苗，可以用例如福爾馬林或UV處理殺死病毒，以每劑約108pfo任選與合適佐劑(例如幾丁質(zhì)或突變LT，見上文)進(jìn)行鼻內(nèi)給藥。在此方法中，不止一劑(例如2-3劑)給藥會(huì)是有利的。包含在本發(fā)明疫苗的肽或蛋白質(zhì)的大小可以在例如3-3000個(gè)氨基酸(例如5-500、10-100、20-55、25-45或35-40個(gè)氨基酸)的長(zhǎng)度范圍內(nèi)，其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定。因此，本發(fā)明可以應(yīng)用長(zhǎng)度在7-25、12-22和15-20個(gè)氨基酸范圍內(nèi)的肽。另外，本文所述的肽可以包括附加序列或可以減少長(zhǎng)度，還可以由本領(lǐng)域4支術(shù)人16在，或可以通過例如置換或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)氨基酸)來進(jìn)行修飾。另外，該肽可以位于較大的肽內(nèi)而存在于疫苗中。任選地，諸如上文和本文其他地方描述的肽在氨基端和/或羧基端包括附加序列，而不管這些序列與肽序列天然連接(例如，在流感病毒基因組中該序列與所述肽鄰接)或否(例如合成連接序列)。因此，所述肽可以包括例如在一端或兩端的1-25、2-20、3-15、4-10或4-8個(gè)氨基酸序列。作為具體實(shí)例，所述肽可在氨基端和/或羧基端包括1-3個(gè)連接序列。佐劑在疫苗應(yīng)用中，可以任選使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的佐劑。佐劑是根據(jù)給藥途徑來選擇的。對(duì)于鼻內(nèi)給藥，可以使用幾丁質(zhì)微粒(CMP)(Asahi-Ozaki等，M^ro6ey8:2706-2714，2006;Ozdemir等,C7/m'ca/aw/五x/w'me幽/j〃ergy36:960-968，2006;Strong等，C"m'ca/五;c;en'we"taM〃erg);32:1794-1800,2002)。適用于粘膜途徑給藥(例如鼻內(nèi)或口服途徑)的其他佐劑包括大腸桿菌(五.co")的不耐熱毒素(LT)或其突變衍生物。對(duì)于滅活病毒，可以使用胃腸外佐劑，包括例如鋁化合物(例如氫氧化鋁、磷酸鋁或羥基磷酸鋁化合物)、脂質(zhì)體制劑、合成佐劑例如(如QS21)、胞壁酰二肽、單磷酰脂質(zhì)A或聚磷溱(polyphosphazine)。另外，可以將編碼具有佐劑活性的細(xì)胞因子的基因插入載體。因此，可以將編碼細(xì)胞因子例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13或IL-5的基因與外源性抗原基因共同插入，以產(chǎn)生起以下作用的疫苗增強(qiáng)免疫應(yīng)答，或調(diào)整對(duì)細(xì)胞、體液或粘膜應(yīng)答特異性更強(qiáng)的免疫性?；蛘撸梢酝ㄟ^熟悉的方法(例如直接接種、棵DNA、在病毒的載體中等等)使細(xì)胞因子與重組疫苗病毒同時(shí)、序貫、分開遞送。實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例17NimIV的鑒定我們發(fā)現(xiàn)了中和免疫原NimIV，其包含長(zhǎng)度為17-25個(gè)氨基酸的非保守病毒結(jié)構(gòu)蛋白1(VP1)C末端序列。此表位可以在HRV血清型之間交換。如果NimIV被置換，它會(huì)將其中和特性賦予異源HRV。研究表明，NimIV的相應(yīng)合成肽在ELISA和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)中能被病毒特異性抗體識(shí)別。在下述進(jìn)行的分子進(jìn)化實(shí)驗(yàn)(VP1基因改組(geneshuffling))中，分離得到兩個(gè)活性嵌合體HRV14-NimIVHRV6(CR6)和HRV14-NimIVHRV72(CR72)。如圖12A給出的比對(duì)所示，CR6和CR72的VP1序列包含幾個(gè)個(gè)別的氨基酸取代，并且在CR6和CR72中NimlV冊(cè)v6和NimlV服v72分別置換了NimIVHRV14。NimIV的比對(duì)(圖12B)顯示所有NimIV病毒都含有保守中心域(PVIKKRK/E)，而側(cè)翼區(qū)是變化的。有趣的是，在所有HRV血清型(RM2506)中，第279-282位的氨基酸都顯示出十分保守或相似。CR6和CR72的嵌合體顯示出與多克隆豚鼠抗體GP6和GP72(ATCC)的強(qiáng)中和性，而這些抗體不中和主鏈病毒(backbonevirus)(HRV14;圖13)。結(jié)果顯示，與GP6或GP72相比針對(duì)HRV6和HRV72得到的小鼠多克隆抗體中和CR6和CR72的效價(jià)低10倍，其證實(shí)CR6和CR72的NimIV決定子是表面外露的，并以有利的構(gòu)象用以與中和抗體結(jié)合。嵌合體中這些表位的構(gòu)象很可能與野生型病毒的一致。作為分離NimIV置換方法的DNA改組在產(chǎn)生HRV嵌合體CR6之后發(fā)現(xiàn)NimIV是可能的，該嵌合體具有(carry)以下置換VP1C末端部分的18個(gè)氨基酸被HRV6相應(yīng)的17個(gè)氨基酸區(qū)域置換(見圖1)。此序列通過DNA改組，隨后將此片段重新克隆到HRV14感染性克隆中來得到(DNA改組方法綜述參見Patten等人，DNA改組在藥物和疫苗中的應(yīng)用("ApplicationsofDNAshufflingtopharmaceuticalsandvaccines")，Cw/r(9p/"說otec/mo/8:724-733(1997);使用的實(shí)例包括Zhang等，由DNA改組和通過噬菌體展示文庫得到的病肝病毒高變區(qū)1的廣泛交叉反應(yīng)模擬位("Broadlycross-reactivemimotopeofhypervariableregion1ofhepatitisCvirusderivedfromDNAshufflingandscreenedbyphagedisplaylibrary"),/Mec/Wra/71:511-517(2003);Castle等，草甘膦耐受基因的發(fā)i見及定向進(jìn)4b("Discoveryanddirectedevolutionofaglyphosatetolerancegene"),5We"ce304:1151-1154(2004);Pekrun等，通過DNA改組在豬尾恒河猴細(xì)胞中復(fù)制增強(qiáng)的1型人免疫缺陷病毒的進(jìn)化("Evolutionofahumanimmunodeficiencyvirustype1variantwithenhancedreplicationinpig-tailedmacaquecellsbyDNAshuffling"),</Wra/76:2924-2935(2002);Toth等，通過DNA改組提高植物病毒載體移動(dòng)及宿主范圍4f4爭(zhēng)'l"生("ImprovementofthemovementandhostrangepropertiesofaplantvirusvectorthroughDNAshuffling"),尸/贈(zèng)/30:593-600(2002);Kaper等，超熱穩(wěn)定的卩糖苷酶的DNA家族改組("DNAfamilyshufflingofhyperthermostablebeta-glycosidases")，^oc&mJ368:461-470(2002).;Wang等，底物最佳化GroEL/S陪伴蛋白的定向進(jìn)4匕("Directedevolutionofsubstrate-optimizedGroEL/Schap飄ins，，)，Ce〃111:1027-1039(2002);和Hurt等，通過定向結(jié)構(gòu)域改組和基于細(xì)胞選擇獲得的高特異性鋅指蛋白("Highlyspecificzincfingerproteinsobtainedbydirecteddomainshufflingandcell-basedselection"),尸rociVW/爿cWC/.SJ100:12271-12276(2003))。DNA改組實(shí)驗(yàn)包含了約100個(gè)VP1序列(Ledfoni等，所有人鼻病毒血清型的VP1測(cè)序了解種系發(fā)育和對(duì)抗病毒殼體結(jié)合化合物的敏感性("VP1sequencingofallhumanrhinovirusserotypes:insightsintogenusphylogenyandsusceptibilitytoantiviralcapsid-bindingcompounds"),/78:3663-3674(2004))。CR6同時(shí)被GP6和GP14中和CR6嵌合體的中和特異性顯示出與親代(parental)HRV14載體(pWR3.26感染性克隆)不同。除了檢測(cè)到CR6與HRV14-特異性多克隆豚鼠抗體的中和作用之外(GP14;圖2A)，我們還發(fā)現(xiàn)其與豚鼠HRV6-特異性抗體的中和作用(GP6;圖2B)，然而親代HRV14不被GP6中和(圖2)。這表明HRV6的C末端結(jié)構(gòu)域具有免疫原性和中和性。CR6被Niml和NimII特異性單克隆抗體強(qiáng)烈中和，但不能被NimIII特異性單克隆抗體強(qiáng)烈中和在HRV14本底中存在的NimIVHRV6(CR6)改變了其他Nim(HRV14)的中和作用(NA)。用NimHRV14特異性單克隆抗體(mAb)進(jìn)行的PRNT顯示CR6NimIII特異性中和作用降低(約10倍；圖7)，而NimII特異性NA提高(5倍；圖8);Niml特異性中和作用僅受輕微影響(1.5倍；圖9和16)。圖10概述了這些發(fā)現(xiàn)。NimlvH腿和NimlvHRv"對(duì)主鏈Nim的中和效能的影響為了研究NimIV置換對(duì)主鏈Nim中和特性的影響，針對(duì)CR6和CR72使用一組HRV14Nim特異性小鼠單克隆抗體(圖14)。兩種嵌合體的Niml中和能力受輕微影響，但CR6對(duì)NimII和NimIII分別表現(xiàn)出中和率(neutralizationrate)提高5倍和降低10倍。相反，CR72的NimIII依賴性中和作用則不受影響。遺憾的是，因?yàn)槭艿娇贵w供應(yīng)的限制，沒有研究NimII-特異性抗體對(duì)CR72的中和作用。這些數(shù)據(jù)證明了NimIV和NimIII結(jié)構(gòu)域間存在強(qiáng)相互作用，這與結(jié)晶學(xué)和以往得到的誘變數(shù)據(jù)一致。CR6和HRV14中NimIV與其他Nim相互作用的建模這些結(jié)果顯示NimIVHRV6對(duì)于CR6構(gòu)象完整性的重要性。3D建模是在已知晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上完成的，所述晶體結(jié)構(gòu)顯示在HRV14中(但不在CR6顆粒中)NimIII與NimIV緊密接觸(圖3B、D)(Che等，通過病毒-Fab復(fù)合體的冷凍電子顯微鏡術(shù)和X衍射晶體學(xué)20研究人鼻病毒14的抗體介導(dǎo)中和作用("Antibody-mediatedneutralizationofhumanrhinovirus14exploredbymeansofcryoelectronmicroscopyandX-raycrystallographyofvirus-Fabcomplexes"),/KZra/72:4610-4622(1998))。在HRV14中，這種接觸與VP1的正電荷K287有關(guān)，通過K287NimIV與NimIII的負(fù)電荷殘基相互作用(圖3B、D)。在CR6中，T287突變廢止了這種聯(lián)系(圖3D)。有趣的是，K287突變對(duì)NimIII特異性中和用作的負(fù)面作用先前已有文獻(xiàn)記載(Sherry等，利用單克隆抗體鑒定普通感冒小RNA病毒人鼻病毒的四種中和免疫原("Useofmonoclonalantibodiestoidentifyfourneutralizationimmunogensonacommoncoldpicornavirus,humanrhinovirus"),/Wra/57:246-2571986))，但作者認(rèn)為VP1的C末端區(qū)域不是中和免疫原(Nim),因?yàn)闆]有逃逸突變體與對(duì)此區(qū)域特異的單克隆抗體起中和作用。CR6的NimlVHRW僅輕微影響Niml特異性中和作用，這可以部分通過此表位與NimIV的距離較遠(yuǎn)來解釋(圖3C)。CR6的唯一特征是其對(duì)NimII特異性中和作用的敏感性提高5倍(圖14)。這種提高不能通過NimlVH麵與NimllHRv"的直接物理接觸解釋。3D建模顯示在病毒顆粒中這兩個(gè)Nim的位置相距較遠(yuǎn)(圖3A-C)。此現(xiàn)象最可能通過VP2構(gòu)象變化來解釋，VP2構(gòu)象的變化可能更利于單克隆抗體結(jié)合接觸病毒顆粒表面的NimII。CR6的交互中和作用概況NimlvHR^與所有100種血清型的NimIV的比對(duì)確定出其兩種最接近的匹配HRV37與HRV92的C末端(見圖4A)。分析顯示NimIV存在三個(gè)區(qū)域由6個(gè)氨基酸(AA)(P-V-I-K-K-R)組成的保守(核心)區(qū)，以及核心區(qū)上游和下游的兩個(gè)區(qū)。7種緊密相關(guān)的病毒(HRV14、HRV72、HRV83、HRV86、HRV35、HRV79和HRV3;見圖ll)的NimIV中也4企測(cè)到核心。這里值得關(guān)注的是，在所有100種HRV血清型中，發(fā)現(xiàn)R282是保守的。如圖4A所示，NimIVHRV621和NimIVHRV37的6個(gè)AA下游區(qū)域幾乎相同(D/E-N-I-T-T-Y)，而HRV92的對(duì)應(yīng)序列(S-L-I-T-N-Y)與它們差異較大。NimIVHRV6與NimIVHRV92的上游域具有兩個(gè)相同的氨基酸，而NimIVHRV37的相應(yīng)區(qū)域與NimIVHRV6則沒有明顯的相似性。NimIV之間的這種差異提供了機(jī)會(huì)評(píng)估表位的哪些部分對(duì)CR6病毒中和作用具有重要性。為了研究這一方面，我們制備了針對(duì)這三種血清型的鼠恢復(fù)期血清，并測(cè)試它們對(duì)CR6病毒的中和作用(圖4B)。雖然NimIVHRV6和NimlvHR，抗HRV37的下游區(qū)具有廣泛同源性，但血清不顯示中和作用，證明下游區(qū)對(duì)于中和作用無重要性。相反，與抗-HRV6相比抗-HRV92血清的NA僅稍微降低。這三個(gè)血清樣品都不能中和HRV14。這些結(jié)果表明了NimIV的功能性分析，并提供證據(jù)證明了上游區(qū)的交叉中和活性比核心區(qū)和下游區(qū)高。為了回答這些病毒被小鼠抗體識(shí)別的差異性是否反映了它們與NimIV特異性序列的實(shí)際相互作用的問題，我們合成了NimIVHRV14和NimlvH,-特異性肽，并用同一套抗體進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡和ELISA實(shí)驗(yàn)。NimIV特異性肽與GP14和GP6的免疫反應(yīng)性在血清型特異性肽之間的差異在蛋白質(zhì)印跡(圖5A-B)和ELISA(圖5C)實(shí)驗(yàn)中，GP6和GP14特異性識(shí)別同源性NimIV特異性肽。圖5A和5B分別表示用KLH-連接材料和游離肽得到的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果。因?yàn)镵LH的分子量很大(約3xl05kDa)，所以圖5A的蛋白質(zhì)條帶呈成片條帶。給定肽的免疫反應(yīng)性特異性很高，因用肽/抗體異源組合(GP6/NimlvHKv14或GP14/NimlvHRv"沒有檢測(cè)到任何信號(hào)。KLH-連接材料中的異源組合有微弱信號(hào)歸因于KLH特征。這些結(jié)果是HRV6和HRV14表面的NimIV表位為線性和具有高特異性的證據(jù)，HRV6和HRV14的純化樣品分別用于生產(chǎn)GP6和GP14。這些肽之間沒有顯著交叉反應(yīng)性，證明了這些Nim的核心部分免疫原性低。若此表述不正確，則在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該觀察到高交叉免疫反應(yīng)性。這些肽與GP6和GP14的高識(shí)別特異性還通過ELISA得以證實(shí)(圖5C)。H14與GP14的反應(yīng)性比H6與GP6的反應(yīng)性低表明病毒顆粒表面的NimIV表位呈遞差異。這些結(jié)果與圖2所描述的PRNT數(shù)據(jù)相反。這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中均無鑒定到HRV14和HRV6之間或它們的NimIV特異性肽之間有顯著交叉反應(yīng)性。體內(nèi)試驗(yàn)抗-CR6血清中和HRV6用100^1與佐劑(氫氧化鋁)混合的病毒懸浮液(105pfo/ml)或模擬品(稀釋劑)腹膜內(nèi)免疫接種11-12周齡雌性Blb/c小鼠3次(在第1、14和28天)。最后小鼠在第49天采血。為了測(cè)試血清抗體水平，在接種之前(基線)，以及在異氟醚吸入麻醉下經(jīng)眼后途經(jīng)或不經(jīng)麻醉經(jīng)下頜骨途經(jīng)免疫接種后第30-40天對(duì)小鼠采血(體積不超過7.7|il/g體重)。PPNT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HRV6與2只小鼠的血清庫的特異性中和作用(圖6)。這也顯示了HRV14病毒中和作用降低，這提供了證據(jù)表明NimlvHK^在CR6中是優(yōu)勢(shì)免疫表位。方法肽和綴合物通過Biosynthesis,Inc(Lewisville,TX)用標(biāo)準(zhǔn)固相合成法制備寡肽NimIVHRV6、NimlvHRV72和NimIVHRV14，這些寡肽分別與HRV6(CKNIVPVIKKRENITTY)、HRV14(CNTEPVIKKRKGDIKSY)和HRV72(CNPKPVIKKREGDIKTY)結(jié)構(gòu)區(qū)的C-末端對(duì)應(yīng)。通過使用交聯(lián)劑4-(對(duì)馬來酰亞胺基苯基)-丁酸琥珀酰亞胺酯(sMBS)和還原劑TCEP.HC1鹽酸三(2-羧基乙基)膦(TCEPHCL)，使肽材料的部分與C。wc/o—cwcowc/o/e戸的血藍(lán)蛋白(KLH)綴合。細(xì)月包培養(yǎng)、病毒繁殖和試劑通過連續(xù)感染靶Hl海拉細(xì)胞(HeLacell),將HRV血清型6、2314、35、37、72、83、86、92原種(ATCC)擴(kuò)增至高滴度。將海拉細(xì)胞(ATCC)維持在含有5Q/o胎牛血清(JRHBiosciences,KS)的最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MinimumEssentialMedium)(Invitrogen)中以進(jìn)行常規(guī)繁殖。在傳代過程中，使細(xì)胞維持在分會(huì)合生長(zhǎng)狀態(tài)。于34°C下48小時(shí)后，經(jīng)過3次在-80和37°C下的凍融循環(huán)，使病毒從細(xì)胞中釋放。棄去細(xì)胞碎片，同時(shí)將含有擴(kuò)增病毒的上清液分成等份并在-80。C冷凍。從ATCC獲得用于HRV血清型6、14、72、92和37的豚鼠抗血清。VP1基因改組病毒文庫通過RT-PCR從HRV血清型6、14、35、37、72、79、83、86和92的RNA擴(kuò)增VP1的DNA片段。為了作進(jìn)一步克隆，通過重組PCR去除HRV血清型83、86、92的VP1基因中存在的固有AvrII位點(diǎn)。將所有PCR片段合并在一起并進(jìn)行改組，隨后克隆到改良的HRV14cDNA載體pWR3.26(ATCC)。簡(jiǎn)而言之，用DNaseI(AmershamPharmaciaBiotech,Inc)處理2微克合并的PCR片段，膠純化出50-100bpDNA片段部分，然后不需引物進(jìn)行15-25個(gè)循環(huán)的PCR(94°C30sec,55°C30sec,72°Clmin),接著用克隆引物進(jìn)行25個(gè)循環(huán)的PCR(94°C30sec，55°C30sec,72。Clmin)。將擴(kuò)增改組VP1序列文庫克隆到改良的pWR3.26質(zhì)粒的Xhol和AvrII位點(diǎn)。為此目的，通過插入在VP1序列5，位的Xhol位點(diǎn)來改良HRV14cDNA克隆pWR3.26(圖12)。將Xhol和AvrII位點(diǎn)分別摻入到VP1正向和反向克隆引物。VP1改組質(zhì)粒DNA文庫通過Mlul消化進(jìn)^f亍線性化和并通過T7轉(zhuǎn)錄試劑盒(Epicentere，Inc)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。RNA用lipofectine(Invitrogen，Inc)轉(zhuǎn)染到H1-海拉細(xì)胞(ATCC)中。于34°C培養(yǎng)2-4天后收集細(xì)胞。細(xì)胞樣品經(jīng)過三個(gè)凍融循環(huán)，上清液用于感染單層Hl-海拉細(xì)胞。病毒文庫保藏在-80。C。HRV14-NimlV重組病毒的分離從上述病毒文庫蝕斑純化HRV14-NimIVHRV6(CR6)嵌合體。為了分離其他HRV14-NimIVHRVX重組體，用病毒文庫的總RNA作模板，通過8條退火至VP1基因3，-末端的血清型-特異性反向引物進(jìn)行8個(gè)不同的RT-PCR反應(yīng)。所有這些反應(yīng)都使用相同的正向引物，該引物與VP1基因的上游保守區(qū)互補(bǔ)。將得到的PCR片段重新克隆到上述用于VP1改組體(shuffliant)的pWR3.26質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)染到Hl-海拉細(xì)胞后，將各別的病毒進(jìn)行蝕斑純化并測(cè)序。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案取8周齡的雌性Balb/c小鼠(IO只/組)，通過腹膜內(nèi)給予500pL與100嗎佐劑(氫氧化鋁)混合的過濾細(xì)胞培養(yǎng)基，在第0天對(duì)小鼠進(jìn)行初次接種，然后在第14和28天進(jìn)行加強(qiáng)接種，該細(xì)胞培養(yǎng)基每劑含有約1.0x106pfo的(1)HRV14-NimIVHRV6、(2)HRV14-NimIVHRV72、(3)親本HRV14或模擬物(培養(yǎng)上清液)作為陰性對(duì)照。使用與(或不與)KLH肽偶聯(lián)的NimlvHKV6和NimlvHKV6免疫接種8周齡雌性Balb/c小鼠。小鼠在第0天用100^1含15嗎KLH-連接肽的TitermaxGold(1:1乳化劑)經(jīng)皮下途徑進(jìn)行初次接種，(在第36天和第49天)通過腹膜內(nèi)給予15(ig溶解在100^1PBS的"游離"肽來進(jìn)行兩次加強(qiáng)接種。通過在包被了相應(yīng)合成NimIV肽的微量滴定板中進(jìn)行的確立ELISA，測(cè)定血清中NimIV特異性抗體效價(jià)。蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT)將約50pfU研究的HRV(在完全MEM+5%FBS培養(yǎng)基中)與樣品血清的各級(jí)稀釋液混合，總體積為300pL,于4。C下孵育過夜。在12孔組織培養(yǎng)板中，用100微升每種混合物感染1孔Hl-海拉細(xì)胞(每孔接種6xl05Hl-海拉細(xì)胞，于37°C下培養(yǎng)箱中孵育過夜)。于34°C下孵育1小時(shí)后，用ImLMEM中的0.4%瓊脂糖和含有青霉素/鏈霉素的10%FBS覆蓋細(xì)胞，并于34°C下孵育約3天。然后用曱醛(終濃度為3.7%)固定單細(xì)胞層，并用含1%結(jié)晶紫的70%曱醇染色。ELISA用5pg/mlNimIV特異性肽或純化的HRV14病毒包被96孔板，于4。C下過夜。于37。C下用不同稀釋度的抗血清孵育微孔板1小時(shí)，然后用1:1000羊抗鼠IgG-AP(SouthernBiotech,Inc)于37。C下綴合合小時(shí)。如廠家(Sigma,Inc)所述，微孔板在堿性磷酸酶底物中顯影。蛋白質(zhì)印跡將20貼肽在10%tris-甘氨酸SDS膠(Novex,Invitrogen,Inc)上點(diǎn)樣，電泳運(yùn)行一小段時(shí)間后，將肽轉(zhuǎn)移到硝基纖維素膜(Bio-Rad，Inc)上。在室溫下用封閉液(含5%脫脂乳的PBS/0.05。/。吐溫)將膜浸泡1小時(shí)，實(shí)現(xiàn)膜的非特異性結(jié)合。將膜用含豚鼠抗-HRV6或抗-HRV14多克隆抗體(ATCC)(1:1000)的封閉液于4°C下孵育過夜。將膜用PBS/0.05。/。吐溫洗滌3次，每次15分鐘，然后用含羊抗鼠IgG-AP綴合抗體(SouthernBiotech)的封閉液在室溫下孵育1小時(shí)。膜在AP底物(SigmaSIGMAFASrTMBCIP/NBT)中顯影10分鐘。其他實(shí)施方案所有出版物、專利申請(qǐng)和本說明書提及的專利通過引用結(jié)合于本文中。在不背離本發(fā)明的范圍和精神下，本發(fā)明描述的方法和系統(tǒng)的多種修改和變更對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員都是顯而易見的。雖然已結(jié)合具體所需的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解的是，所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)過分限于這些具體實(shí)施方案。用于實(shí)施本發(fā)明所描述的各種修改，無疑對(duì)醫(yī)學(xué)、藥物學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見26的，并意欲落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文使用的單數(shù)形式，例如"一個(gè)(種)，，和"所述"，不排除相應(yīng)的復(fù)數(shù)形式，除非上下文表明具有相反意思。權(quán)利要求1.一種分離的鼻病毒中和免疫原IV(NimIV)肽。2.權(quán)利要求1的肽，其中所述NimIV肽是人鼻病毒14(HRV14)NimIV肽。3.權(quán)利要求1的肽，其中所述NimIV肽包含人鼻病毒的病毒結(jié)構(gòu)蛋白1(VP1)羧基末端區(qū)域的第277-283位氨基酸。4.權(quán)利要求3的肽，其中所述肽包含人鼻病毒的VP1羧基末端區(qū)域的第275-285位氨基酸。5.權(quán)利要求1的肽，其中所述肽的序列包含選自以下的序列PVIKKR、PVIKKRK(HRV14)、PVIKKRE(HRV6和HRV72)、PVIKKRS(HRV92)、PVIEKRT(HRV83)、PKIIKKR(HRV86)、PVIKRRE(HRV35)、PIIAKRE(HRV79)、TIIKKRT(HRV3)、NTEPVIKKRKGDIKSY(HRV14)和A-X^Xrl-XrX^R-Xs-B，其中X^P或T;X2=V、K或I;X3=K、E、I或A;X^K或R;X5=S、E、D、T、R、T或K;A=0-10個(gè)附加氨基酸；和B-0-10個(gè)附加氨基酸。6.編碼NimIV肽的分離的核酸分子或其互補(bǔ)核酸分子。7.包含分離的NimIV肽或核酸分子的載體。8.權(quán)利要求7的載體，其中所述載體是人鼻病毒載體。9.權(quán)利要求8的載體，其中所述人鼻病毒載體的血清型與NimIV肽所獲自的人鼻病毒的血清型不同。10.權(quán)利要求9的載體，其中所述NimIV肽或核酸分子取代了初始存在于所述載體中的NimIV序列存在于所述人鼻病毒載體中。11.權(quán)利要求8的載體，其中所述人鼻病毒載體是人鼻病毒14(HRV14)載體。12.權(quán)利要求7的載體，其中所述NimIV肽所獲自的人鼻病毒是人鼻病毒6(HRV6)或人鼻病毒72(HRV72)。13.權(quán)利要求8的載體，其中所述人鼻病毒載體是人鼻病毒14(HRV14)載體，而所述NimIV肽所獲自的人鼻病毒是人鼻病毒6(HRV6)或人鼻病毒72(HRV72)。14.權(quán)利要求10的載體，其中所述NimIV肽所獲自的人鼻病毒的VP1蛋白或核酸取代了所述載體的VP1蛋白或核酸分子。15.權(quán)利要求7的載體，其中所述載體包含與NimIV肽交聯(lián)的滅活人鼻病毒。16.權(quán)利要求7的載體，其中所述載體包含與NimIV序列融合的乙型肝炎核心序列。17.包含權(quán)利要求1的肽或權(quán)利要求6的核酸分子的藥物組合物。18.權(quán)利要求17的藥物組合物，其中所述肽包含在載體內(nèi)。19.權(quán)利要求17的藥物組合物，所述藥物組合物還包括一種或多種可藥用稀釋劑、賦形劑、載體或佐劑。20.權(quán)利要求19的藥物組合物，其中所述佐劑選自幾丁質(zhì)微粒和鋁化合物。21，權(quán)利要求17的藥物組合物，所述藥物組合物還包含一種或多種另外的人鼻病毒中和免疫原。22.在對(duì)象中誘導(dǎo)針對(duì)鼻病毒免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給予對(duì)象分離的NimIV肽或核酸分子。23.權(quán)利要求22的方法，其中所述對(duì)象沒有受到鼻病毒感染，但具有被鼻病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。24.權(quán)利要求22的方法，其中所述對(duì)象已被鼻病毒感染。全文摘要本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療人類鼻病毒感染的方法和組合物。文檔編號(hào)A61K39/12GK101678095SQ200780044357公開日2010年3月24日申請(qǐng)日期2007年10月1日優(yōu)先權(quán)日2006年9月29日發(fā)明者H·克利恩索斯,K·凱爾寧,Y·顏申請(qǐng)人:賽諾菲巴斯德生物制劑公司