改善的IgG4 類抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了IgG4類抗體，其包含至少一個含有CH1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的重鏈，其中在每一個重鏈中：a.所述CH1結(jié)構(gòu)域中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一種氨基酸置換；并且，b.位于上鉸鏈區(qū)中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
【專利說明】改善的lgG4類抗體
[00011 本申請是申請日為2011年8月19日、申請?zhí)枮?01180040277.1、發(fā)明名稱為"改善 的IgG4類抗體"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 本發(fā)明涉及與野生型抗體相比較具有改變的二硫鍵排列的改善的抗體和產(chǎn)生所 述改善的抗體的方法。
[0003] 包括重組蛋白質(zhì)、單克隆抗體(mAb)和基于核酸的藥物的生物藥劑工業(yè)正在快速 發(fā)展?？贵w工程已導致抗體片段或替代形式的設(shè)計和產(chǎn)生。當選擇基于抗體的蛋白質(zhì)作為 治療劑時，要考慮優(yōu)選的分子形式以及其它方面例如產(chǎn)品得率(production yield)、蛋白 質(zhì)質(zhì)量和貯存穩(wěn)定性。
[0004] 所有免疫球蛋白（Ig)分子的基本結(jié)構(gòu)包含，通過二硫鍵偶聯(lián)的兩個相同的重鏈 (HC)和兩個相同的輕鏈(LC)。每一個LC由可變結(jié)構(gòu)域(V l)和恒定結(jié)構(gòu)域(Cl)組成?；贖C，5 個主要的Ig種類公認為：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。對于IgG，HC由一個可變結(jié)構(gòu)域(V H)和三 個恒定結(jié)構(gòu)域(CHl-3)組成。CH2和CH3結(jié)構(gòu)域形成了負責刺激效應(yīng)子功能的分子的Fc部分， 并且通過賦予IgG分子柔性的鉸鏈區(qū)連接至Fab片段(VhVl和ChCl)。兩個抗原識別位點位于V l 和Vh結(jié)構(gòu)域的末端。I gG還被細分成4個不同的同種型：I gGI、I gG2、I gG3和I gG4。
[0005] Fe-介導的效應(yīng)子功能，即抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性 (CDC)，是同種型依賴性的。每一個同種型已進化來進行體內(nèi)的特定功能。IgGl同種型因其 延長的半衰期、增強的ADCC激活和補體激活而目前被最廣泛地用作治療劑。取決于靶和期 望的作用，其它同種型也被當作治療劑。例如，當僅中和靶抗原并且效應(yīng)子功能不太重要 時，可使用替代性同種型例如IgG2和IgG4?；蛘?，可考慮具有再工程化的Fe/效應(yīng)子功能的 IgG0
[0006] IgG2也具有最小的相關(guān)效應(yīng)子功能，且易于二聚化(這尚未被完全理解）。由于其 相對缺乏效應(yīng)子功能的誘導，因此IgG4仍然是有用的同種型。然而，IgG4還具有一些固有的 使用難題，即其形成半抗體的傾向、其交換半分子的能力及其較短的血清半衰期。
[0007] 在體外，IgG4分子符合典型的IgG結(jié)構(gòu)，但在體內(nèi)已觀察到，它們形成各自包含單 個輕鏈和單個重鏈的半分子(通過在鉸鏈區(qū)內(nèi)形成重鏈內(nèi)二硫鍵而引起）。已觀察到大百分 比的循環(huán)IgG4是雙特異性的，但功能上是單價的。這是因為半分子可與其它IgG4半分子形 成IgG4(Schuurman,J·,Van Ree,R.,Perdok,G.J.,Van Doorn,H.R.,Tan,K.Y.,Aalberse, R.C.,1999.Normal human immunoglobulin G4is bispecific: it has two different antigen-combining sites. Immunology 97,693-698)。
[0008] 可通過在鉸鏈中的位置241(根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的）上引入Ser至Pro的突變 來減少 IgG4 半分子的形成（Angal ,S.等人，1993.A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody.Mol Tmmunol 30,105-108)。此外，該點突變不影響IgG4的緊湊結(jié)構(gòu)，從而使得IgG4能夠保留其減弱的激 活補體的能力。
[0009] 在發(fā)現(xiàn)S241P突變后，已研究了 IgG4的其它突變，以理解IgG4抗體的重鏈間相互作 用，減弱IgG4的效應(yīng)子功能并且增加結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在Schuurman等人（Schuurman ,J等人， 2001.The inter-heavy chain disulphide bonds of IgG4are in equilibrium with intra-chain disulphide bonds .Molecular Immunology 38,1-8)中，使用IgG4突變體研 究了觀察到的IgG4的重鏈間二硫鍵的不穩(wěn)定性。在突變體Ml中，參與重鏈-輕鏈間（a-c H1) 二硫鍵的Cy s 131 (根據(jù)EU編號系統(tǒng)編號的或根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的Cy s 127)被絲氨酸替 代，并且發(fā)現(xiàn)該突變體導致輕鏈二聚體和重鏈二聚體的形成。在突變體M2中，參與鉸鏈中的 重鏈間二硫鍵的半胱氨酸226(根據(jù)EU編號系統(tǒng)編號的226或根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的239)被 絲氨酸替代，并且發(fā)現(xiàn)該突變體與IgG4相比較具有更穩(wěn)定的重鏈間連接并且阻止重鏈內(nèi)二 硫鍵的形成。
[0010 ]為了減少I gG4抗體的聚集物的形成，還已研究了 I gG4抗體的CH2和CH3結(jié)構(gòu)域中的 突變。US 2008/0063635Takahashi等人已研究了這樣的IgG4突變體，其中CH3結(jié)構(gòu)域中的位 置409(根據(jù)EU編號系統(tǒng)編號的409或根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的440)上的精氨酸被賴氨酸、 蘇氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸置換，以在低PH下抑制聚集物形成。為了減弱CDC活性，還教導了 L235、D265、D270、K322、P329和P331(根據(jù)EU編號系統(tǒng)編號的L235、D265、D270、K322、P329和 P331或根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的1^248、0278、0283、1(341、？348和？350)上的其它突變。 TO2008/145142Van de Winkel等人公開了，即使在鉸鏈區(qū)中的S228P(根據(jù)EU編號系統(tǒng)編號 的S228或根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的S241)突變不存在的情況下，通過置換位置409上的精 氨酸殘基、位置405上的Phe殘基或位置370上的Lys殘基(根據(jù)EU編號系統(tǒng)編號的409、F405 和K370或根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的R440、F436和K393)，具有減弱的進行Fab-臂交換的能 力的穩(wěn)定的I gG4抗體。
[0011]先前已研究了存在于抗體的鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸殘基的數(shù)目的改變。US 5677425B〇dmer等人公開了，為了有利于使用半胱氨酸巰基連接效應(yīng)子或報道分子，可增加 鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目。US 5677425還教導，為了有利于裝配抗體分子，可將鉸鏈區(qū) 中的半胱氨酸殘基的數(shù)目減少至1個（由于其僅是形成單個二硫鍵所必需的），這將為將鉸 鏈區(qū)連接至另一個鉸鏈區(qū)或至效應(yīng)子或報道分子提供特異性靶。
[0012]然而，仍然需要提供具有使得它們甚至更適合用作治療劑的改良的性質(zhì)的新型抗 體。本發(fā)明提供了與野生型抗體相比較具有有利性質(zhì)(包括改善的生物物理性質(zhì)）的新的突 變型抗體。特別地，已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，對與輕鏈中的半胱氨酸形成二硫鍵的IgG4抗體重鏈 中的半胱氨酸殘基位置的修飾提供了，與野生型IgG4抗體相比較，具有提高的穩(wěn)定性的 IgG4抗體。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 在一個方面，本發(fā)明提供了 IgG4類抗體，所述抗體包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域 和鉸鏈區(qū)的重鏈，其中在每一個重鏈中：
[0015] a.ChI結(jié)構(gòu)域中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一個氨 基酸置換;和
[0016] b.位于上鉸鏈區(qū)（upper hinge region)中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
[0017] 與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的ChI結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸為根據(jù)Kabat編 號系統(tǒng)編號的位置127上的半胱氨酸，且示于圖Ib中。
[0018] 改變IgG4恒定區(qū)中的二硫鍵的位置導致，對于Fab結(jié)構(gòu)域觀察到更高的TmjO%的 蛋白質(zhì)解折疊時的溫度被指定為Tm。根據(jù)實驗，Tm被測定為例如熒光-對-溫度曲線的拐點 (即，熒光-對-溫度曲線最陡峭時的溫度）。
[0019] 因此，更高的Tm反映出更高的熱穩(wěn)定性。因此，本公開內(nèi)容的分子具有更高的熱穩(wěn) 定性。
[0020] 然而，不希望受理論束縛，這可以是因為所獲得的二硫鍵或多肽分子的應(yīng)力（s train)或內(nèi)部張力的減小。
[0021] 還可通過將其它修飾引入I gG4恒定區(qū)來獲得熱穩(wěn)定性的進一步提高。
[0022] 位于上鉸鏈區(qū)中的被半胱氨酸置換的一個或多個氨基酸可選自根據(jù)Kabat編號系 統(tǒng)編號的226、227、228、229、230、237和238，如圖113中顯示的（上鉸鏈區(qū)中以下劃線標示的 氨基酸）。
[0023] 在優(yōu)選實施方案中，位于上鉸鏈區(qū)中的被半胱氨酸置換的一個或多個氨基酸為選 自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的227、228、229和230的位置上的氨基酸中的一個或多個，如圖 Ib和2a中顯示的。在該較后的排列中，隨后形成的鏈間（輕鏈-重鏈)二硫鍵的位置與IgGl恒 定區(qū)中發(fā)現(xiàn)的二硫鍵類似。
[0024]本發(fā)明人已確定，IgGl在Fab和Fc結(jié)構(gòu)域中具有比IgG4分子更高的熱穩(wěn)定性。然 而，本公開內(nèi)容使得能夠提供不具有ADCC效應(yīng)子功能但具有如IgGl分子的熱穩(wěn)定性和/或 其它有利性質(zhì)的IgG4分子。
[0025]顯示存在影響形成的IgG4分子中的Fab結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性的3個一般方面。第一個 方面是二硫橋的位置。第二個方面是靠近二硫橋的環(huán)境，即二硫鍵周圍的殘基的性質(zhì)，第三 個方面是上鉸鏈區(qū)的長度。
[0026]因此，本發(fā)明還提供了，包含具有上鉸鏈、核心和下鉸鏈（Iower hinge)的重鏈的 IgG4抗體，并且其中重鏈或每一個重鏈中的所述上鉸鏈和核心在長度上為13至17個，例如 15個氨基酸。
[0027]在一個實施方案中，IgG4抗體具有長度為15個氨基酸的上鉸鏈和核心。
[0028]在一個實施方案中，上鉸鏈和核心包含在IgG4鉸鏈中發(fā)現(xiàn)的天然12個氨基酸和3 個其它的氨基酸，例如3個丙氨酸殘基或3個甘氨酸殘基或其組合。
[0029]在一個實施方案中，鉸鏈具有下列序列之一： ESKyGPPAAACTSCP SEQiD No: 72 ESKYGPPGGGCTSCP SEQlD No: 73 FSKYGPPTHTCPSCP SFQ ID No: 74 ESKYGDKTHTCPSCP SEQ ID No: 75 EPSKYGPPAAACPSCP SEQ ID No: 76 EPSKVGPPGCiGCF'SCT SEQID No: 77
[0030] EPSKVGPPTH IX PSCP SEQ ID No: 78 FPSKYGDKTHTCPSCP SFQ ID No: 79 ESKSYCjPPAAACPSCP SEQ ID'No: 80 CSKSYGPPGGGCPSCP SCQ ID No: 8i ESKSYGPPTHTCPSCP SEQ ID No: 82 tSKSYGDKI H l CPSCP SHQiD No: 83 FSKYGPPAAACPPCP SFQID No: 84 ESKYGPPGGGCPPCP SEQ ID No: 85
[SKYGmtncmiP seq idn0： 86 ESKYGDKTHTCTPCP SEQ ID No: 87 EPSKYGPPAAACPPCP SEQ ID No: 88 EPSKYGPPGGGCPPCP SEQ iDNo: 89
[0031] EPSKYGPPTIITCPPCP SEQ IDNo: 90 EPSKYGDKTHTCPPCP SEQ ID No: 91 ESKSYGPPAAACPPCP SEQ IDNo: 92 HSKSYGFPCiGGt'PPCP SEQ iDNo: 93 ESKSYGPPTHTCPPCP SEQ IDNo: 94 F.SKSYGDKTHTCPPCP SEQ IDNo: 95
[0032] 在一個實施方案中，本公開內(nèi)容的IgG4分子中的上鉸鏈和核心由天然IgGl鉸鏈 (即EPKSCDKTHTCPPC SEQ ID No:96)或其衍生物組成，所述衍生物例如： EPi^CDKAAACPPGP SEQ ID No: 97 EPKSCDKGGGCPPCP SEQ ID No: 98 EPKSCDKTHTSPPCP SEQ ID No: 99 EPKSCDKTHTC PPSP SEQ ID No: 100 EPKSCDKTHTSiiPSP SEQ ID No: 10!
[0033] EPKSCDKAAASPPCP SEQ ID No: 102 EPKSCDKAAACPPSP SBQ ID No: 103 HPKSC'DKAAASPPSl5 SliQ ID No: 104
[?PKSC'DKGGiiSPF^'P S1：：Q ID No: 105 EPKSCDKGGGCPPSP SEQ ID No: 106 F.PKSCDKGGGSPPSP SEQ ID No: 107
[0034] 在其它方面，本發(fā)明提供了 IgG4類抗體，所述抗體包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域和 鉸鏈區(qū)的重鏈，其中在每一個重鏈中：
[0035] ChI結(jié)構(gòu)域中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一個氨基 酸置換;和
[0036]其中的重鏈或每一個重鏈中的鉸鏈的長度為15個氨基酸。
[0037]上文中描述了適當?shù)你q鏈。
[0038]在其它方面，本發(fā)明還提供了 IgG4類抗體，所述抗體包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域 和鉸鏈區(qū)的重鏈，其中在每一個重鏈中：
[0039] a.根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置127上的半胱氨酸被另一個氨基酸置換;和 [0040] b.根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置239上的半胱氨酸或位置242上的半胱氨酸被另 一個氨基酸置換。
[0041 ]在根據(jù)本發(fā)明的后一方面的一個實施方案中，IgG4分子還在鉸鏈區(qū)中包含22個氨 基酸，例如如上文中所描述的。
[0042]本發(fā)明提供的抗體與野生型IgG4抗體相比較具有有利的性質(zhì)。已令人驚訝地發(fā) 現(xiàn)，本發(fā)明的抗體與野生型IgG4抗體相比較，顯示提高的熱穩(wěn)定性，特別地Fab結(jié)構(gòu)域的提 尚的熱穩(wěn)定性。
[0043] 在其它方面，本發(fā)明還提供了 IgG3類抗體，其包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域和鉸鏈 區(qū)的重鏈，其中在每一個重鏈中：
[0044] a. ChI結(jié)構(gòu)域中的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一個氨基 酸置換;和
[0045] b.位于上鉸鏈區(qū)中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
[0046] 在其它方面，本發(fā)明提供了IgM類抗體，其包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域和Ch2結(jié)構(gòu) 域的重鏈，其中在每一個重鏈中：
[0047] a. ChI結(jié)構(gòu)域中的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一個氨基 酸置換;和
[0048] b.位于ChI結(jié)構(gòu)域或Ch2結(jié)構(gòu)域中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
[0049] 在其它方面，本發(fā)明提供了 IgD類抗體，其包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū) 的重鏈，其中在每一個重鏈中：
[0050] a. ChI結(jié)構(gòu)域中的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一個氨基 酸置換;和
[0051 ] b.位于鉸鏈區(qū)中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
[0052] 本發(fā)明還提供了包含編碼本發(fā)明的抗體的序列的表達載體和包含所述表達載體 的宿主細胞。
[0053] 本發(fā)明還提供了如上定義的抗體，其用于治療疾病或障礙。還提供了用于治療疾 病或障礙的方法，其包括施用治療有效量的如上定義的抗體。
[0054] 在一個實施方案中，所述抗體用于治療除癌癥外的疾病。
[0055] 附圖概述
[0056]圖Ia顯示IgGl野生型和IgG4野生型的人ChI和鉸鏈序列（其中鉸鏈殘基以下劃線 標示)和κ輕鏈恒定序列。
[0057] 圖Ib顯示：
[0058] 標出了形成鏈間α-CHl二硫鍵的半胱氨酸（以下劃線標示)的人K輕鏈恒定序列；
[0059] 人IgGl、2、3和4重鏈N-末端ChI殘基和鉸鏈區(qū)序列，其中標出了形成鏈間Cl-ChI二 硫鍵的半胱氨酸位置(在IgGl的上鉸鏈中和在IgG2、3和4的N末端ChI中）（以下劃線標示）；
[0060] 人IgD重鏈N-末端ChI殘基和部分鉸鏈區(qū)序列，其中顯示了N-末端ChI序列中形成鏈 間a-cHi二硫鍵的半胱氨酸位置(以下劃線標示）；
[0061 ] 人IgM重鏈N末端ChI、C末端ChI殘基和選擇的N末端Ch2殘基，其中顯示了N末端ChI 中形成鏈間a-cHi二硫鍵的半胱氨酸位置(以下劃線標示）；和
[0062] I gG3和I gG4上鉸鏈、I gD的鉸鏈中和I gM的C末端ChI和Ch2中的殘基，其中下劃線標 示的殘基表示其中一個或多個殘基可被半胱氨酸置換的本發(fā)明抗體中的位置。
[0063] 圖2a顯示IgGl野生型、IgG4野生型的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的ChI 半胱氨酸殘基(C127)和上鉸鏈及核心鉸鏈殘基，以及在本發(fā)明的IgG4抗體中引入突變的位 置。
[0064]圖2b顯示了 IgG3野生型的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的ChI半胱氨酸殘 基(C127)和其中在本發(fā)明的IgG3抗體中一個或多個殘基被半胱氨酸置換的位置。
[0065]圖2c顯示了 I gM野生型的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的ChI半胱氨酸殘 基(C127)和選擇的ChI和Ch2殘基，以及其中在本發(fā)明的IgM抗體中一個或多個殘基被半胱氨 酸置換的位置。
[0066]圖2d顯示了 IgD野生型的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的ChI半胱氨酸殘 基(Cl28)和鉸鏈殘基，以及其中在本發(fā)明的IgD抗體中一個或多個殘基被半胱氨酸置換的 位置。
[0067]圖3a顯示引入根據(jù)本發(fā)明的IgG4抗體的突變。
[0068]圖3b顯示圖3a中顯示的IgG4抗體的突變的重鏈的殘基的位置和可與輕鏈(LC)或 與另一個突變的重鏈(HC)中的半胱氨酸形成的預(yù)測的二硫鍵的位置。其中半胱氨酸可與LC 或HC中的半胱氨酸鍵合，下劃線標示的鏈為預(yù)測的占優(yōu)勢的二硫鍵排列。
[0069]圖4a顯示引入根據(jù)本發(fā)明的IgG4抗體的突變。
[0070]圖4b顯示圖4a中顯示的IgG4抗體的半胱氨酸殘基的位置和可與輕鏈(LC)或重鏈 (HC)中的半胱氨酸形成的預(yù)測的二硫鍵的位置。其中半胱氨酸可與LC或HC中的半胱氨酸鍵 合，下劃線標示的鏈是預(yù)測的占優(yōu)勢的二硫鍵排列。
[0071]圖5顯示根據(jù)本發(fā)明的IgG4抗體的ChI和鉸鏈區(qū)的序列。
[0072]圖6顯示根據(jù)本發(fā)明的IgG4抗體的ChI、鉸鏈區(qū)、Ch2和Ch3的序列。
[0073]圖7顯示根據(jù)本發(fā)明的抗體的Wes tern印跡分析，其中頂部凝膠顯示使用抗-人Fc 抗體的結(jié)果，底部凝膠顯示使用抗-K抗體的結(jié)果。
[0074]圖8顯示根據(jù)本發(fā)明的抗體的Western印跡分析，其中頂部凝膠顯示使用抗-人Fc 抗體的結(jié)果，底部凝膠顯示使用抗人κ抗體的結(jié)果。
[0075]圖9顯示根據(jù)本發(fā)明的抗體的Western印跡分析，其中頂部凝膠顯示使用抗-人Fc 抗體的結(jié)果，底部凝膠顯示使用抗人κ抗體的結(jié)果。
[0076]圖10顯示根據(jù)本發(fā)明的抗體的Western印跡分析，其中頂部凝膠顯示使用抗-人Fc 抗體的結(jié)果，底部凝膠顯示使用抗-人κ抗體的結(jié)果。
[0077]圖11顯示本發(fā)明的抗體的Thermof Iuor分析的結(jié)果，其顯示Fab和Ch2結(jié)構(gòu)域的熱 穩(wěn)定性。
[0078]圖12顯示本發(fā)明的抗體的Thermof Iuor分析的結(jié)果，其顯示Fab和Ch2結(jié)構(gòu)域的熱 穩(wěn)定性。
[0079]圖13顯示本發(fā)明的抗體的Thermof Iuor分析的結(jié)果，其顯示Fab和Ch2結(jié)構(gòu)域的熱 定性。
[0080]圖14顯示本發(fā)明的抗體的Thermof Iuor分析的結(jié)果，其顯示Fab和Ch2結(jié)構(gòu)域的熱 定性。
[0081 ]圖15顯示本發(fā)明的選擇的抗體的熱穩(wěn)定性的評級。
[0082]圖16顯示本發(fā)明的選擇的抗體和對照抗體的親和測定的結(jié)果。
[0083]圖17顯示本發(fā)明的選擇的抗體的HPLC分析的結(jié)果。
[0084]圖18顯示根據(jù)本發(fā)明的具有不同連接體的抗體的Western印跡分析。
[0085 ]圖19顯示根據(jù)本發(fā)明的具體不同連接體的抗體的We s tern印跡分析。
[0086]圖20至24根據(jù)本發(fā)明的具有各種突變的抗體的Western印跡分析。
[0087]圖25和26顯示各種抗體(包括根據(jù)本發(fā)明的某些抗體)的ADCC效應(yīng)子功能。
[0088]圖27顯示根據(jù)本發(fā)明的各種抗體的表達。
[0089] 圖28顯示抗體赫賽汀(Herceptin)的各種突變的Western印跡。
[0090] 圖29顯不抗體Tysabri的各種突變的Wes tern印跡。
[0091 ] 圖30顯不抗體Actemra的各種突變的Western印跡。
[0092 ]圖31至34顯示根據(jù)本發(fā)明的各種抗體的Thermof Iuor分析的結(jié)果。
[0093] 序列概述
[0094] SEQ ID NO: 1顯示IgGl野生型抗體的CHl和鉸鏈區(qū)序列。
[0095] SEQ ID NO:2顯示IgG4野生型抗體的CHl和鉸鏈區(qū)序列。
[0096] SEQ ID NO:3顯示人野生型κ輕鏈的恒定區(qū)的部分。
[0097] SEQ ID N0:4顯示人IgGl抗體的CHl結(jié)構(gòu)域的N端序列的部分。
[0098] SEQ ID NO:5顯示人IgGl抗體的鉸鏈區(qū)。
[0099] SEQ ID N0:6顯示人IgG2抗體的CHl結(jié)構(gòu)域的N端序列的部分。
[0100] SEQ ID NO:7顯示人IgG2抗體的鉸鏈區(qū)。
[0101] SEQ ID N0:8顯示人IgG3抗體的CHl結(jié)構(gòu)域的N端序列的部分。
[0102] SEQ ID NO:9顯示人IgG3抗體的鉸鏈區(qū)。
[0103] SEQ ID NO: 10顯示人IgG4抗體的CHl結(jié)構(gòu)域的N端序列的部分。
[0104] SEQ ID NO: 11顯示人IgG4抗體的鉸鏈區(qū)。
[0105] SEQ ID 吣8:12至37分別顯示抗體6、7、8、15、16、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、44、45、46、47、2、3、48、28P 和 44P 的 CHl結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)序列。
[0106] SEQ ID N0s:38至63分別顯示抗體6、7、8、15、16、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、44、45、46、47、2、3、48、28?和44?的011結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、012結(jié)構(gòu)域和013結(jié)構(gòu)域序 列。
[0107] SEQ ID從):64顯示野生型1864012和(：!13結(jié)構(gòu)域序列。
[0108] SEQ ID從):65顯示野生型1864012和野生型1861013結(jié)構(gòu)域序列。
[0109] SEQ ID NO:66顯示人野生型κ輕鏈的恒定區(qū)序列。
[0110] SEQ ID N0:67顯示人Ig⑶抗體的CHl結(jié)構(gòu)域的N端序列的部分。
[0111] SEQ ID N0:68顯示人IgGD抗體的鉸鏈區(qū)的部分。
[0112] SEQ ID N0:69顯示人IgGM抗體的CHl結(jié)構(gòu)域的N端序列的部分。
[0113] SEQ ID N0:70顯示人IgGM抗體的CHl結(jié)構(gòu)域的C端序列的部分。
[0114] SEQ ID N0:71顯示人IgGM抗體的CH2結(jié)構(gòu)域的部分。
[0115] SEQ ID NO:72至295顯示各種鉸鏈區(qū)。
[0116] 本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的詳述
[0117] 現(xiàn)將更詳細地描述本發(fā)明。
[0118] 除非上下文中另有所指，否則術(shù)語"蛋白質(zhì)"和"多肽"在本文中可互換使用。"肽" 意指10個或更少的氨基酸。
[0119] 除非上下文中另有所指，否則術(shù)語"多核苷酸"包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA等。
[0120] 如本文中所使用的，在本說明書的上下文中術(shù)語"包含"應(yīng)當解釋為"包括"。
[0121] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"野生型"意指，不包含任何遺傳工程突變的、如其可天 然存在或可從環(huán)境分離的抗體。
[0122] 本文中的置換突變體的名稱由字母后跟數(shù)字后跟字母組成。第一個字母表示野 生型蛋白質(zhì)中的氨基酸。數(shù)字是指其中進行氨基酸置換的氨基酸位置，第二個字母表示用 于替代野生型氨基酸的氨基酸。
[0123] 抗體可變和恒定結(jié)構(gòu)域中的殘基按照Kabat等人設(shè)計的系統(tǒng)常規(guī)地進行編號。該 系統(tǒng)不于Kabat等人，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest ,US Department of Health and Human Services,NIH,USA(在下文中縮寫為"Kabat等人（同 上)"）中。
[0124] Kabat殘基命名并不總是直接對應(yīng)于氨基酸殘基的線性編號。實際的線性氨基酸 序列可包含比嚴格Kabat編號更少或更多的氨基酸，對應(yīng)于結(jié)構(gòu)組件(無論是基本可變結(jié)構(gòu) 域結(jié)構(gòu)的構(gòu)架區(qū)還是互補決定區(qū)（CDR))的縮短或至其內(nèi)的插入?？赏ㄟ^將抗體序列與"標 準" Kabat編號的序列中具有同源性的殘基進行比對來確定給定的抗體的殘基的正確Kabat 編號。
[0125] 或者，氨基酸殘基的編號可通過EU-索引或EU編號系統(tǒng)（也描述于Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5片反.Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda,MD. (1991)中）來進行。
[0126] 抗體中的氨基酸殘基的其它編號系統(tǒng)為IMGT編號系統(tǒng)（Lefranc，M.-P.等人， Dev. Comp.Tmmunol·，29，185-203(2005))。
[0127] 除非其中另外指出使用EU編號系統(tǒng)或IMGT編號系統(tǒng)，否則將Kabat編號系統(tǒng)用于 本說明書。
[0128] 在4個IgG4同種型之間，重鏈與輕鏈中的鏈內(nèi)二硫鍵排列相似，然而，鏈間二硫鍵 排列對于每一種同種型是獨特的[由（Wypych，J.，Li，M.，Guo，A.，Zhang，Z.，Martinez，T.， Allen,M.J.,Fodor,S.,Kelner,D.N.,Flynn,G.C.,Liu,Y.D.,Bondarenko,P.V.,Ricci, M.S·,Dilion,T·Μ·,Balland,A·,2008·Human IgG2antibodies display disulphide-mediated structural isoforms.J Biol Chem.283,16194-16205)綜述]。
[0129] 如圖lb中所示，4個IgG4同種型的鉸鏈區(qū)序列存在差異。完整或起源的（genetic) 鉸鏈區(qū)通常由殘基226至251(基于Kabat編號系統(tǒng)編號的）組成。圖Ib顯示4個IgG4同種型 的鉸鏈區(qū)的上部分、核心部分和下部分。對于IgGl同種型，上鉸鏈區(qū)為殘基226至238,核心 鉸鏈區(qū)為殘基239至243以及下鉸鏈區(qū)為殘基244至251。對于IgG4同種型，上鉸鏈區(qū)為殘基 226至238，核心鉸鏈區(qū)為殘基239至243，以及下鉸鏈區(qū)為殘基244至251。
[0130]因此，IgGl中包含上鉸鏈、核心和下鉸鏈的鉸鏈的長度為23個氨基酸，如圖Ia中顯 示的。上鉸鏈為10個氨基酸。核心為5個氨基酸，下鉸鏈為8個氨基酸，參見例如圖lb。
[0131] IgG4中包含上鉸鏈、核心和下鉸鏈的鉸鏈的長度為20個氨基酸，如圖Ia中顯示的。 上鉸鏈為7個氨基酸。核心為5個氨基酸，下鉸鏈為8個氨基酸，參見例如圖Ib。
[0132] 已通過修飾IgG4內(nèi)的鏈間二硫鍵排列，開發(fā)了根據(jù)本發(fā)明的新型突變型IgG4抗 體，具體地已修飾了輕鏈(LC)與重鏈(HC)之間的Cl-Ch 1鏈間二硫鍵排列。
[0133]圖Ib顯不了IgG 1-4同種型的人IgG重鏈和輕鏈序列的部分，標出了形成Cl-ChI鏈 間二硫鍵的半胱氨酸位置（以下劃線標示）<JgGl的Cl-ChI間二硫鍵形成于LC C214(Kabat編 號系統(tǒng)）與正好在鉸鏈區(qū)之前的HC的C233(Kabat編號系統(tǒng))之間。相反地，IgG2、3和4的Gd-Cl二硫鍵形成于LC C214與HC的鏈內(nèi)二硫鍵N端的C127之間。在圖Ib中顯示和比對了參與Cl-ChI二硫鍵形成的半胱氨酸殘基周圍的LC和HC序列。
[0134] 本發(fā)明已研究了，Cl-ChI二硫鍵如何影響IgG4抗體的性質(zhì)，包括抗體的熱穩(wěn)定性、 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、二硫鍵同種型異質(zhì)性(disulphide isoform heterogeneity)及親和力。
[0135] 通過用另一種氨基酸置換IgG4的Chi內(nèi)位置127上的半胱氨酸殘基以及用半胱氨酸 置換上鉸鏈區(qū)內(nèi)的一個或多個氨基酸，優(yōu)選在選自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的227、228、229 和230的位置上的氨基酸來產(chǎn)生IgG4的突變體。位置227、228、229或230位于IgGl半胱氨酸 233所處的等同結(jié)構(gòu)位置上或其附近。
[0136] 各個重鏈可包括其它突變，包括用另一種氨基酸置換IgG4鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基 239和242之一或兩者。在位置238與239之間使IgG4上鉸鏈區(qū)延長3個氨基酸以與IgGl鉸鏈 的長度相同的突變也包括在一些抗體中。S241P突變也被引入一些抗體中。
[0137] 已發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的突變型IgG4抗體顯示有利的性質(zhì)。
[0138] 在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的突變型IgG4抗體顯示與野生型IgG4抗體相比較 增加的熱穩(wěn)定性。已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，已被突變以用另一種氨基酸替代ChI結(jié)構(gòu)域中位置 127上的半胱氨酸并且其中已將半胱氨酸引入重鏈鉸鏈區(qū)的位置227與230之間的突變型 IgG4抗體，與野生型IgG4抗體相比較顯示改善的熱穩(wěn)定性。除去位置127上的半胱氨酸的突 變改變在重鏈與輕鏈之間（a-c H1)形成鏈間二硫鍵的位置，并且迫使輕鏈與在重鏈鉸鏈區(qū) 中的位置227與230之間引入的半胱氨酸形成二硫鍵。因此，在一個實施方案中，提供了其中 半胱氨酸127被另一種氨基酸替代并且輕鏈的半胱氨酸通過二硫鍵連接至位置227、228、 229或230上的工程化半胱氨酸的IgG4抗體。
[0139]還令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過將3個氨基酸添加至IgG4鉸鏈區(qū)以延長IgG4鉸鏈區(qū)進一 步提尚了熱穩(wěn)定性。
[0140]還已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，已被突變以用另一種氨基酸替代ChI結(jié)構(gòu)域中的位置127上 的半胱氨酸且用另一種氨基酸替代重鏈鉸鏈區(qū)中位置239或位置242上的半胱氨酸的突變 型IgG4抗體顯示與野生型IgG4抗體相比較提高的熱穩(wěn)定性。
[0141]在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體顯示減少的所謂的半分子的形成。在C239上包 含突變但在C242上不具有突變的本發(fā)明的抗體通常顯示減少的半分子形成。不希望受理論 束縛，據(jù)認為，這是因為位置239上的半胱氨酸的去除減少了重鏈中鏈內(nèi)二硫鍵的形成，從 而與在C239或C242上不具有突變的抗體相比較減少了半分子的數(shù)目。在C242上具有突變但 在C239上不具有突變的抗體與在C239上具有突變但在C242上不具有突變的抗體相比較，顯 示形成更多的半分子。不希望受理論束縛，據(jù)認為位置239上的半胱氨酸與位置242上的半 胱氨酸相比，更具反應(yīng)性，并且能夠與重鏈的鉸鏈半胱氨酸或輕鏈半胱氨酸形成二硫鍵。
[0142] 在C239和C242上都具有突變的抗體因兩個重鏈之間無鏈間二硫鍵形成而形成高 比例的半分子。然而，在C239和C242上都包含突變的抗體因經(jīng)由非共價鍵的重鏈的鍵合而 仍然能夠形成完整抗體分子。
[0143] 也在具有S241P突變的抗體中觀察到減少的半分子形成。
[0144] 在一個實施方案中，上鉸鏈和核心區(qū)域選自下列序列之一： ESKYGPPC'PSCP SEQ IFi No: 108 ESKYGDKCPSCP SEQ ID No: 109 EPSKYGPPCPSCP SEQ ID No: HO EPSKYGDKCPSCP SEQID No: III ESKSYGPPCPSCP SEQ ID No: 112 ESKSYGDKCPSCP SEQ ID No: 1.13 ESKYGPPAACPSCP SEQ IDNo; 114 HSKYCiPPCiGCPSCP SHQ ID No： 115 ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 116 ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID .No: 117 EPSKYGPPAACPSCP SEQ ID No: 118 FJ>SKYGPPGGCPSC'i> SHQ ii) No: 119 EPSKYGPPIITCPSCP SEQ ID No: 120 EPSKYGDKHTCPSCP SEQ ：! D No: 121 ESKSYCiPPAAi'PSCP SbQ ID No: 122 ESKSYGPPGGCPSCP SEQ ID No: 123
[0145] ESKSYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 124 ESKS Y GdkhtcfjSCp seq id n〇： 12.5 ESKYGPP ACPSCP SEQ ID No: 126 ESKYGPPGCPSCP SEQ ID No: 127 ESKYGPPTTCPSCP SEQ ID No: 128 BSKYCiDK rrCIiSOs SCQ ID No: 129 EPSKYGPPACPSCP SEQ ID No: 130 EPSKYGPPGCPSCP SEQ II) No: DI EPSKYGPPTTCPSC'P SEQ ID No: 132 EPSKYGDKTT'CPSCP SEQ ID No: 133 ESKSYGPPACPSCP SEQ ID No: 134 ESKSYGPPGCPSCP SEQ ID No: 135 KSKSYGPP Il CPSCP SHQ ID No: 136 ESKSYGDKTTC：PSCP SEQ ID No: 137 ESKYGPPTHCPSCP SBQ ID No: 138 ESKY<iDKTHCPSC：P SEQ! D No: 139 rPSKYCiPPTIK'PSC'P sj-Q TD No: 140 tPSKYGDK i'I iCPSt'P SEQ ID No: 141 FiSKSYGPPTRnsSCP SRQ ID No: 142 ESKSYGDKTHCPSCP SEQiDNo: 143 ESKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 144 ESKYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 145 EPSKYGPPHTCPSCP SEQ ID No: 146 EPStCYGDKHTCPSCP SEQ ID No: 147 iiSKSYtiPPHTCPSCP SEQ ID No: 148 ESKSYGDKt I TCPSCP SBQ !D No: 149 ESKYGPPTCPSCP SBQIDNo: 150 ESKYGDKI'CPSCP SEQ ID No: 151 EPSKYGPPTCPSCP SEQ ID No: 152 EiiSKYGDKTCPSCP SEQ ID No: 153 ESKSYGPPTCPSCP SEQ ID No: 154 ESKSYGDKJCPSCP SEQ ID No: 155 L-SKYGPFIICPSCP SIiQ ID No; 156
[0146] HSKYGI)KHCPSCP SI,Q ID No: 15? EPSKYGPPHCPSCP SEQ ID No: 158 EPSKYGDKeCPSCP SEQ ID No: 159 ESKSYGPPHCPSC'P SEQ ID No: 160 ESKSYGDKHCPSCP SEQ ID No: 161 EPKSCDKAACPPCP SEQ ID No: 162 EPKSCDKGGCPPCP SEQ ID No: 163 HSCDKJ1TSPPCP S^QIDNo: 164 FPKSt DKHTC PPSP STQ ID No: 165 EPKSCDKHTSPPSP SEQ LD No: 166 EPKSCDKAASFPCP SEQ ID No; 167 EPK.SCDKAACPPSP SEQ ID No: 168 EPKSCDKAASPPSP SEQ ID No: 169 EPfCSCDKGGSPPCP SEQ ID No: 170 EPKSC：DKGCi(；PPSP SEQ ID No: 171 I^PKSC DKGGSPPSP SRQ ID No: 172 EPKSCDKACPPCP SEQ ID No: 173 EPKSCDKGCPPCP SEQ ID No： 174 EPKSCDBCrSPPCP SEQ ID No: 175 EPKSC'DKI CPPSP SEQ iD No: 176 EPKSCDKTSPPSP SEQ iD No: 177 EPKSCDKASPPCP SEQ !D No: 178 liPKSCDKACPPSP Si：：Q ID Ko: 179 EPKSCDKASPPSP SEQ ID No: 180 EPKSCDKCjSPPCP SEQID ISo: 181 EPKSCDKGCPPSP SEQ iDNo: 182 EPKSCDKGSPPSP SEQiDNo: 183 HPKSCDKC PPCP SHQ !D No: 184 EPKSCDKCPPCP SEQ ID No: 185 EFKSCDKSPPCP SEQ ID No: 186 EPKSCDtCCPPSP SEQ ID No: 187 EPK.SCDKSPPSP SFQ ID No: 188 LiPKSCDKSPPCP SHQ ID No: 189
[0147] RPKS( DKCPPSP SEQ iD No: 190 EPKSCDKSPPSP SEQ ID No: 191 EFKSCDKSPPCP SEQ ID No: 192 EPKSCDKCPPSP SEQ !.D No: 193 EPKSCDKSPPSP SEQ ID No: 194 FPKSCDKTl SPPC P SEQ ID No: 195 EFKSCDKTTCPPSP SEQ ID No: 196 EPKSCDKTTSPPSP SEQ ID No: 197 EPKSCDKTHSPPCP SEQ ID No; 198 EPK.SCDKTHCPPSP SEQ ID No: 199 EPKSC DKTHSPPSP SEQ !D No: 200 ESK.YGPPCPPCP SEQ ID No: 201 ESKYGPPCPPCP SEQ ID No: 202 ESKYGPPC'PPCP SEQ ID No: 203 ESKYGDKCPPCP SEQ ID No: 204 RPSKYGPPC'PPCP SFQ ID No: 205 EPSKYGPPCPPCP SBQ ID No: 206 LPSKYCrPPCPPC P SBQ ID No: 207 EPSKYGDKCPPCP SEQ ID Νυ: 208 ESKSYGPPCPPCP SEQ ID No: 209 IiSKSYGPPCIjPCF Si￡Q ID No: 210 ESKSYGPPCPPCP SEQ ID No: 211 ESKSYGDKCPPCP SEQ ID No: 212 !：；SKYCiPPAA(：；I>i>CP Sl：Q ID No: 21.? ESKYGPPGGCPPCP SEQ ID No: 214 ESKYGPPUTCPPCP SEQ ID No: 215
[SKY(H)KI ΙΤΠΨ(T Si：Q ID No: 216 EPSKYGPPAACPPCP SEQ IDT^o: 217 EPSKYCfPFGGCPPCP SEQ ID No: 218 FPSKYGPPIiTCPPCP SEQ ID No: 219 EPSK.YGDKHTCPPCP SEQ ID No: 220 ESKSYGPPAACPPCP SEQ ID No: 221 F.S!<SY(jPP(XK^PP('P SiiQ ID No: 222
[0148] ESKSYGPPHTCPPCP SEQ ID No: 223 ESKSYGDKi iTCPPCP SFiQ ID No: 224 RSKYGPPACPPCP SRQ TD No: 225 ESKYGPPGCPPCP SEQ ID No: 226 ESKYGPPTTCPPCP SEQ ID No: 227 ESK.YGDKTTCPPCP SEQ ID No: 228 EPSKYGPPACPPCP SEQ ID No: 229 EPSKYGPPGCPPC'P SEQ ID No: 230 EPSKYGPPTTCPPCP SEQ ID No: 231 EPSKYGDKTTCPPCP SEQ ID No: 232 ESKSYGPPACPPCP SEQ ID No: 233 ESKS'S GPFOCPPCP SEQ ID No: 234 ESKSYGPPTTCPPCP $F.Q ID Mr. 235 ESK&YGDK rrCPPCP SEQ ID No: 236 ESKYGPPTHCPPCP SEQ ID No: 237 ESKYGDKTHCPPCP SEQ ID No: 238 EPSKYtrPPTHCPPCT SEQ ID No: 239 !：；PSKYGDKTIICPP(T SEQ ID No: 240 ESKSYGPPTHCPPCP SEQID No: 241 ESKSYGDKTHCPPCP SEQ !DNo: 242 BSKYGIiPHrCIjPCij St；Q ID No: 24；i ESKYGDKmTPPCP SEQ !DNo: 244 EPSKYGPPHTCPPCP SEQ ID No: 245 EPSKYGDKH I CPijCF SEQ ID No: 246 ESKSYGPPHTCPPCP SEQ ID No: 247 ESKSYGDKHTCPPCP SEQ ID No: 248 HSKYGPFICPPCP SEQ ID No: 249 ESKYGDKTCPPCP SEQ ID No: 250 EPSKYGPPTCPPCP SEQ ID No: 251 EPSKYGDKTCPPCP SEQ ID No: 252 ESKSYGPPTCPPCP SEQ ID No: 253 ESKSYCiDKTCPPCP SEQ ID No: 254 ESKYGPPHCPPCP SEQ ID No: 255
[0149] ESK.YGDKHCPPCP SEQ ID No: 256 EPSKYGPPHCPPCP SEQ ID No: 25? EPSKYGDKHCPPCP SEQ ID No: 258 FSKSYGPPMCPPC P SEQ ID No: 259 ESKSYGDKHCPPCF SEQ iD No: 260 EPKSCDKTHTCFPCP SEQ ID No: 261 l；PKSC：DK I HK PS('P SHQ !i) No: 262 ESK.YCPPACPSCP SEQ ID No: 263 ESKYCPPAACPSCP SEQ ID No: 264 IiSKYCPPAAAt PSCI' Si：；Q ID No: 265 ESKYCPPAAASPSCP SEQ ID No: 266 ESKYCPPAAACPSSP SEQ ID No: 267 ESKCGPPAAACPSCP SEQ ID No: 268 ESKYCPPAAAACPSCP SEQ ID No: 269 ESK.YCPPAAAAACFSCP SEQ ID No: 270 ESKYCPPGGGCPSCP SEQ ID No: 271 ESKYCPPSSSCPSCP SEQ ID No: 272 ESKyCPPTCPSCP SEQ ID No: 273 EstcYCPPTHCFjSCP SEQ ID No: 274 ESKYCPPTHTCPSCP SEQ ID No: 275 ESKYC PKTHTCPSC'P SEQ ID No: 276 ESKYCDKTHTCFiSCP SEQ ID No: 277 ESKYCDKTHCPSCP SEQ ID No: 278 ESKYCDKTCPSCP SEQ ID No: 279 ESKYC'DKAAACPSCP SEQ ID No: 280 ESKYCDKCPSCP SEQ ID No: 281 ESKSCDKTHTCPS(T SEQ ID No: 282 EPKYCDKTHTCPSCP SEQ ID No: 2S3
[0150] EPKSCPPCPSrP SEQ ID No: 2M ESKSCPPCPSCP SEQ ID No: 285 EPK.YCPPCPSCP SEQ ID No: 286 CCKYGPPCPSCP SEQ ID No: 287 ECKYGPPSPSCP SEQ ID No: 288 FX'KYGPPrPSSP SEQ ID No: 289 ESCYGPPCPSCP SEQ ID No: 290 ESCYGPPSPSCP SEQ ID No: 291 ESCYGPPCPSSP SEQ ID No: 292 ESKCGPPCPSCP SEQ ID No: 293 ESKCGPPSPSCP SEQ ID No: 294 ESKCGPPCPSSP SEQ ID No: 295
[0151] 與野生型IgG4抗體相比較，根據(jù)本發(fā)明的抗體還顯示相當?shù)膶Π锌乖挠H和力。
[0152] 現(xiàn)更詳細地描述對本發(fā)明的抗體的突變。用于置換氨基酸的方法在分子生物學領(lǐng) 域是公知的。此類方法包括例如，使用方法例如PCR以缺失和/或置換氨基酸的定點誘變或 合成序列的從頭設(shè)計。
[0153] 圖2a顯示IgGl野生型、IgG4野生型的鉸鏈殘基和其中在本發(fā)明的抗體中引入突變 的位置。編號基于Kabat編號系統(tǒng)。
[0154] 根據(jù)本發(fā)明的抗體包括位置127(C127)上的突變，其中半胱氨酸殘基被另一種氨 基酸，優(yōu)選不包含巰基的氨基酸替代。關(guān)于替代或置換，我們意指，另一種氨基酸在通?？?見于抗體重鏈中的鏈間半胱氨酸127的位置上取代半胱氨酸。C127上的突變可以是將氨基 酸殘基從半胱氨酸改變成另一種適當?shù)陌被岬膶幋a位置127上的氨基酸的核苷酸中的 1、2或3個核苷酸的任何適當突變。適當?shù)陌被岬膶嵗ńz氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甘氨 酸或任何極性氨基酸。特別優(yōu)選的氨基酸為絲氨酸。
[0155] 用另一種氨基酸對位置127上的半胱氨酸的置換除去了 ChI結(jié)構(gòu)域中通常與野生 型I gG4輕鏈中的半胱氨酸形成二硫鍵的半胱氨酸。因此，為了通過鏈間二硫鍵形成輕鏈和 重鏈配對，輕鏈必須與位于重鏈的鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸形成二硫鍵。
[0156] 在本發(fā)明的第一方面，根據(jù)本發(fā)明的抗體包含重鏈，其中選自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng) 編號的227、228、229和230的位置上的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。因此，根據(jù)本發(fā) 明的抗體可具有下列突變的一個或多個：
[0157] · S227C
[0158] . K228C
[0159] · Y229C
[0160] . G230C
[0161] 優(yōu)選地，僅有一個選自227、228、229和230的殘基被半胱氨酸殘基置換。
[0162] 本發(fā)明的特別優(yōu)選的抗體具有突變Y229C或G230C。
[0163] 在重鏈的鉸鏈區(qū)的選自227、228、229和230的位置上包含半胱氨酸殘基提供了用 于在重鏈與輕鏈之間形成鏈間二硫鍵的新位置。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，該新的鏈間二硫鍵排列 提供了，與野生型IgG4抗體相比較具有提高的熱穩(wěn)定性的IgG4抗體。
[0164] 可將其它突變引入本發(fā)明的該方面的抗體。在一個實施方案中，重鏈中根據(jù)Kabat 編號系統(tǒng)編號的位置239上的半胱氨酸(C239)和/或位置242上的半胱氨酸(C242)被另一種 氨基酸，優(yōu)選不包含巰基的氨基酸置換。關(guān)于替代或置換，我們意指，另一種氨基酸在通常 可在抗體重鏈中見到半胱氨酸239和/或半胱氨酸242的位置上取代半胱氨酸。C239和/或 C242上的突變可以是，將氨基酸殘基從半胱氨酸改變成另一種適當?shù)陌被岬膶幋a氨基 酸的核苷酸中的1、2或3個核苷酸的任何適當?shù)耐蛔?。適當?shù)陌被岬膶嵗ńz氨酸、蘇 氨酸、丙氨酸、甘氨酸或任何極性氨基酸。特別優(yōu)選的氨基酸為絲氨酸。
[0165] 在一個實施方案中，重鏈的位置239上的半胱氨酸被另一個氨基酸置換，并且重鏈 的位置242上的半胱氨酸被另一個氨基酸置換。在該實施方案中，C239和C242上的置換除去 了重鏈的鉸鏈區(qū)中通常與另一個重鏈中的相應(yīng)半胱氨酸形成重鏈間二硫鍵的兩個半胱氨 酸殘基。所得的半分子可通過兩個重鏈之間的非共價鍵合形成完整抗體分子。
[0166] 在備選實施方案中，重鏈的位置239上的半胱氨酸被另一種氨基酸置換。在該實施 方案中，位置242上的半胱氨酸不被另一種氨基酸置換。
[0167] 在其它備選實施方案中，重鏈的位置242上的半胱氨酸被另一種氨基酸置換。在該 實施方案中，位置239上的半胱氨酸不被另一種氨基酸置換。
[0168] C239或C242之一的置換在重鏈中留下一個半胱氨酸，其能夠與另一個重鏈中的半 胱氨酸形成重鏈間二硫鍵。不希望受理論束縛，據(jù)認為鉸鏈區(qū)中的一個半胱氨酸的置換，特 別地C239的置換減少了鉸鏈區(qū)的鏈內(nèi)二硫鍵的形成，從而減少了半抗體分子的形成。
[0169] 在其中位置227上的絲氨酸被半胱氨酸置換的本發(fā)明的一個實施方案中，抗體優(yōu) 選不包含位置C239和C242上的突變。在其中位置227上的絲氨酸被半胱氨酸置換的另一個 實施方案中，重鏈的位置239上的半胱氨酸優(yōu)選被另一種氨基酸置換，但位置242上的半胱 氨酸不被另一種氨基酸置換。
[0170] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體包含經(jīng)突變在氨基酸226與243之間插入一個或 多個氨基酸的IgG4重鏈。插入的氨基酸的數(shù)目可以為1至10,1至5,1至3個氨基酸，優(yōu)選插入 1、2、3或4個氨基酸。優(yōu)選在氨基酸238與239之間插入氨基酸。可將任何適當?shù)陌被岵迦?鉸鏈區(qū)，例如丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸或蘇氨酸及其組合。優(yōu)選插入3個丙氨酸(AAA)、3個甘 氨酸(GGG)、3個絲氨酸(SSS)或3個蘇氨酸(TTT)，或蘇氨酸、組氨酸和另一個蘇氨酸(THT)。 已發(fā)現(xiàn)包含經(jīng)突變在鉸鏈區(qū)中插入了 3個氨基酸的IgG4重鏈的本發(fā)明的抗體顯示提高的熱 穩(wěn)定性。
[0171]可被引入根據(jù)本發(fā)明的抗體的其它突變?yōu)橥蛔僑241P。先前已顯示，該突變減少半 分子的形成（Angal，S ·等人，1993 .A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human(IgG4)antibody.Mol Immunol 30,105-108)〇
[0172] 根據(jù)本發(fā)明的抗體可在鉸鏈區(qū)中包含一個或多個其它突變。例如，抗體還可包含 下列突變的一個或多個:S227P、Y229S、P237D和P238K。
[0173] 在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體有效地包含殘基226至243的IgGl鉸鏈區(qū) (上鉸鏈和核心鉸鏈）。因此，本發(fā)明的抗體包含鉸鏈區(qū)，其中位置230上的甘氨酸被半胱氨 酸置換，位置227上的絲氨酸被脯氨酸置換，位置229上的酪氨酸被絲氨酸置換，位置237上 的脯氨酸被天冬氨酸置換，位置238上的脯氨酸被賴氨酸置換，氨基酸序列蘇氨酸-組氨酸-蘇氨酸被插入在位置238與239之間，位置241上的絲氨酸被脯氨酸置換。這些突變還可書寫 為5227?、￥2295、6230^2370、？2381(1'!11'和5241?，如圖23中所示。已發(fā)現(xiàn)這些其他突變至 IgG4鉸鏈區(qū)的引入提供了具有提高的熱穩(wěn)定性的抗體。
[0174] 根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選具有從殘基244至251的IgG4下鉸鏈(APEFLGGP)。不受理論 束縛，據(jù)認為IgG4下鉸鏈區(qū)促成了 IgG4抗體的效應(yīng)子功能的不存在。
[0175] 在本發(fā)明的第二方面，抗體包含重鏈，其中位置127上的半胱氨酸被另一種氨基酸 置換，如上文中所描述的，并且重鏈中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置239上的半胱氨酸或 位置242上的半胱氨酸被另一種氨基酸置換。在該第二方面，位置227、228、229和230上的殘 基都未被半胱氨酸殘基置換。
[0176] 已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明第二方面的抗體具有與野生型IgG4抗體相比較提 尚的熱穩(wěn)定性。
[0177] 在本發(fā)明的第二方面，抗體可包含一個或多個其它突變。在一個實施方案中，抗 體包含經(jīng)突變在氨基酸226與243之間，優(yōu)選氨基酸238與239之間插入了3個氨基酸的IgG4 重鏈，如上文中所描述的。在其它實施方案中，抗體包含突變S241P。在其它實施方案中，抗 體還可包含下列突變的一個或多個:3227?、￥2293、？2370和?2381(。
[0178] 下面的表1列出了本發(fā)明的示例性抗體和與IgG4野生型序列相比較被引入的突 變。表1還包括野生型I gG 1和I gG4抗體以及對照抗體。
[0179] 表1:
[0182] 圖3a和4a還顯示了引入根據(jù)本發(fā)明的IgG4抗體的突變。圖3b和4b顯示了本發(fā)明的 IgG4抗體中的半胱氨酸殘基的位置并且還顯示了半胱氨酸與輕鏈(LC)或另一個重鏈(HC) 中的半胱氨酸的預(yù)測的鍵合。對于顯示的半胱氨酸殘基(LC或HC)，所述半胱氨酸能夠結(jié)合 輕鏈或重鏈中的半胱氨酸，但據(jù)認為二硫鍵主要存在于以下劃線標示的LC或HC之處。
[0183] 在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個重鏈的抗體，其中每一個重鏈包 含ChI結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)并且每一個重鏈包含選自2、3、6、7、8、15、16、28、28P、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、44、44?、45、46、47和48的抗體的突變，如表1中顯示的。因此，本發(fā) 明提供了包含至少一個重鏈的抗體，其中每一個重鏈包含ChI結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)并且每一個 重鏈包含下列序列之一：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:27、SEQ ID N0:28、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
[0184] 在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體包含至少一個重鏈，其中每一個重鏈包含ChI結(jié) 構(gòu)域和鉸鏈區(qū)，并且包含下列序列之一：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22、SEQ ID N0:23、SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:36和 SEQ ID N0:37。更優(yōu)選，本發(fā)明的抗體包含至少一個重鏈，其中每一個重鏈包含ChI結(jié)構(gòu)域 和鉸鏈區(qū)并且每一個重鏈包含下列序列之一：SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:17、SEQ ID N0:18、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37。
[0185] 在其它優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供了包含至少一個重鏈的抗體，其中每一個重 鏈包含ChI結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、Ch2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域并且每一個重鏈包含選自2、3、6、7、8、15、 16、28、28卩、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、44、44卩、45、46、47和48的抗體的突變，如 表1中顯示的。因此，本發(fā)明提供了包含至少一個重鏈的抗體，其中每一個重鏈包含ChI結(jié)構(gòu) 域、鉸鏈區(qū)、Ch2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域并且每一個重鏈包含下列序列之一:SEQ ID NO:38、SEQ ID N0:39、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:41、SEQ ID N0:42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:46、SEQ ID N0:47、SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:49、SEQ ID N0:50、SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:53、SEQ ID N0:54、SEQ ID N0:55、SEQ ID N0:56、SEQ ID N0:57、 SEQ ID N0:58、SEQ ID N0:59、SEQ ID N0:60、SEQ ID N0:61、SEQ ID N0:62和 SEQ ID NO :63〇
[0186] 本發(fā)明的特別優(yōu)選的抗體包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的重鏈，其中重 鏈包含SEQ ID N0:36(抗體28P)、SEQ ID N0:37(抗體44P)或SEQ ID N0:35(抗體48)。本發(fā) 明的其它特別優(yōu)選的抗體包括至少一個包含ChI結(jié)構(gòu)域、鉸鏈區(qū)、Ch2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域的 重鏈，其中重鏈包含SEQ ID N0:62(抗體28P)、SEQ ID N0:63(抗體44P)或SEQ ID N0:61(抗 體48)?？贵w28P、44P和48是特別優(yōu)選的，因為它們顯示顯著提高的熱穩(wěn)定性并且還顯示減 少的半分子形成。
[0187]已顯示抗體2、3和8形成大量的所謂的半分子(HL)。此類突變體可在非變性條件下 在體外形成完整抗體分子(H2L2)，但在非還原性SDS-PAGE條件下除去重鏈之間和/或重鏈 與輕鏈之間的任何非共價結(jié)合。雖然通常教導期望減少半分子的形成，然而具有增加的形 成半分子的傾向的抗體對于某些用途可能是有利的。因抗體重鏈不能與另一個重鏈形成共 價或非共價結(jié)合而形成穩(wěn)定的半分子(HL)和幾乎不形成或不形成完整抗體(H2L2)的抗體 具有特殊的益處。形成穩(wěn)定的半分子的抗體對于產(chǎn)生單價抗體是有利的。形成半分子的抗 體還可通過從具有不同特異性的半分子形成完整抗體而提供產(chǎn)生雙特異性抗體的有用方 法，其中完整抗體是雙特異性的并且對于每一種抗原是單價的。
[0188] 抗體3保留鉸鏈區(qū)中的C239,但顯示不能形成鉸鏈間重鏈二硫鍵(推測因 C末端輕 鏈半胱氨酸與鉸鏈C239之間的二硫鍵的高效形成）。抗體2與3的比較顯示，輕鏈的C末端半 胱氨酸'延伸'的程度，因為輕鏈與鉸鏈區(qū)中的C239比與C242更有效地形成二硫鍵。此外，抗 體3顯示與抗體2相比較增加的穩(wěn)定性。
[0189] 雖然在上文中描述了相對于IgG4同種型的根據(jù)本發(fā)明的突變的抗體，但是本領(lǐng)域 技術(shù)人員將理解，還可將針對IgG4抗體產(chǎn)生的突變用于具有與IgG4抗體相同的二硫鍵排列 的其它抗體同種型或種類，以提供改善的抗體。具有與I gG4抗體相同的二硫鍵排列的抗體 的具體實例為I gG3抗體、I gM抗體和I gD抗體。如圖I b中顯示的，I gG3和I gM在Ch 1結(jié)構(gòu)域的 位置127上具有半胱氨酸，IgD在ChI結(jié)構(gòu)域的位置128(其等同于IgG4的ChI結(jié)構(gòu)域的C127)上 具有半胱氨酸，所述半胱氨酸與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵。此外，還可從圖Ib中看 至Ij，IgG3和IgD的上鉸鏈區(qū)以及IgM的ChI結(jié)構(gòu)域的C端區(qū)域和Ch2結(jié)構(gòu)域的N端區(qū)域不包含與 IgGl的上鉸鏈區(qū)的殘基等同的半胱氨酸殘基。因此，本發(fā)明還提供了 IgG3抗體、IgD抗體和 IgM抗體，其中ChI結(jié)構(gòu)域中的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一種氨 基酸置換，并且其中位于結(jié)構(gòu)上類似于IgGl或IgG4的上鉸鏈區(qū)的位置中的一個或多個氨基 酸被半胱氨酸置換。
[0190] 因此，本發(fā)明還提供了IgG3類抗體，其包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的重 鏈，其中在每一個重鏈中：
[0191] a.ChI結(jié)構(gòu)域中與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一種氨基酸 置換;和
[0192] b.位于上鉸鏈區(qū)中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
[0193] 在本發(fā)明的I gG3抗體方面的優(yōu)選實施方案中，ChI結(jié)構(gòu)域中與輕鏈中的半胱氨酸 形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸是根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置127上的半胱氨酸，如圖Ib和 2b中顯示的。
[0194] 在本發(fā)明的IgG3抗體方面的優(yōu)選實施方案中，位于上鉸鏈區(qū)中的可被半胱氨酸置 換的一個或多個氨基酸為，選自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的226、227、228、229、230、232和 233的位置上的氨基酸中的一個或多個氨基酸，如圖Ib和2b中顯示的。
[0195] 本發(fā)明還提供IgM類抗體，其包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域和Ch2結(jié)構(gòu)域的重鏈，其 中在每一個重鏈中：
[0196] a. ChI結(jié)構(gòu)域中的與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一種氨基 酸置換;和
[0197] b.位于ChI結(jié)構(gòu)域或Ch2結(jié)構(gòu)域中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
[0198] 在本發(fā)明的IgM抗體方面的優(yōu)選實施方案中，ChI結(jié)構(gòu)域中的與輕鏈中的半胱氨酸 形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸為根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置127上的半胱氨酸，如圖Ib 和2c中顯示的。
[0199] 在本發(fā)明的IgM抗體方面的優(yōu)選實施方案中，位于ChI結(jié)構(gòu)域的C末端或Ch2結(jié)構(gòu)域 的N端的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。位于ChI結(jié)構(gòu)域的C末端中的可被半胱氨酸置 換的優(yōu)選氨基酸為，選自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的223、223A、223B和223C的位置上的氨基 酸中的一個或多個氨基酸，如圖Ib和2c中顯示的。位于Ch2結(jié)構(gòu)域的N端中可被半胱氨酸置 換的優(yōu)選氨基酸為，選自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的243G、243H和2431的位置上的氨基酸中 的一個或多個氨基酸，如圖Ib和2c中顯示的。因此，氨基酸223至243的任一個或多個可被半 胱氨酸置換。
[0200] 本發(fā)明還提供了IgD類抗體，其包含至少一個含有ChI結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的重鏈，其 中在每一個重鏈中：
[0201] a.ChI結(jié)構(gòu)域中與輕鏈中的半胱氨酸形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸被另一種氨基酸 置換;和
[0202] b.位于鉸鏈區(qū)中的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。
[0203] 在本發(fā)明的IgD抗體方面的優(yōu)選實施方案中，ChI結(jié)構(gòu)域中與輕鏈中的半胱氨酸形 成鏈間二硫鍵的半胱氨酸為根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置128上的半胱氨酸，如圖Ib和2d 中顯示的。
[0204] IgD抗體的鉸鏈區(qū)可被定義為根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)的R224-P243。
[0205] 在本發(fā)明的IgD抗體方面的優(yōu)選實施方案中，位于鉸鏈區(qū)中的被半胱氨酸置換的 一個或多個氨基酸為，選自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的227、228、229、230、231、232和233的 位置上的氨基酸中的一個或多個氨基酸，如圖Ib和2d中顯示的。
[0206] 本發(fā)明提供的I gG3、I gD或I gM抗體可包含一個或多個對鉸鏈區(qū)的其它突變，如上 文中對于I gG4抗體所論述的。
[0207] 如本文中所使用的，術(shù)語'抗體'包括完好的（完整的)抗體和包含至少一個含有Vh 結(jié)構(gòu)域、ChI結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的重鏈的功能活性片段。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選包含至少一個 輕鏈。因此，在本發(fā)明中術(shù)語"抗體"包括二價、三價或四價抗體、Fab'和F(ab'） 2片段、半抗 體分子或包含單個輕鏈和重鏈配對的半分子，以及包含兩個輕鏈和重鏈配對的完整抗體 分子。
[0208] 如本領(lǐng)域公知的，典型的Fab '分子包括重鏈與輕鏈對，其中重鏈包含可變區(qū)VH、恒 定結(jié)構(gòu)域CHl和鉸鏈區(qū)，輕鏈包含可變區(qū)VL和恒定結(jié)構(gòu)域CL。
[0209] 在一個實施方案中，提供了根據(jù)本公開內(nèi)容的Fab'的二聚體，例如可通過鉸鏈進 行二聚化。
[0210] 在一個實施方案中，重鏈包括Ch2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域，以及任選地Ch4結(jié)構(gòu)域。在一 個實施方案中，抗體包括兩個重鏈，其各自如上文在本發(fā)明的第一或第二方面中所定義。根 據(jù)本發(fā)明的抗體還優(yōu)選包含兩個輕鏈。在其中抗體包含兩個重鏈的實施方案中，優(yōu)選兩個 重鏈序列都是相同的，如上文在本發(fā)明的第一或第二方面中所定義的。
[0211]在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體是包含兩個輕鏈和兩個重鏈的完整抗體，其中 每一個重鏈包含，其中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置127上的半胱氨酸被另一種氨基酸置 換的IgG4CHl、IgGl上和中鉸鏈區(qū)、IgG4下鉸鏈區(qū)、Ch2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域。
[0212] IgG4抗體的完整鉸鏈區(qū)通常由殘基226至251 (基于Kabat編號系統(tǒng)編號的）組成。 然而，可根據(jù)需要縮短或延長鉸鏈區(qū)。例如，根據(jù)本發(fā)明第一方面的抗體，野生型氨基酸在 位置227、228、229或230上被半胱氨酸殘基置換，鉸鏈區(qū)可在位置227、228、229或230上的新 的半胱氨酸殘基后結(jié)束。根據(jù)本發(fā)明的抗體還可包含位于鉸鏈區(qū)的N端和/或C端的一個或 多個其它氨基酸。此外，可控制鉸鏈的其它特征，例如鉸鏈半胱氨酸與輕鏈鏈間半胱氨酸的 距離、鉸鏈的半胱氨酸之間的距離，以及鉸鏈中可影響鉸鏈的性質(zhì)例如柔性的其它氨基酸 的組成，例如可將甘氨酸摻入鉸鏈中以增加旋轉(zhuǎn)柔性或可摻入脯氨酸以減少柔性。或者，可 將帶電荷的或疏水殘基的組合摻入鉸鏈以賦予多聚化或純化性質(zhì)。其它修飾的鉸鏈區(qū)可以 是完全合成的，且可被設(shè)計以具有期望的性質(zhì)例如長度、組成和柔性。
[0213] 用于本發(fā)明的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(特另Ij地在Fc結(jié)構(gòu)域中，當存在時)優(yōu)選是IgG4同種 型的（當不需要抗體效應(yīng)子功能時）。相應(yīng)地每一個重鏈優(yōu)選包含IgG4C H2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu) 域，如SEQ ID NO:64中所示的。
[0214]應(yīng)理解，還可使用Fc恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的序列變體。
[0215] 在一個實施方案中，每一個重鏈包含IgG4CH2和Ch3結(jié)構(gòu)域，其中用賴氨酸、蘇氨酸、 甲硫氨酸或亮氨酸置換位置409(EU編號）上的精氨酸，以在低pH下抑制聚集體形成（US 2008/0063635Takahashi 等人）。還教導了 L235、D265、D270、K322、P331和P329(根據(jù)EU編號 系統(tǒng)編號的）上的突變以減弱CDC活性(US 2008/0063635Takahashi等人）。
[0216] 每一個重鏈可包含如W02008/145142Van de Winkel等人中教導的突變，Van de Winkel等人公開了穩(wěn)定的IgG4抗體，所述抗體通過置換位置409上的精氨酸殘基、位置405 的Phe殘基或位置370上的Lys(根據(jù)EU編號系統(tǒng)編號的）而具有減少的進行Fab-臂交換的能 力。
[0217] 在一個實施方案中，每一個重鏈包含IgG4CH2結(jié)構(gòu)域和IgGlCH3結(jié)構(gòu)域，如SEQ ID NO: 65中顯示的。
[0218] 在其中抗體為突變的IgG3、IgD或IgM抗體的本發(fā)明的實施方案中，每一個重鏈優(yōu) 選包含Ch2結(jié)構(gòu)域和Ch3結(jié)構(gòu)域，和任選地Ch4結(jié)構(gòu)域。在IgG3抗體中，每一個重鏈優(yōu)選包含 IgG3CH2結(jié)構(gòu)域和IgG3CH3結(jié)構(gòu)域。在IgD抗體中，每一個重鏈優(yōu)選包含IgD Ch2結(jié)構(gòu)域和IgD Ch3結(jié)構(gòu)域。在IgM抗體中，每一個重鏈優(yōu)選包含IgM Ch2結(jié)構(gòu)域、IgM Ch3結(jié)構(gòu)域和IgM Ch4結(jié) 構(gòu)域。
[0219] 在一個實施方案中，抗體是單克隆、完全人、人源化或嵌合抗體片段。在一個實施 方案中，抗體是完全人抗體或人源化抗體。
[0220] 可利用本領(lǐng)域中已知的任何方法例如雜交瘤技術(shù)(Kohler&Milstein ,Nature， 1975，256，495-497)、三源雜交瘤技術(shù)、人B細胞雜交瘤技術(shù)（Kozbor等人，Immunology Today, 1983,4,72)和EBV-雜交瘤技術(shù)（Cole等人，"Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy"，pp · 77-96 ,Alan R· Liss，Inc ·，1985)制備單克隆抗體。
[0221] 用于本發(fā)明的抗體還可使用單淋巴細胞抗體法，通過克隆和表達免疫球蛋白可變 區(qū) cDNA 來產(chǎn)生，所述 cDNA 利用例如 Babcook, J ·等人，Proc .Natl. AcacL Sci .USA, 1996,93 (15)，7843-7848，W0 92/02551 ,W02004/051268和W02004/106377描述的方法從被選擇用于 產(chǎn)生特定抗體的單個淋巴細胞產(chǎn)生。
[0222] 人源化抗體為來自非人物種的抗體分子，其具有一個或多個來自非人物種的互補 決定區(qū)（CDR)和來自人免疫球蛋白分子的構(gòu)架區(qū)（其任選包含來自非人物種的一個或多個 供體殘基）（參見例如，US 5,585,089)。
[0223] 用于本發(fā)明的抗體還可使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示法來產(chǎn)生，包括 Brinkman等人，J · Tmmunol .Methods ,1995,182,41-50 ;Ames等人，J · Tmmunol .Methods , 1995,184,177_186;Kettleborough等人Eur. J. Tmmunol · , 1994,24,952_958;Persic等人， Gene,1997187，9_18;和Burton等人，Advances in Immunology,1994,57,191-280;W0 90/ 02809;W0 91/10737;W0 92/01047;W0 92/18619;W0 93/11236;W0 95/15982;和TO 95/ 20401;和US 5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427,908;5,750,753;5,821， 047;5，571，698;5，427，908;5,516，637;5,780,225;5,658,727;5,733,743和5,969,108中 公開的那些。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物，包括其它哺乳動物，可用于產(chǎn)生人源化抗體。
[0224] 完全人抗體是其中重鏈和輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)（當存在時)全都是人來源的，或 與人來源的序列（不必來自相同抗體)大體上同一的那些抗體。完全人抗體的實例可包括， 例如通過上述噬菌體展示法產(chǎn)生的抗體和由這樣的小鼠產(chǎn)生的抗體，在所述小鼠中鼠免疫 球蛋白可變區(qū)和/或恒定區(qū)基因已被它們的人對應(yīng)物替代（例如，在EP0546073B1、US 5， 545,806、US 5,569,825、US 5,625，126、US 5,633,425、US 5,661，016、US 5,770,429、EP 0438474B1 和 EP0463151B1 中一般性描述的）。
[0225] 用于本發(fā)明的抗體起始材料可通過使用重組DNA技術(shù)(包括操作和再表達編碼抗 體可變區(qū)和恒定區(qū)的DNA)來制備。需要時，可使用標準分子生物學技術(shù)來修飾、添加或缺失 氨基酸或結(jié)構(gòu)域。對可變區(qū)或恒定區(qū)的任何改變?nèi)匀话ㄔ诒疚氖褂玫男g(shù)語'可變'和'恒 定'區(qū)內(nèi)。
[0226] 可從任何物種包括例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠、駱駝、駱馬（llama)、山羊或人獲得 抗體起始材料。抗體的部分可從超過一個物種獲得，例如抗體可以是嵌合的。在一個實例 中，恒定區(qū)來自一個物種并且可變區(qū)來自另一個物種。還可修飾抗體起始材料。在另一個實 例中，已使用重組DNA工程技術(shù)產(chǎn)生抗體的可變區(qū)。此類工程化形式包括，例如通過在天然 抗體的氨基酸序列中進行插入、缺失或改變從天然抗體可變區(qū)產(chǎn)生的工程化形式。該類型 的具體實例包括，包含來自一種抗體的至少一個CDR和任選地一個或多個構(gòu)架氨基酸并且 可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的其余部分來自第二抗體的那些工程化可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。用于產(chǎn)生和制備此類 抗體的方法在本領(lǐng)域是公知的（參見例如，Boss等人，US 4,816,397;Cabilly等人，US 6， 331,415; Shrader等人，WO 92/02551; Ward等人，1989 ,Nature ,341,544;Orlandi等人， 1989,Proc .Natl .Acad· Sci .USA,86，3833;Riechmann等人，1988 ,Nature，322，323;Bird等 人，1988 ,Science ,242,423;Queen等人，US 5,585,089;Adair ,W091/09967 !Mountain和 Adair ,1992, Biotechnol.Genet. Eng. Re v，10，1_142 ; Verma等人，1998，Journal of Immunological Methods，216，165-181)〇
[0227] 在一個實施方案中，抗體包含形成結(jié)合結(jié)構(gòu)域的可變結(jié)構(gòu)域?qū)Γ隹勺兘Y(jié)構(gòu)域 對是同源對(cognate pair)。本文中使用的同源對意欲指天然的可變結(jié)構(gòu)域?qū)?，即從單個 抗體或表達抗體的細胞分離的可變結(jié)構(gòu)域?qū)Α?br>[0228] 可變結(jié)構(gòu)域可以是已被優(yōu)化和/或人源化的。
[0229] 來源于同源對的優(yōu)化的/人源化的可變結(jié)構(gòu)域在優(yōu)化/人源化后仍被認為是同源 對。
[0230] 因此，本發(fā)明擴展至人、人源化或嵌合分子。
[0231] 在一個實施方案中，分子特異性結(jié)合靶抗原。本文中使用的特異性結(jié)合意欲指，分 子對于靶抗原(其所特異于的抗原)具有高親和力并且以低或低得多的親和力結(jié)合(或根本 不結(jié)合)其所不特異于的抗原。測量親和力的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且包括測定 例如BI Acor e?。
[0232] 本發(fā)明的抗體分子適當?shù)鼐哂懈呓Y(jié)合親和力(特別地納摩爾或皮摩爾）。可使用本 領(lǐng)域已知的任何適當方法包括BIAcore?測量親和力。在一個實施方案中，本發(fā)明的分子具 有約IOOpM或更好的結(jié)合親和力。在一個實施方案中，本發(fā)明的分子具有約50pM或更好的結(jié) 合親和力。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法具有約40pM或更好的結(jié)合親和力。在一個實施 方案中，本發(fā)明的分子具有約30pM或更好的結(jié)合親和力。在一個實施方案中，本發(fā)明的分子 是完全人或人源化的，并且具有約IOOpM或更好的結(jié)合親和力。
[0233] 本文中使用的天然存在的結(jié)構(gòu)域的衍生物意欲指，其中已替代或缺失天然存在的 序列中的1、2、3、4或5個氨基酸，例如以優(yōu)化結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)（例如通過消除不期望的性質(zhì)）， 但其中仍然保留結(jié)構(gòu)域的特征性特征。
[0234] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體分子包含一個或多個白蛋白結(jié)合肽。在體內(nèi)，所 述肽結(jié)合白蛋白，這增加了分子的半衰期。
[0235] 可從分子的一個或多個可變區(qū)、鉸鏈或C端或不干擾分子抗原結(jié)合性質(zhì)的任何位 置附加白蛋白結(jié)合肽。
[0236]白蛋白結(jié)合肽的實例提供于WO 2007/106120中。
[0237] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還理解，抗體可經(jīng)歷多種翻譯后修飾。此類修飾的類型和程度通 常取決于用于表達分子的宿主細胞系以及培養(yǎng)條件。此類修飾可包括糖基化、甲硫氨酸氧 化、哌嗪二酮形成、天冬氨酸異構(gòu)化和天冬酰胺脫酰胺的變化。常見的修飾是，因羧肽酶的 作用而導致的羧基末端堿性殘基(例如賴氨酸或精氨酸）的丟失(如Harris,RJ.Journal of Chromatography 705:129-134,1995中所描述的）。
[0238] 必要時，可將用于本發(fā)明的分子綴合至一個或多個效應(yīng)分子。應(yīng)理解，效應(yīng)分子可 包含單個效應(yīng)分子或兩個或多個如此連接以形成可連接至本發(fā)明的抗體分子的單個部分 的此類分子。當期望獲得連接至效應(yīng)分子的根據(jù)本發(fā)明的抗體時，其可通過標準化學或重 組DNA法來制備，在所述方法中將抗體直接或通過偶聯(lián)劑連接至效應(yīng)分子。用于將此類效應(yīng) 分子綴合至抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的（參見，Hel Istrom等人，Controlled Drug Delivery，第2版，Robinson等人，eds ·，1987，pp · 623-53;Thorpe等人，1982，Tmmunol .Rev., 62:119-58和Dubowchik等人，1999，Pharmacology and Therapeutics,83,67-123)。具體 的化學方法包括例如WO 93/06231、W0 92/22583、W0 89/00195、W0 89/01476和W003031581 中描述的方法。或者，當效應(yīng)分子為蛋白質(zhì)或多肽時，可使用重組DNA法(例如WO 86/01533 和EP0392745中描述的方法)來實現(xiàn)連接。
[0239] 本文中使用的術(shù)語效應(yīng)分子包括例如，抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物學活性蛋白質(zhì) 例如酶、其它抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段例如DNA、RNA及其 片段、放射性核素特別地放射性碘化物、放射性同位素、螯合金屬、納米顆粒和報道基團例 如熒光化合物或可通過NMR或ESR光譜法檢測的化合物。
[0240] 效應(yīng)分子的實例可包括，細胞毒素或細胞毒性劑，包括對細胞有害（例如殺傷細 胞)的任何試劑。實例包括考布他汀(combrestatins)、多拉司他汀、愛波喜龍、星形孢菌素、 美登素(maytansinoids)、海綿抑制素、根霉素(rhizoxin)、軟海綿素、桿孢菌素、哈米特林 (hemiasterlins)、泰素(taxol)、細胞松弛素 B、短桿菌肽D、溴乙啶、依米丁、絲裂霉素、依托 泊苷、替尼泊苷、長春新堿、長春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、二羥基蒽二酮 (dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌、光輝霉素、放線菌素 D、l_去氫睪酮、糖皮質(zhì)激 素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同源物。
[0241] 效應(yīng)分子還包括但不限于，抗代謝物(例如甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、 阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪）、烷化劑(例如氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司 汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素 C和順二 氯二胺鉑（II)(DDP)順鉑）、蒽環(huán)類(例如柔紅霉素(先前稱為道諾霉素)和多柔比星）、抗生 素類(例如放線菌素 D(先前稱為放線菌素）、博來霉素、光輝霉素、安曲霉素(AMC)、加利車霉 素 (caI icheamicins)或多卡米星)和抗有絲分裂劑(例如長春新堿和長春堿）。
[0242] 其它效應(yīng)分子可包括螯合放射性核素例如111In和9°Y、Lum、祕 213、锎252、銥192和 鎢188/錸188;或藥物例如但不限于烷基磷酸膽堿、拓撲異構(gòu)酶I抑制劑、紫杉烷和舒拉明。
[0243] 其它效應(yīng)分子包括蛋白質(zhì)、肽和酶。有益的酶包括但不限于蛋白水解酶、水解酶、 裂合酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶。有益的蛋白質(zhì)、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白、毒素例如相思 豆毒蛋白、蓖麻蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素、蛋白質(zhì)例如胰島素、腫瘤壞死因子、α-干擾素、干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子或組織纖溶酶原激活物、血栓形成 劑或抗血管生成劑例如血管他丁或內(nèi)皮他丁、或生物學應(yīng)答修飾劑(biological response modifier)例如淋巴因子、白細胞介素 -I (IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、粒細胞-巨噬細胞集 落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、神經(jīng)生長因子(NGF)或其它生長因子 和免疫球蛋白。
[0244] 其它效應(yīng)分子可包括可用于例如診斷的可檢測的物質(zhì)。可檢測的物質(zhì)的實例包括 各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性核素、正電子發(fā)射金屬（用于正電 子發(fā)射斷層攝影術(shù))和非放射性順磁金屬離子。關(guān)于可綴合至抗體（以用作診斷劑）的金屬 離子，通常參見美國專利No . 4，741，900。適當?shù)拿赴ɡ备^氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半 乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶;適當?shù)妮o基包括鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素;適 當?shù)臒晒獠牧习▊阈瓮晒馑?、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪氨基熒光素、丹磺酰 氯和藻紅蛋白；適當?shù)陌l(fā)光材料包括魯米諾;適當?shù)纳锇l(fā)光材料包括螢光素酶、螢光素和 水母熒光素;適當?shù)姆派湫院怂匕?125I、131I、111In和"Tc。
[0245] 在另一個實例中，效應(yīng)分子可在體內(nèi)增加抗體的半衰期，和/或減小抗體的免疫原 性和/或增強抗體橫穿上皮屏障至免疫系統(tǒng)的遞送。該類型的適當效應(yīng)分子的實例包括聚 合物、白蛋白、白蛋白結(jié)合蛋白或白蛋白結(jié)合化合物例如WO 05/117984中描述的那些。
[0246] 當效應(yīng)分子是聚合物時，其通?？梢允呛铣傻幕蛱烊淮嬖诘木酆衔?，例如任選地 取代的直鏈或支鏈聚亞烷基(POlyalkyIene)、聚亞烯基(POlyalkenyIene)或聚氧亞烷基 (polyoxyalky Iene)聚合物或分支多糖或未分支多糖例如同多糖或雜多糖。
[0247] 可存在于上述合成的聚合物上的具體任選取代基包括一個或多個羥基、甲基或甲 氧基。
[0248]合成的聚合物的具體實例包括任選地取代的直鏈或支鏈聚（乙二醇）、聚（丙二 醇）、聚（乙烯醇)或其衍生物，特別地任選地取代的聚（乙二醇)例如甲氧基聚（乙二醇)或其 衍生物。
[0249] 具體的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈淀粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。
[0250] 如本文中使用的，"衍生物"意欲包括反應(yīng)性衍生物，例如巰基選擇性反應(yīng)性基團 例如馬來酰亞胺等?？蓪⒎磻?yīng)性基團直接或通過連接體區(qū)段連接至聚合物。應(yīng)理解，此類基 團的殘基在一些情況下將作為本公開內(nèi)容的抗體與聚合物之間的連接基團而構(gòu)成產(chǎn)物的 部分。
[0251] 可根據(jù)需要改變聚合物的大小，但其通常在500Da至50000Da，例如5000至40000Da 例如20000至40000Da的平均分子量范圍內(nèi)。可特別地基于產(chǎn)物的期望的用途例如定位至某 些組織例如腫瘤或延長循環(huán)半衰期的能力來選擇聚合物的大?。P(guān)于綜述，參見Chapman， 2002，Advanced Drug Delivery Reviews,54,531-545)。因此，例如，當期望產(chǎn)物離開循環(huán) 并且滲入組織（例如用于治療腫瘤）時，可以有利地使用小分子量聚合物（例如具有約 5000Da的分子量）。對于其中產(chǎn)物保留在循環(huán)中的應(yīng)用，可以有利地使用較高分子量的聚合 物(例如具有20000Da至40000Da的分子量）。
[0252]適當?shù)木酆衔锇ň蹃喭榛酆衔锢缇郏ㄒ叶?或，特別地甲氧基聚（乙二醇） 或其衍生物，特別地具有約15000Da至約40000Da的分子量。
[0253]在一個實例中，將用于本發(fā)明的抗體連接至聚（乙二醇）(PEG)部分。在一個具體的 實例中，可通過位于抗體中的任何可獲得的氨基酸側(cè)鏈或末端氨基酸官能團例如任何游離 氨基、亞胺基、巰基、羥基或羧基連接PEG分子。此類氨基酸可天然存在于抗體中或可使用重 組DNA法（參見例如US 5,219,996;US 5,667,425;W0 98/25971)工程化至抗體中。在一個實 例中，本發(fā)明的分子是修飾的抗體，其中修飾是將一個或多個氨基酸添加至其重鏈的C末 端以允許連接效應(yīng)分子?？蓪⒍鄠€位點用于連接兩個或更多個PEG分子。
[0254] 在一個實施方案中，將PEG分子連接至輕鏈中的半胱氨酸171，例如參見W02008/ 038024(其通過引用并入本文）。
[0255] 適當?shù)?，通過位于抗體中的至少一個半胱氨酸殘基的巰基共價連接PEG分子?？蓪?每一個連接至修飾的抗體的聚合物分子共價連接至位于抗體中的半胱氨酸殘基的硫原子。 共價連接通常是二硫鍵或，特別地硫-碳鍵。當巰基用作連接點時，可使用適當?shù)丶せ畹男?應(yīng)分子例如巰基選擇性衍生物例如馬來酰亞胺和半胱氨酸衍生物。激活的聚合物可在上述 聚合物修飾的抗體的制備中用作起始材料。激活的聚合物可以是包含巰基反應(yīng)性基團例如 α_鹵代羧酸或酯例如碘乙酰胺、酰亞胺例如馬來酰亞胺、乙烯基砜或二硫化物的任何聚合 物。此類起始材料可商購獲得（例如來自Nektar，之前為Shearwater Polymers Inc., Huntsvi I Ie，AL，USA)或可使用常規(guī)化學法從商購可得的起始材料制備而來。具體的PEG分 子包括20K甲氧基-PEG-胺（可獲自 Nektar，先前為Shearwater; Rapp Polymere;和SunBio) 和M_PEG_SPA(可獲自 Nektar，先前為Shearwater)。
[0256] 本發(fā)明還提供了編碼本文中描述的抗體分子的分離的DNA。
[0257] 在其它方面，提供了包含所述DNA的載體。
[0258] 可籍以構(gòu)建載體的一般方法、轉(zhuǎn)染法和培養(yǎng)法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知 的。在該方面，參考"Current Protocols in Molecular Biology"，1999，F(xiàn).M.Ausubel (ed) ,Wiley Interscience，New York和由Cold Spring Harbor Publishing出版的 Maniatis Manual〇
[0259] 在其它方面，提供了包含所述載體和/或DNA的宿主細胞。
[0260] 任何適當?shù)乃拗骷毎?載體系統(tǒng)可用于表達編碼本發(fā)明的分子的DNA序列?？墒褂?細菌例如大腸桿菌(E. coli)和其它微生物系統(tǒng)或也可使用真核生物(例如哺乳動物)宿主 細胞表達系統(tǒng)。適當?shù)牟溉閯游锼拗骷毎–HO、骨髓瘤或雜交瘤細胞。
[0261] 本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生本文中描述的抗體分子的方法，包括在適合于導致蛋 白質(zhì)從編碼本發(fā)明的抗體分子的DNA表達的條件下培養(yǎng)包含本發(fā)明的載體(和/或DNA)的宿 主細胞，和分尚抗體分子。
[0262] 為了產(chǎn)生包含重鏈和輕鏈的產(chǎn)物，可用兩種載體轉(zhuǎn)染細胞系，第一載體編碼輕鏈 多肽，第二載體編碼重鏈多肽?；蛘?，可使用單個載體，所述載體包括編碼輕鏈和重鏈多肽 的序列。
[0263] 根據(jù)本公開內(nèi)容的抗體分子以適當?shù)乃綇乃拗骷毎磉_，從而有助于它們進行 商業(yè)加工。
[0264] 抗體可以特異于任何靶抗原。抗原可以是細胞結(jié)合蛋白，例如細胞例如細菌細胞、 酵母細胞、T細胞、內(nèi)皮細胞或腫瘤細胞上的細胞表面蛋白質(zhì)，或其可以是可溶性蛋白質(zhì)。目 標抗原還可以是任何醫(yī)學相關(guān)蛋白質(zhì)例如在疾病或感染期間被上調(diào)的那些蛋白質(zhì)，例如受 體和/或其相應(yīng)的配體。細胞表面蛋白質(zhì)的具體實例包括，粘附分子例如整聯(lián)蛋白例如m整 聯(lián)蛋白，例如VLA-4、E-選擇蛋白、P選擇蛋白或L-選擇蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、 CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD45、CDW52、CD69、 CD134(0X40)、IC0S、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、CSF1 或CSFl-受體、DPCRl、DPCRl、dudul in2、FU20584、FU40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、 MAL2、MRP2、結(jié)合素-樣 2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌 胚抗原（CEA)、人乳脂肪球蛋白（HMFG1和2)、MHCI類和MHCII類抗原、KDR和VEGF、PD-1、DC-3?^、1'1^、01?、11^-7受體厶，以及適當時，其受體。
[0265] 可溶性抗原包括，白細胞介素例如11^1、幾-2、11^3、幾-4、11^-5、幾-6、11^-8、幾-12、幾-13、幾-14、幾-16或11^-17例如11^174和/或11^17?、病毒抗原例如呼吸道合胞病毒或巨 細胞病毒抗原、免疫球蛋白例如IgE、干擾素例如干擾素 α、干擾素 β或干擾素 γ、腫瘤壞死因 子TNF(先前稱為腫瘤壞死因子-α，在本文中稱為TNF或TNFa)、腫瘤壞死因子-β、集落刺激因 子例如G-CSF或GM-CSF以及血小板衍生生長因子例如PDGF-a和PDGF-KWISP-1，以及適當 時，其受體。其它抗原包括細菌細胞表面抗原、細菌毒素、病毒例如流感病毒、EBV、HepA、B 和C、生物恐怖試劑、放射性核素和重金屬、以及蛇和蜘蛛毒液和毒性。
[0266] 在一個實施方案中，抗體可用于功能性改變目標抗原的活性。例如，抗體可直接或 間接中和、詰抗或激動(agoni se)所述抗原的活性。
[0267] 本發(fā)明的抗體分子可用于治療和/或預(yù)防病理狀態(tài)。
[0268] 因此，提供了根據(jù)本發(fā)明的抗體，其用于進行治療(通過施用治療有效量的其，例 如在藥物制劑中）。在一個實施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的抗體局部施用至肺，例如通過吸入。
[0269] 本發(fā)明提供的抗體可用于治療疾病或障礙包括炎性疾病和障礙、免疫疾病和障 礙、纖維變性障礙和癌癥。
[0270] 術(shù)語"炎性疾病"或"障礙"和"免疫疾病或障礙"包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、銀肩病關(guān)節(jié) 炎、斯蒂爾病、Muckle WelIs病、銀肩病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡）、 哮喘、過敏性鼻炎、特應(yīng)性皮炎、多發(fā)性硬化、血管炎、I型糖尿病、移植和移植物抗宿主病。 [0271 ]術(shù)語"纖維變性障礙"包括特發(fā)性肺纖維化(IPF)、系統(tǒng)性硬化癥(或硬皮?。?、腎纖 維化、糖尿病腎病、IgA腎病、高血壓、終末期腎疾病、腹膜纖維變性(連續(xù)非臥床腹膜透析）、 肝硬化、年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)、視網(wǎng)膜病變、心臟反應(yīng)性纖維化(cardiac reactive fibrosis)、結(jié)癥(scarring)、癥痕瘰瘡(keloids)、燒傷、皮膚潰瘍、血管成形術(shù)、冠狀動脈 架橋外科手術(shù)、關(guān)節(jié)成形術(shù)和白內(nèi)障手術(shù)。
[0272] 術(shù)語"癌癥"包括從上皮產(chǎn)生的惡性新生物(malignant new growth)，見于皮膚或 更常見地身體器官(例如:乳腺、卵巢、前列腺、肺、腎、胰腺、胃、膀胱或腸)的內(nèi)襯中。癌癥傾 向于浸潤入鄰近組織中并且擴散(轉(zhuǎn)移)至遠處器官例如:至骨、肝、肺或腦。
[0273]本發(fā)明還提供了藥物或診斷組合物，其包含與藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或 載體中的一種或多種組合的本發(fā)明的抗體。因此，提供了本發(fā)明的抗體用于制造藥劑的用 途。通常組合物提供為無菌藥物組合物的部分，所述無菌藥物組合物通常包括藥學上可接 受的載體。本發(fā)明的藥物組合物可額外地包含藥學上可接受的佐劑。
[0274] 本發(fā)明還提供了用于制備藥物或診斷組合物的方法，包括添加本發(fā)明的抗體并 且將其與藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體中的一種或多種混合。
[0275] 本發(fā)明的抗體可以為藥物或診斷組合物中的唯一活性成分或可伴隨其它活性成 分，包括其它抗體成分例如抗-TNF、抗-IL-Ιβ、抗-T細胞、抗-IFN γ或抗-LPS抗體，或非抗體 成分例如黃嘌呤。其它適當?shù)幕钚猿煞职軌蛘T導耐受性的抗體例如抗CD3或抗CD4抗 體。
[0276] 在其它實施方案中，將根據(jù)本公開內(nèi)容的抗體或組合物與其它藥物活性劑例如皮 質(zhì)類固醇(例如丙酸氟替卡松)和/或β-2-激動劑(例如沙丁胺醇(salbutamol)、沙美特羅或 福莫特羅)或細胞生長和增殖的抑制劑(例如雷帕霉素、環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤)或CD28和/或 CD40抑制劑組合使用。在一個實施方案中，抑制劑是小分子。在另一個實施方案中，抑制劑 是特異于靶的抗體。
[0277] 藥物組合物適當?shù)匕委熡行Я康谋景l(fā)明的抗體。如本文中所使用的，術(shù)語"治 療有效量"是指治療、改善或預(yù)防目標疾病或病況或顯示可檢測的治療或預(yù)防效果所需的 治療劑的量?？稍诩毎囵B(yǎng)測定中或在動物模型中（通常在嚙齒類動物、兔、狗、豬或靈長類 動物中）初步估計治療有效量。動物模型還可用于測定適當?shù)臐舛确秶褪┯猛緩健ｋS后可 將這樣的信息用于確定在人中施用的有用劑量和途徑。
[0278] 用于人受試者的精確治療有效量將取決于疾病狀態(tài)的嚴重度、受試者的總體健康 狀況、受試者的年齡、體重和性別、飲食、施用的時間和頻率、藥物組合、對治療的反應(yīng)靈敏 性和耐受性/應(yīng)答。該量可通過常規(guī)實驗來測定并且在臨床醫(yī)生的判斷能力內(nèi)。通常，治療 有效量可為〇 · 〇lmg/kg至50mg/kg，例如0 · lmg/kg至20mg/kg?？梢砸园A(yù)定量的本發(fā)明的 活性劑/劑的單位劑量形式方便地提供藥物組合物。
[0279] 可將組合物單獨地給患者施用或可將其與其它試劑、藥物或激素組合施用（例如 同時、相繼地或分開地）。
[0280]本發(fā)明抗體的施用劑量取決于待治療的病況的性質(zhì)，例如存在的疾病/炎癥的程 度以及取決于分子被預(yù)防性使用還是用于治療現(xiàn)有病況。
[0281] 給藥的頻率取決于抗體的半衰期和其作用的持續(xù)時間。如果抗體具有短的半衰 期(例如2至10小時），則可能必需每天提供1個或多個劑量?；蛘撸绻贵w具有長的半衰期 (例如2至15天），則可能只需每天一次、每周一次或甚至每1或2個月一次給藥。
[0282] 藥學上可接受的載體本身應(yīng)當不誘導對接收組合物的個體有害的抗體產(chǎn)生并且 應(yīng)當不是有毒性的。適當?shù)妮d體可以是大的緩慢代謝的大分子例如蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)體、 多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物和無活性病毒顆粒。
[0283] 可使用藥學上可接受的鹽，例如礦物酸鹽例如鹽酸化物、氫溴化物、磷酸鹽和硫酸 鹽，或有機酸的鹽例如醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽。
[0284] 治療性組合物中的藥學上可接受的載體可額外地包含液體例如水、鹽水、甘油和 乙醇。此外，輔助物質(zhì)例如濕潤劑或乳化劑或PH緩沖物質(zhì)可存在于此類組合物中。此類載體 使得藥物組合物能夠被配制為片劑、丸劑、錠劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿劑、漿體和懸浮劑， 以用于患者攝入。
[0285] 施用的適當形式包括適用于胃腸外施用（例如通過注射或輸注，例如通過彈丸注 射(bolus injection)或連續(xù)輸注）的形式。當產(chǎn)物用于注射或輸注時，其可采取于油性或 含水媒介物中的懸浮劑、溶液或乳劑的形式并且其可包含配制劑(formulatory agent)例 如混懸劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，本公開內(nèi)容的分子可以以干燥形式存在，其 在使用前用適當?shù)臒o菌液體進行重建。
[0286] 配制后，可將本發(fā)明的組合物直接給受試者施用。待治療的受試者可以是動物。然 而，在一個或多個實施方案中，組合物適合于給人受試者施用。
[0287] 適當?shù)?，在根?jù)本公開內(nèi)容的制劑中，終制劑的pH與抗體的等電點的值不相似，例 如如果制劑的pH為7,則8-9或以上的pi可以是適當?shù)?。然而不希望受理論束縛，據(jù)認為這可 最終提供具有提高的穩(wěn)定性的終制劑，例如抗體保留在溶液中。
[0288] 可通過許多途徑施用本發(fā)明的藥物組合物，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動 脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)真皮、經(jīng)皮(例如，參見W098/20734)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)腸、 局部、舌下、陰道內(nèi)或直腸途徑。皮下注射器(Hypospray)也可用于施用本發(fā)明的藥物組合 物。通常，可將治療組合物制備為可注射的液體溶液或懸浮液。還可制備適合于在注射之前 在液體媒介物中配制為溶液或懸浮液的固體形式。
[0289] 通?？赏ㄟ^皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射或遞送至組織的間質(zhì)間隙 (interstitial space)來實現(xiàn)組合物的直接遞送。還可將組合物施用至損傷處。給藥治療 可以是單次給藥方案或多次給藥方案。
[0290] 應(yīng)理解，組合物中的活性成分是抗體。因此，其易于在胃腸道中降解。因此，如果通 過使用胃腸道的途徑施用組合物，則組合物將需要包含保護抗體免受降解但一旦其被胃腸 道吸收就立即釋放抗體的試劑。
[0291 ] 藥學上可接受的載體的詳盡論述可見于Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company,N.J.1991)〇
[0292] 在一個實施方案中，以用于局部施用(包括吸入)的制劑的形式提供制劑。
[0293] 適當?shù)目晌胫苿┌晌敕蹌?、包含噴射氣體的計量氣霧劑或不含噴射氣體 的可吸入溶液。包含活性物質(zhì)的根據(jù)本公開內(nèi)容的可吸入粉劑可僅由上述活性物質(zhì)組成或 由上述活性物質(zhì)與生理上可接受的賦形劑的混合物組成。
[0294] 此類可吸入粉劑可包括單糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖）、二糖(例如乳糖、蔗糖、麥 芽糖）、寡糖和多糖(例如葡聚糖）、多元醇(例如山梨醇、甘露醇、木糖醇）、鹽(例如氯化鈉、 碳酸鈣)或此類物質(zhì)彼此的混合物。適當?shù)兀褂脝翁腔蚨?，使用乳糖或葡萄?特別地但 非唯一地以其水合物的形式）。
[0295 ]用于在肺中沉積的顆粒需要小于10微米例如1 -9微米，例如0.1至5μηι，特別地1至5 μπι的粒度?；钚猿煞?例如抗體)的粒度是非常重要的。
[0296] 可用于制備可吸入氣霧劑的噴射氣體在本領(lǐng)域是已知的。適當?shù)膰娚錃怏w選自烴 類例如正丙烷、正丁烷或異丁烷，以及鹵代烴例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、環(huán)丙烷或環(huán)丁烷 的氯化和/或氟化衍生物?？蓡为毷褂蒙鲜鰢娚錃怏w本身或其混合物。
[0297] 特別適合的噴射氣體是選自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的鹵代烷烴衍生物。在 上述鹵代烴中，TG134a(l，I，1，2_四氟乙烷)和TG227(1，I，1，2，3，3，3_七氟丙烷)及其混合 物是特別適合的。
[0298] 包含噴射氣體的可吸入氣霧劑還可包含其它成分例如共溶劑、穩(wěn)定劑、表面活性 試劑(表面活性劑）、抗氧化劑、潤滑劑和用于調(diào)節(jié)pH的工具。所有這些成分在本領(lǐng)域是已知 的。
[0299] 根據(jù)本發(fā)明的包含噴射氣體的可吸入氣霧劑可包含高達按重量計5%的活性物 質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的氣霧劑包含例如按重量計〇 . 002至5 %，按重量計0.01至3 %，按重量計 0.015至2%，按重量計0.1至2%，按重量計0.5至2%或按重量計0.5至1 %的活性成分。
[0300] 或者，至肺的局部施用還可以是液體溶液或懸浮液制劑的施用，例如使用裝置例 如噴霧器，例如與壓縮機連接的噴霧器（例如，由Pari Respiratory Equipment, Inc.， Richmond，Va.制造的連接至Pari Mas ter(R)壓縮機的Pari LC-Jet Plus(R)噴霧器）。
[0301] 可以遞送例如以溶液或懸浮液的形式分散在溶劑中的本發(fā)明的抗體?？蓪⑵鋺腋?在適當?shù)纳韺W溶液例如鹽水或其它藥學上可接受的溶劑或緩沖溶液中。本領(lǐng)域已知的緩 沖溶液可包含〇 .〇5mg至0 · 15mg依地酸二鈉、8 · Omg至9 · Omg NaCl、0 · 15mg至0 · 25mg聚山梨醇 酯、0 · 25mg至0 · 30mg無水梓檬酸和0 · 45mg至0 · 55mg梓檬酸鈉/mL水，以獲得約4 · 0至5 · 0的 pH。懸浮液可使用例如凍干的分子。
[0302] 治療性懸浮液或溶液制劑還可包含一種或多種賦形劑。賦形劑在本領(lǐng)域是公知 的，包括緩沖劑(例如，檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、醋酸鹽緩沖劑和碳酸氫鹽緩沖劑）、 氨基酸、尿素、醇、抗壞血酸、磷脂、蛋白質(zhì)（例如，血清白蛋白）、EDTA、氯化鈉、脂質(zhì)體、甘露 醇、山梨醇和甘油?？蓪⑷芤夯驊腋∫悍庋b在脂質(zhì)體或生物可降解的微球體中。通常以大體 上無菌的形式(使用無菌制造法)提供制劑。
[0303] 這可包括生產(chǎn)和滅菌(通過過濾用于在無菌緩沖溶劑溶液中配制、無菌懸浮分子 的緩沖溶劑/溶液），以及利用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的方法將制劑分配至無菌容器中。
[0304] 可以例如以包裝在箱包膜中的單個劑量單位(例如，密封的塑料容器或小瓶)的形 式提供根據(jù)本公開內(nèi)容的可噴霧制劑(nebulizable formulation)。每一個小瓶在一定體 積例如2mL的溶劑/溶液緩沖液中包含單位劑量。
[0305] 本公開內(nèi)容的抗體被認為特別適合于通過噴霧法遞送。
[0306] 在本說明書的背景中，包含意欲表示包括。
[0307] 當技術(shù)上適當時，可組合本發(fā)明的實施方案。
[0308] 現(xiàn)參考下列實施例描述本發(fā)明，所述實施例僅僅是舉例說明性的并且不應(yīng)當以任 何方式解釋為限制本發(fā)明的范圍。 實施例
[0309] I. IgG4重鏈的誘變和產(chǎn)生突變的IgG4重鏈單基因載體
[0310] 使川Qui.ckchan.ge?Lightening Multi Site Directed Mutagenesis(SDM)試 劑盒或Qu i ckcha nge? π D SM試劑盒(獲自S t r a t a g en6?)(目錄號分別為21 ο 516和 200521 )，按照制造商的說明書進行氨基酸突變。
[0311] 通過DNA測序驗證突變。產(chǎn)生下表中的至少抗體1 -47的I gG4重鏈：
[0314] 制備的其它抗體描述于上文表1中。
[0315] 利用PCR和限制性酶克隆產(chǎn)生抗體48的重鏈(序列ID NO 35)。利用編碼IgGl上鉸 鏈區(qū)和核心鉸鏈區(qū)序列以及限制性位點BglII的正向寡核苷酸和編碼限制性酶DraIII位點 的反向寡核苷酸產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。隨后利用上述酶降解PCR片段，將其連接入包含適當?shù)目勺?區(qū)的hG4單基因載體。
[0316] 2.突變的IgG4抗體的表達
[0317] 將所有突變體DNA轉(zhuǎn)染進入CHOKl細胞或CHO-SXE細胞。將細胞（2xl08個細胞/ml) 重懸浮于Iml Earles Balance Salt Solution(Sigma)中并且與400yg的DNA(200yg重鏈 DNA和200ygK輕鏈DNA)混合。將800μ1等分試樣轉(zhuǎn)移至0.4cm小槽(Biorad)。對于500ml培養(yǎng) 物，在下列參數(shù)下對6個小槽進行電穿孔：Ims，9.6Amp; IOms，0Amp;40ms，3.2Amp。將轉(zhuǎn)染的 細胞在37°C下于5^^02潮濕的環(huán)境中以HOrpm振蕩溫育24小時，并且從轉(zhuǎn)染后第2天開始 在32°C下繼續(xù)溫育10-13天。在轉(zhuǎn)染后第4天，將1.6ml IM丁酸鈉添加至培養(yǎng)物。一旦細胞 達到40%的活力或直至第13天，收獲上清液。以4000rpm離心培養(yǎng)物45分鐘。將上清液通過 0·22μΜ Stericup過濾器(Millipore)以進行純化。圖28中的數(shù)據(jù)顯示，當從CHO-Kl或CHO-SXE細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)時，由工程化突變編碼的IgG4熱穩(wěn)定性的改變是相同的。
[0318] 3.突變的IgG4抗體的純化
[0319] 使用蛋白A 5ml HiTrap MabSelect SuRe柱子（GE Healthcare ,Amersham UK)純 化上清液(200-500ml)。通過添加1/50上清液體積的2M Tris-HCl pH 8.5來制備樣品。將樣 品以Iml/分鐘加載至柱子上。用PBS pH 7.4洗滌柱子。為了洗脫樣品，將0.1 M檸檬酸鈉 ，pH 3.4以lml/分鐘運行通過柱子，收集0.5ml級分。通過將0.125ml的2M Tris-HCl pH8.5添加 至每一個級分來中和峰級分。將紫外檢測設(shè)置在280nm。
[0320] 4.純化的突變的IgG4抗體的表征
[0321] SDS PAGE分析：
[0322] 將粗制上清液以1200rpm離心5分鐘，在OCTET上進行定量。通過添加適當量的抗 體、41上樣緩沖液（1]1￥；[1：1'08611)和2以110011^[呢1來制備抗體樣品（25-301^)。使用(1!120構(gòu) 成20μ1的總體積。隨后將樣品在100°C下煮沸3分鐘，將其加載至15孔1.5mm 4-20%Tris-甘 氨酸凝膠上。將凝膠在150V下于IX槽緩沖液(Tank buffer)中電泳1.5小時。使用iB1 0t干轉(zhuǎn) 移系統(tǒng)將抗體轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，進行8分鐘。在振蕩平臺上將膜在室溫(RT)下于PBS-TM 中溫育1小時，隨后用綴合有HRP的兔抗-人IgG Fc抗體(Jackson Immunoresearch)或綴合 有HRP的山羊抗-人κ輕鏈抗體(Bethyl)在RT下振蕩溫育1小時。之后用I 3BS-T洗滌3次，每次5 分鐘。按照制造商的說明書(Pierce)，使用金屬增強DAB底物試劑盒顯現(xiàn)印跡。
[0323] Western印跡分析的結(jié)果示于圖7、8、9和10中。在圖7-10中，H代表重鏈，L代表輕 鏈，H2L2為包含兩個重鏈和兩個輕鏈的完整抗體分子，HL為包含一個重鏈和一個輕鏈的半 分子。
[0324] 圖7顯示抗體15、16、6、7、8、17、18、19、1、2、3、12和13的恥8七6?1印跡分析。從圖7 中可以看到：除因鉸鏈突變C239S和C242S的存在而未顯示H2L2或顯示極少的H2L2的抗體8 外，抗體顯示良好的H2L2水平。然而，抗體8可通過重鏈間的非共價結(jié)合形成H2L2。突變體3 也顯示極少的H2L2，該突變體保留C239，但推測因 C端輕鏈(LC)半胱氨酸與鉸鏈C239之間的 二硫鍵的高效形成而不能在鉸鏈中形成重鏈間二硫鍵。還可看到:包含突變C239S但不包含 C242S的抗體（抗體2、6和12)顯示與不包含02393和02423的抗體或包含02423但不包含 C239S的抗體相比較減少的HL的形成。包含S241P突變的抗體16也顯示減少的HL的形成。突 變體2與3的比較顯示，與重鏈形成二硫鍵的輕鏈C端半胱氨酸的'延伸'的程度，輕鏈半胱氨 酸顯示與重鏈中的C239比與C242更有效地鍵合。
[0325] 圖8 顯示 了抗體 15、6、7、8、28、29、30、31、17、19、32、33、33、34、35、36、37、38和39的 Western印跡分析。從圖8可以看到：除因鉸鏈區(qū)中存在突變C239S和C242S(從而在兩個重鏈 之間無二硫鍵形成)而未顯示H2L2或顯示極少的H2L2的抗體8、31、35和39外，抗體顯示良好 的H2L2水平。然而，抗體8、31、35和39可通過重鏈之間的非共價結(jié)合形成!121^。還可看到:包 含突變C239S但不包含C242S的抗體(抗體6、29、33和37)顯示與不包含C239S和C242S的抗體 或包含C242S但不包含C239S的抗體相比較減少的HL的形成。突變體15能夠形成在輕鏈與 CHl中的G230C之間的二硫鍵以及重鏈間二硫鍵，從而導致完全裝配的二硫鍵鍵合的蛋白 質(zhì)。此外，突變體 15(C127S G230C)、28(C127S Y229C)、32(C127S K228C)和36(C127S S227C)的比較顯示：在上鉸鏈中的這些位置引入半胱氨酸增加了 LC-HC間二硫鍵的形成。 G230和Y229是引入半胱氨酸的特別優(yōu)選的位置。突變體28(C127S Y229C)顯示低水平的HL 和H2,從而具有低二硫鍵異質(zhì)性。
[0326] 圖9顯示抗體15、6、7、8、44、45、46、47、17和19的168七6?1印跡分析。從圖9可以看 到:除因鉸鏈區(qū)中存在突變C239S和C242S(從而在兩個重鏈之間無二硫鍵形成）而未顯示 H2L2或顯示極少的H2L2的抗體8和47外，抗體顯示良好的H2L2水平。然而，抗體8和47可通過 重鏈之間的非共價結(jié)合形成H2L2。還可看到：包含突變C239S但不包含C242S的抗體(抗體6 和45)顯示與不包含C239S和C242S的抗體或包含C242S但不包含C239S的抗體相比較減少的 HL的形成。特別地，突變體44顯示，3個氨基酸在上鉸鏈區(qū)的插入也可減少HL和H2的形成，從 而具有比可比較的突變體15更低水平的二硫鍵異質(zhì)性。
[0327] 圖10顯示抗體48、17、18和19的Western印跡分析。從圖10可以看到：抗體48顯示良 好的H2L2水平和極少的HL。突變體48包含IgGl上鉸鏈序列EPKSCDKTHT(替代IgG4上鉸鏈序 列）和核心鉸鏈S241P突變。因此，突變體48具有上鉸鏈和核心鉸鏈序列EPKSCDKTHTCPPCP。 突變體48顯示，與野生型IgG4抗體17相比較更低水平的二硫鍵異質(zhì)性，和與IgG4S241P突變 體18和野生型IgGl抗體19相比較大致相當?shù)牡退降亩蜴I異質(zhì)性。
[0328] Thermofluor 測定：
[0329] 使用S YPRO? Orange監(jiān)測蛋白質(zhì)的熱解折疊過程以在thermof Iuor測定中分析純 化的mAb的熱穩(wěn)定性。將5μ1的lmg/ml的mAb、5yl的30x染料和40μ1的PBS添加在一起。將10μ1 混合物以一式四份分配至PCR光學384孔板，并在7900ΗΤ Fast Real-Time PCR系統(tǒng) (Agilent Technologies UK Ltd,Wokingham UK)上運行。該PCR系統(tǒng)包括用于精確溫度控 制(設(shè)置在20°C至99°C)的加熱裝置;同時監(jiān)測孔中的熒光變化的電荷耦合裝置。
[0330] 圖11、12、13、14和15顯示IgG4抗體突變體的與野生型IgGl和IgG4抗體相比較的熱 穩(wěn)定性分析的結(jié)果。
[0331] 突變體15與野生型IgG4(突變體17)的比較顯示，由于改變的二硫鍵排列，F(xiàn)ab Tm 增加。突變體15與28的比較顯示，與包含G230C突變的突變體15相比較，包含Y229C突變的突 變體28的Fab Tm進一步增加。突變體15與44的比較顯示，可通過在上鉸鏈中插入3個氨基 酸來進一步增加 G230C突變體的Fab Tm。突變體17與18的比較顯示，S241P中鉸鏈突變不增 加 Fab Tm，即使其顯著減少HL的形成。當與野生型IgG4(突變體17)和突變體15相比較時，突 變體48還顯示顯著升高的Fab Tm。
[0332] 圖15顯示選擇的根據(jù)本發(fā)明的IgG4突變體的熱穩(wěn)定性的總體評級。突變體48、44、 44卩、46、45、6、29、30、28、28?、31、8、47和15全都顯示，與野生型1 864(突變體17)和野生型 IgG4S241P(突變體18)相比較顯著更高的Fab Tm值。
[0333]抗體親和力：
[0334]利用Biacore?測量選擇的本發(fā)明的突變體IgG4抗體對靶可溶性細胞因子的親和 力。測定形式為，將IgG捕獲在抗-Fe表面上，隨后進行可溶性細胞因子的滴定。
[0335] 結(jié)果示于圖16中，其中可看到：與對照IgGl和IgG4野生型抗體相比較，突變型抗體 顯示相當?shù)膶扇苄约毎蜃拥挠H和力。
[0336]術(shù)語〃 kdliT1)是指，抗體-抗原相互作用的解離速率常數(shù)。所述值也稱為kQff值。
[0337] 如本文中所使用的，術(shù)語IaIiT1iT1)是指，抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率常數(shù)。
[0338] 如本文中所使用的，術(shù)語〃Kd〃(M)或"KD"（pM)是指，抗體-抗原相互作用的解離平衡 常數(shù)。
[0339] 大小排阻（SEC)HPLC分析：
[0340] 使用S200柱在HPLC上運行約50ug純化的抗體。將Ab 1至19用于該分析。結(jié)果顯示， 盡管人IgG4分子的DSB排列發(fā)生了改變，但仍然形成非共價結(jié)合的H2L2。
[0341] HPLC分析的結(jié)果示于圖17中。
[0342] 可選的上鉸鏈間隔子長度
[0343]將長度為1至5個氨基酸的聚丙氨酸間隔子插入在PP與CPSP之間，即在用' ~ ' (ESKYCPP'CPSPA)標示的位置處。圖18顯示，任意長度的間隔子的插入足以減少突變體15中 H2或L2形成的量。然而，3個或更多個氨基酸的插入長度顯示提供了最大的熱穩(wěn)定性的增 加。應(yīng)指出，3個氨基酸的插入最近似地模擬IgGl與IgG4之間的上鉸鏈長度的差異。
[0344] 可選的上鉸鏈間隔子的氨基酸組成
[0345] 為了探究ESKYCPP'CPSPA上的三丙氨酸插入作為上鉸鏈間隔子是否具有特殊性 質(zhì)，測試兩個其它的三氨基酸插入:GGG和THT。圖19顯示，GGG和THT可功能性地用作間隔子 區(qū)域，盡管結(jié)果顯示它們并不相同。與AAA或THT相比較，GGG顯示較不能減少H2和L2的形成。 對于GGG和THT觀察到的熱穩(wěn)定性的增加不如對于AAA觀察到的大。
[0346] 可選的上鉸鏈間隔子的氨基酸長度和組成
[0347] IgG4在CHl鏈間半胱氨酸與第一核心鉸鏈半胱氨酸之間具有2個氨基酸(PP)的'間 隔子'，而IgGl具有5個氨基酸(DKTHT)的間隔子。構(gòu)建了4個突變體(68、67、66和56)以使得 能夠與突變體15(ESKYCPPCPSCP)進行比較。首先，用在IgGl中發(fā)現(xiàn)的等長度(DK)間隔子替 換IgG4的PP間隔子(突變體68(ESKYCDKCPSCP));隨后通過每次增加一個氨基酸來模擬IgGl 上鉸鏈間隔子：
[0348] 突變體 67(ESKYCDKTCPSCP)
[0349] 突變體 66(ESKYCDKTHCPSCP)
[0350] 突變體 56(ESKYCDKTHTCPSCP)。
[0351] 圖21中的數(shù)據(jù)表明，單個最重要的改變是從PP至DK，這導致與突變體15相比，H2、H 和L形成的減少。增加長度(插入另外的IgGl樣間隔子(T、TH和THT))顯示實現(xiàn)H2的最小增量 的減少，但可導致HL形成的額外增量的增加。由于突變體68、67、66和56包含CPSC核心鉸鏈 序列，因此，HL形成的增加可以是間隔子在將LC-HC鏈間二硫鍵半胱氨酸與核心鉸鏈半胱 氨酸分離(這因而易于形成分子內(nèi)二硫鍵)中更有效的證據(jù)。
[0352] 圖22中的數(shù)據(jù)表明，DK作為2個氨基酸的間隔子的選擇在減少二硫鍵同種型異質(zhì) 性方面優(yōu)于PP，比較突變體15(ESKYCPPCPSCP)與68(ESKYCDKCPSCP)以及突變體55 (ESKYCPPTHTCPSCP)與56(ESKYCDKTHTCPSCP)。已知短的多聚脯氨酸基序例如PP能夠編碼一 定水平的螺旋轉(zhuǎn)角潛能，這可導致LC-HC與核心鉸鏈半胱氨酸的局部并置。該局部作用顯示 被另外的AAA更好地克服，如在突變體44 (ESKYCPPAAACPSCP)中所觀察到的。突變體68、55、 56、44或69都未顯示具有顯著不同的熱穩(wěn)定性。
[0353]非間隔子上鉸鏈序列的組成的影響
[0354] 為了理解LC-HC CHl間半胱氨酸N端的上鉸鏈序列的序列組成（IgG4中的ESKY和 IgGl中的EPKS)的影響，在突變體15(ESKYCPPCPSCP)的背景中產(chǎn)生突變體的所有排列。圖23 中的數(shù)據(jù)顯示，在PP間隔子的背景中，上鉸鏈組成的排列均未顯示顯著影響二硫鍵同種型 的異質(zhì)性。上文中顯示的數(shù)據(jù)表明，該作用的不存在主要是因為蛋白質(zhì)包含能夠形成分子 內(nèi)二硫鍵的核心鉸鏈基序和短PP間隔子。然而，觀察到熱穩(wěn)定性的顯著差異。天然進化的序 列:ESKP(83.8°C)和EPKS(80.6°C)都比雜合序列:EPKY(76.3°C)和EPKS(79.0°C)更穩(wěn)定。數(shù) 據(jù)顯示，IgGlEPKS序列是最優(yōu)選的。
[0355] 為了理解ESKY或EPKS上鉸鏈基序在更優(yōu)選的DKTHT間隔子區(qū)域的背景中的重要 性，產(chǎn)生所有排列。圖24中的數(shù)據(jù)顯示，天然IgG4ESKY基序（突變體56ESKYCDKTHTCPSCP)最 易于產(chǎn)生二硫鍵同種型異質(zhì)性。數(shù)據(jù)24的數(shù)據(jù)確認，天然IgGl上鉸鏈序列（突變體 65EPKSCDKTHTCPSCP)具有最小的二硫鍵同種型異質(zhì)性的潛能和具有高的熱穩(wěn)定性。
[0356] 核心鉸鏈Ser至Pro的替換的影響
[0357] 突變最優(yōu)選的突變體48(EPKSCDKTHTCPPCP)以重新引入天然IgG4核心鉸鏈Ser (Ser241，按照Kabat編號的），從而產(chǎn)生突變體65(EPKSCDKTHTCPSCP)。圖20中的數(shù)據(jù)確認，突 變體48具有極顯著降低水平的H2、HL、H和L(與突變體15(ESKYCPPCPSCP)相比較）以及具有 極顯著增加的熱穩(wěn)定性。與突變體48相比，核心鉸鏈Ser 241的再引入(突變體65)不影響熱穩(wěn) 定性，但確實導致顯著水平的HL的再現(xiàn)。應(yīng)指出，突變體65仍然具有比突變體15更少的H2、H 和L，這說明了上鉸鏈序列的長度和組成在二硫鍵同種型同質(zhì)性方面的重要性。
[0358] 利用細胞裂解的抗體效應(yīng)子功能測定
[0359] 通過將表達細胞表面抗原的靶細胞與熒光增強配體MDTA-起溫育來標記靶細胞 的細胞內(nèi)內(nèi)容物。BADTA在細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)化成親水性配體TDA。將標記的細胞與抗體和PBMC(外 周血單核細胞）（作為裂解劑)一起溫育。在細胞裂解(在該實施例中通過ADCC裂解)后，TDA 被釋放并且當將銪添加至細胞培養(yǎng)物中時形成熒光的和穩(wěn)定的螯合物EuTDA。本質(zhì)上，細胞 內(nèi)容物的BADTA標記使得能夠定量細胞裂解。細胞裂解反過來提供為IgG效應(yīng)子功能的存在 的量度。圖25和26嘗試利用IgG4通過ADCC來裂解細胞。將赫賽汀抗體的類似物（曲妥珠單 抗)制備為IgGl野生型和IgG4野生型。在MCF7和SKBR3細胞上表達赫賽汀的Her-2抗原。還產(chǎn) 生了IgG赫賽汀類似物的突變體，純化IgG以用于ADCC測定。已知IgG4具有極低的進行ADCC 的能力，如通過對照IgGl野生型(wt)與IgG4野生型(wt)之間的差異所確認的。該先天ADCC 潛能的缺乏不受4種測試的IgG4突變體的任一種的影響。值得注意地，此類突變體包括具有 改變的LC-HC鏈間二硫鍵排列的突變體28、44和48,最值得注意的是，包含IgGl上鉸鏈和核 心鉸鏈基序的突變體48(EPKS⑶KTHTCPPCP)。因此這些數(shù)據(jù)顯示，描述的突變體并未因為使 用IgGl上鉸鏈和核心鉸鏈序列而獲得效應(yīng)子功能。
[0360]突變體對IgG4抗體的廣泛適用性
[0361]到目前為止，所描述的所有數(shù)據(jù)是關(guān)于特定的UCB專有的IgG4抗體Ab 410的數(shù) 據(jù)。為了證明二硫鍵同種型同質(zhì)性和熱穩(wěn)定性的改善并非是編碼該IgG的結(jié)構(gòu)/穩(wěn)定性的可 變區(qū)所獨有的，產(chǎn)生其它IgG4的試樣。將公共可獲得的序列信息用于產(chǎn)生3個工業(yè)相關(guān)IgG: 曲妥珠單抗(赫賽?。⒛撬閱慰?Tysabri)和托珠單抗(Actemra)的IgG4類似物?？偟膩?說，圖28-33中顯示的數(shù)據(jù)顯示，IgG4的關(guān)鍵突變體的相對性能在二硫鍵同種型同質(zhì)性和相 對熱穩(wěn)定性方面對于所有IgG4試樣是高度相似的。每一種試樣的絕對穩(wěn)定性彼此有些不 同，如根據(jù)先前公開的關(guān)于IgG的不同固有穩(wěn)定性的觀察結(jié)果所預(yù)期的。這些數(shù)據(jù)表明，所 描述的突變體能夠在所有IgG4分子中改善二硫鍵同種型同質(zhì)性和增加熱穩(wěn)定性。
[0362] IgG4突變體對實際考慮因素:表達和宿主細胞的影響
[0363]所描述的突變體在IgG4分子的范圍內(nèi)改善了二硫鍵同種型同質(zhì)性且增加了熱穩(wěn) 定性。圖27中的數(shù)據(jù)顯示，此類突變體未負面影響IgG4表達。所示的表達數(shù)據(jù)是，4個描述的 抗原特異性抗體(Ab410和曲妥珠單抗、那他珠單抗和托珠單抗的類似物）中的每一個抗體 的從CHO細胞瞬時表達的每一個突變體的平均表達。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)ab臂鏈間二硫鍵結(jié)構(gòu) 以及上鉸鏈和核心鉸鏈序列不是CHO細胞的產(chǎn)率的主要決定因素。圖31中的數(shù)據(jù)顯示， Ab410的熱穩(wěn)定性相同，無論突變體是在CHO-Kl細胞中還是在CHO-SXE細胞中表達。這些數(shù) 據(jù)證實，對IgG Fab臂鏈間二硫鍵結(jié)構(gòu)以及上鉸鏈和核心鉸鏈序列的突變是改善的熱穩(wěn)定 性的主要決定因素。
【主權(quán)項】
1. 一種IgG4類抗體，其包含至少一個含有CH1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的重鏈，其中在每一個重 鏈中： a. 所述CH1結(jié)構(gòu)域中的根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一種 氨基酸置換;和 b. 位于上鉸鏈區(qū)的一個或多個氨基酸被半胱氨酸置換。2. 權(quán)利要求1的抗體，其中位于上鉸鏈區(qū)中的被半胱氨酸置換的一個或多個氨基酸選 自根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的227、228、229和230。3. 權(quán)利要求2的抗體，其中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置230上的甘氨酸被半胱氨酸 置換。4. 權(quán)利要求2的抗體，其中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置229上的酪氨酸被半胱氨酸 置換。5. 權(quán)利要求2的抗體，其中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置228上的賴氨酸被半胱氨酸 置換。6. 權(quán)利要求2的抗體，其中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置227上的絲氨酸被半胱氨酸 置換。7. 權(quán)利要求1至6的任一項的抗體，其中重鏈中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置239上的 半胱氨酸和位置242上的半胱氨酸被另一種氨基酸置換。8. 權(quán)利要求1至6的任一項的抗體，其中重鏈中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置239上的 半胱氨酸被另一種氨基酸置換。9. 權(quán)利要求1至6的任一項的抗體，其中重鏈中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置242上的 半胱氨酸被另一種氨基酸置換。10. -種IgG4類抗體，其包含至少一個含有CH1結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的重鏈，其中在每一個重 鏈中： a. 根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的的位置127上的鏈間半胱氨酸被另一種氨基酸置換;和 b. 根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置239上的半胱氨酸或位置242上的半胱氨酸被另一種 氨基酸置換。11. 權(quán)利要求7至10的任一項的抗體，其中位置239上的半胱氨酸和/或位置242上的半 胱氨酸被不含巰基的氨基酸置換。12. 權(quán)利要求11的抗體，其中所述不含巰基的氨基酸是絲氨酸。13. 前述權(quán)利要求任一項的抗體，其中位置127上的半胱氨酸被不含巰基的氨基酸置 換。14. 權(quán)利要求13的抗體，其中所述不含巰基的氨基酸是絲氨酸。15. 前述權(quán)利要求任一項的抗體，其中所述重鏈經(jīng)突變以在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的 氨基酸226與243之間插入3個氨基酸。16. 權(quán)利要求15的抗體，其中所述重鏈經(jīng)突變以在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置238 與239之間插入3個氨基酸。17. 權(quán)利要求16的抗體，其中在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置238與239之間插入3個 丙氨酸。18. 權(quán)利要求16的抗體，其中在根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置238與239之間插入蘇氨 酸、組氨酸和另外的蘇氨酸。19. 前述權(quán)利要求任一項的抗體，其中根據(jù)Kabat編號系統(tǒng)編號的位置241上的絲氨酸 被脯氨酸置換。20. 前述權(quán)利要求任一項的抗體，其中位置230上的甘氨酸被半胱氨酸置換，位置227上 的絲氨酸被脯氨酸置換，位置229上的酪氨酸被絲氨酸置換，位置237上的脯氨酸被天冬氨 酸置換，位置238上的脯氨酸被賴氨酸置換，氨基酸序列蘇氨酸-組氨酸-蘇氨酸被插入在位 置238與239之間，并且位置241上的絲氨酸被脯氨酸置換。21. 前述權(quán)利要求任一項的抗體，其中所述重鏈包含CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。22. 前述權(quán)利要求任一項的抗體，其中所述抗體包含兩條如先前任一權(quán)利要求中所定 義的重鏈。23. 權(quán)利要求22的抗體，其中所述重鏈是相同的。24. 權(quán)利要求1至23的任一項的抗體，其中所述重鏈或每一個重鏈包含長度為12至17個 氨基酸的上鉸鏈區(qū)和核心區(qū)。25. 權(quán)利要求24的抗體，其中上鉸鏈和核心區(qū)的長度為15個氨基酸。26. -種表達載體，其包含編碼如權(quán)利要求1至25的任一項中所定義的抗體的序列。27. -種宿主細胞，其包含權(quán)利要求26中定義的載體。28. 權(quán)利要求1至25的任一項中定義的抗體，其用于治療疾病或障礙。29. -種用于治療疾病或障礙的方法，其包括施用治療有效量的權(quán)利要求1至25任一項 中定義的抗體。30. -種包含重鏈的IgG4抗體，所述重鏈具有上鉸鏈、核心和下鉸鏈，并且其中所述重 鏈或每一個重鏈的所述上鉸鏈和核心的長度為12至17個氨基酸，例如15個氨基酸。
【文檔編號】A61P35/00GK105859876SQ201610285782
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2011年8月19日
【發(fā)明人】D·P·漢弗萊斯, S·J·彼得斯, R·亞當斯, J·黑茲
【申請人】Ucb醫(yī)藥有限公司