一種用于功能基因的克隆及功能研究方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于功能基因的克隆及功能研究方法，所述方法先根據(jù)前人的研究結果明確所要研究的基因，制備該功能基因的多克隆抗體，利用Western blot和熒光PCR研究該功能蛋白在不同逆境脅迫下的表達變化情況，確定其與哪種逆境相關，再利用同源克隆分離該基因，隨后根據(jù)研究結果有目的的對該基因進行后續(xù)研究，明確其在相關逆境下的表達規(guī)律、功能等。所述方法工作量小，過程簡單，耗時少，目的性強。
【專利說明】
-種用于功能基因的克隆及功能研究方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明基因克隆領域，涉及一種用于功能基因的克隆及功能研究方法。
【背景技術】
[0002] 隨著對植物耐逆境分子機理的研究的不斷發(fā)展，人們對植物在逆境脅迫下的分子 機制有了更加深入的了解。但是對與植物各種逆境都相關的關鍵功能基因的研究還比較 少，并且對其的克隆還比較難。已經(jīng)有相關的研究報道闡明，在植物體內(nèi)存在一些關鍵的功 能基因，各種逆境脅迫可W引起送些基因的響應，并且通過它們的差異表達來應對各種逆 境脅迫。
[0003] 對植物中與各種逆境都相關基因的研究，已經(jīng)逐漸成為人們的研究熱點。但目前 存在一個嚴重的障礙。與植物各種逆境脅迫相關的基因有很多，并且每天還在W驚人的速 度增加，特別是在各種植物的基因組測序不斷完成后。但是，與各種逆境脅迫都相關的關鍵 攻功能基因鮮有報道，并且尋找十分困難。人們克隆得到一條基因，要想明確其是否與各種 逆境相關，要對其進行大量的后續(xù)試驗。且不說對該基因進行各種逆境下的表達規(guī)律分析 費時、費力，就僅僅是各種逆境處理取樣的過程就需要耗費相當長的時間。并且送種方式對 基因的研究十分盲目、目的性不強，往往在大量的試驗工作之后卻得不到明確的結果。隨著 各種先進的分子生物學技術的發(fā)明與發(fā)展，分離克隆和研究相關基因顯得相對簡單。只有 更有效率合理的利用送些技術才能克服上面的障礙，才能目的性更加明確的找到相關功能 基因，有的放矢的對其進行研究。本發(fā)明的發(fā)明人在對大豆的耐逆性研究中發(fā)現(xiàn)，大豆的在 逆境脅迫下的分子機理十分復雜，一些功能基因在送一過程中起著十分關鍵的作用，但是 利用常規(guī)的方法發(fā)現(xiàn)送些基因并明確功能的過程繁復兀長。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對上述問題，提供一種目的性更明確的基因克隆和功能研究方 法。
[0005] 本發(fā)明是通過W下技術方案來實現(xiàn)的： 一種用于功能基因的克隆及功能研究方法，包含W下步驟： (1) 制備目的功能基因的多克隆抗體； (2) 利用蛋白質印跡法（Western blot)和英光PCR檢測該目的功能基因在不同逆境脅 迫下的表達變化情況，明確其與各種逆境的關系； (3) 利用同源克隆分離該基因。
[0006] 作為優(yōu)選方式，還可W對所述步驟（3)中克隆得到的目的基因進行后續(xù)研究，明確 其在相關逆境下的表達規(guī)律和功能。
[0007] 作為優(yōu)選方式，所述所述目的基因為FtsH基因。
[0008] 作為優(yōu)選方式，所述FtsH基因的多克隆抗體通過W下步驟制備： 1)根據(jù)保守區(qū)域設計兩條多膚，序列如下： P巧I ;MFVGVGASRV畑LFRKAKENAPC P巧2 ;LGARPPRGVLLVGLPGTGKC ; 2) 合成步驟I)所設計的多膚并分別與KLH偶聯(lián)，得到偶聯(lián)蛋白GmFtsH-KLH-I和 GmFtsH-KLH-2 ； 3) 分別用上述步驟中所得偶聯(lián)蛋白對大白兔進行初次免疫，并進行3次加強免疫； 4) 對免疫后的大白兔行耳靜脈取血，測定免疫效價； 5) 對免疫后的大白兔行頸動脈取血，離必收集多抗血清，分別收集兩種多膚對應的多 克隆抗體。
[0009] 作為優(yōu)選方式，所述步驟（2)為：W分別在干旱、鹽、冷害和大豆胞囊線蟲四種脅 迫下大豆的葉片為材料，提取大豆蛋白，利用蛋白質印跡法（Western blot)和英光PCR檢 測FtsH蛋白在上述各種脅迫下的表達情況。
[0010] 作為優(yōu)選方式，所述同源克隆步驟為：W鹽處理的大豆葉片為材料提取RNA并反 轉錄成cDNA，W所得的CDNA作為模板進行PCR擴增，將得到的PCR產(chǎn)物連接到T載體上進 行測序驗證。
[0011] 作為優(yōu)選方式，所述同源克隆步驟包括： 1) 引物設計，根據(jù)已經(jīng)報道的FtsH基因序列，設計兼并引物； 2) 通過預實驗確定引物序列； 3) PCR擴增， 反應體系；4 U 1模板，4 U 1濃度為2. 5 ml的H磯酸脫氧核巧酸，5 U 1 IOX的緩沖液， 5 y 1正向引物（Primer F)，5]il反向引物（Primer R)，0. 5 y 1濃度為加 nit/ y 1的聚合酶， 26. 5 U 1 (1地2〇 ; 反應程序： 95°C,5 min ； 94°C，45 s，55°C，45 s，72°C，2min20 s;35 個循環(huán)； 72°C，10 min ;PCR 產(chǎn)物回收； 4) 連接、轉化， 連接；I y I載體，3 y I酶切回收產(chǎn)物，5y I連接酶混合物I y I無菌水混勻，室溫 反應30 min W上； 轉化；取出一8(TC保存的感受態(tài)細胞（D冊a )，放在冰上緩慢解凍，將感受態(tài)細胞加入 連接產(chǎn)物中混勻，冰上放置30 min,然后42°C熱激90 S，再冰浴2 min后，加入800 Ul無 抗性的18培養(yǎng)基，371：培養(yǎng)45 111111，5000巧111離必3 111111，棄大部分上清，留約100-150111， 重懸菌體，選擇有相應抗性的LB平板，涂板，瞭干，于37C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜； 5) 測序；選取PCR驗證正確的克隆進行測序。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述的方法克隆得到的基因，該基因具有如SEQ ID NO. 1所述的核巧酸序列。該基因的所述的核巧酸序列對應的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 述。
[0013] 本發(fā)明的有益效果： 多克隆抗體的制備、Western blot、同源克隆等技術經(jīng)過長期的發(fā)展，無論是方法還是 設備的使用都非常成熟。本發(fā)明的發(fā)明人非常巧妙的把送幾種技術結合起來，一反常態(tài)從 蛋白表達入手，先對目的基因的蛋白表達進行研究，明確其功能相關性，再對其進行克隆分 離，然后有目的性的對該基因進行后續(xù)研究，發(fā)明了一種目的性更明確的基因克隆和功能 研究方法，所述方法工作量小，過程簡單，耗時少，目的性強。利用本發(fā)明的方法，可W明確 的克隆功能基因，例如通過此方法可W直接分離得到與植物逆境相關的關鍵功能基因，進 一步了解植物的耐逆性分子機制。
【附圖說明】
[0014] 圖1為實施例2中免疫效價測定結果圖， 圖2為實施例4中PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，其中M為Marker ;1為樣品1 ;2為樣品2 ; 圖3為實施例5中干旱脅迫下GmFts肥基因的相對表達量分析； 圖4為實施例5中低溫脅迫下GmFts肥基因的相對表達量分析。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明，應該理解的是，送些實施例僅用 于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。
[001引 實施例1 用本發(fā)明的方法克隆基因 FtsH基因，其具體步驟為： (1) 制備FtsH基因的多克隆抗體； (2) 利用蛋白質印跡法（Western blot)和英光PCR檢測FtsH基因在不同逆境脅迫下 的表達變化情況，明確其與各種逆境的關系； (3) 利用同源克隆分離該基因。
[0017] 實施例2; 本實施例為上述FtsH基因的多克隆抗體的制備，其具體步驟為： 根據(jù)FtsH基因的保守區(qū)域設計兩條多膚，序列如下： GmFt sH-1 ;MFVGVGASRV畑LFRKAKENAPC GmFtsH-2 ：LGARPPRGVLLVGLPGTGKC ； 2) 合成步驟I)所設計的多膚并分別與KLH偶聯(lián)，得到偶聯(lián)蛋白GmFtsH-KLH-I和 GmFtsH-KLH-2 ； 3) 分別用上述步驟中所得偶聯(lián)蛋白（GmFtsH-KLH-I和GmFtsH-KLH-2)作為免疫原對 大白兔進行初次免疫，并進行3次加強免疫；免疫用兔子為2. Okg左右的新西蘭大白兔，免 疫之前耳靜脈取陰性血清，然后取200ug免疫原，用生理鹽水稀釋到200-500U1，再加入等 體積弗氏佐劑(初次免疫用弗氏完全佐劑，加強免疫用弗氏不完全佐劑）；用混勻儀器將溶 液和佐劑混勻，形成油包水。將混勻好的免疫原進行背部皮下注射免疫，打8-10個點。所 述耳靜脈取陰性血清的具體步驟為：用75%酒精擦拭兔子耳部靜脈，擦至靜脈充分擴張。然 后用注射器插入靜脈抽取陰性血l-2ml，全血在室溫靜置30min-120min后，500化pm離必 IOmin,收取血清。
[0018] 4)對免疫后的大白兔行耳靜脈取血，測定免疫效價，具體步驟為： 首先配置W下所述的試劑： 包被液；碳酸鋼-碳酸氨鋼緩沖液，pH9. 6 PBS緩沖液抑7. 4 封閉液；1%BSA或脫脂奶粉溶于PBS緩沖液中 洗液；PBS - T (0. 05%吐溫溶于PBS) 顯色液：1%A液+10%B液（A液；1%TMB溶于二甲基亞諷DMSO ;B液；0. 1% &〇2溶于巧樣 酸緩沖液） 終止液；2M硫酸 二抗；山羊抗兔IgG/HRP ; 然后用包被液稀釋抗原，終濃度為化g/ml，lOOul/孔，4°C，過夜；后用洗液洗涂2次； 封閉液封閉，200ul/孔，37C賠箱，2h ;后用洗液洗涂1次； 多抗血清從200倍開始2倍梯度稀釋（in PBS)，空白對照（blank)為PBS，陰性對照 (negative)為陰性血清200倍稀釋（in PBS);均為IOOul/孔，37°C賠箱，比；后用洗液洗涂 3次； 加入PBS稀釋20000倍的二抗，IOOul/孔，37°C賠箱，Ih ;取出后用洗液洗涂3次； 顯色，顯色液IOOul/孔，顯色時間為5-15min ; 每孔加入50ul終止液終止； 雙波長（450,603)測吸光值，記錄保存數(shù)據(jù)，并做圖分析； 效價為大于最大0D/2的最小OD讀數(shù)所對應的稀釋度。結果如表巧日圖1所示，效價 達要求。 「mi9l 要1化掠動價加Il吿結革
巧汪；效價刃天十最天UD/2的最小UD巧數(shù)所刈化的稀粋度。
[0020] 5)對免疫后的大白兔行頸動脈取血，離必收集多抗血清，分別收集兩種多膚對應 的多克隆抗體（Anti-GmFtsH-I和Anti-GmFtsH-2)。具體步驟為： 用麻醉劑麻醉兔子(戊己比妥鋼，30mg/kg，靜脈、腹腔、肌肉注射均可）； 兔子麻醉后，用固定架固定；用手術器械剪開脖子外層皮毛，于氣管側面下方找到頸動 脈，止血謝夾緊動脈管并剪斷放血，收集全血； 全血在室溫靜置30min-120min后，5000巧m離必lOmin，兩次離必后收取血清。
[00川 實施例3 本實施例為針對天然材料的Western blot檢測： W在干旱、鹽、冷害和大豆胞囊線蟲等脅迫下大豆品種抗線3號的葉片為材料，提取大 豆蛋白，利用Western blot和英光PCR研究FtsH蛋白在各種脅迫下的表達情況。結果如 圖2所示，F(xiàn)tsH的蛋白質大小預測在60-75kD，目前GmFtsH-I的抗體（Anti-GmFtsH-I)可 W識別目的蛋白質。
[002引 實施例4 本實施例為FtsH基因的同源克隆。通過已經(jīng)報道的FtsH基因序列，利用同源克隆的 方法，設計兼并引物；W鹽處理的大豆葉片為材料提取RNA并反轉錄成CDNA作為模板進行 PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物連接到T載體上進行測序驗證。發(fā)現(xiàn)擴增得到的基因序列與 擬南芥的Fts肥的同源性最為接近。在NCBI中查找相關的FT甜序列，并進行保守區(qū)分析。 具體步驟為： 1) 設計引物： FTSH-IF:ATGTCGGCGTTGGAGTATCTC FTSH-2F:ATGGCAGCRYCATCTCRGCATG FTSH-3F:ATGAAGCAAGTTMAWATC FTSH-MR:GTYTT肥CWGTBCCWGGRGACC FTSH-MF:GGTCYCCWGGVACWGGDAARAC FTSH-Rl:CTGCAATGGGAGGAGAGACCC FTSH-R2:GGAGTTGAAGGAGGGACMC FTSH-R3:CTAAAGGTGAAGACCCRCCACC 通過預實驗確定引物序列為： 正向引物（Primer F) ;CATGCCATGGAGATGGCAGCATCATCAGCATGC 反向引物（Primer R) ; CGGGATCCAACAGTGGCTGGTACTGG 2) PCR擴增 反應體系；4 U 1 模板，4 U 1 dNTPs (2. 5 ml)，5 U 1 Buffer (IOX)，5 U 1 Primer F，5 U 1 Primer R，0. 5 y I (加 nit/ y I)聚合酶，26. 5 y I d地20。
[002引反應程序： 95T.5
mi.n 55°C，45 S 35 個循環(huán) 72°C,2min20 s 720C，10 min。
[0024] PCR產(chǎn)物回收戚脂糖凝膠DNA回收試劑盒，BPI)，產(chǎn)物的凝膠電泳結果如圖2所 /Jn O
[00幼 3)連接、轉化 連接；1 Ul載體，3 Ul酶切回收產(chǎn)物，5 Ul連接酶混合物（TaKaRa, DNA ligation Kit Ver 2. 0) 1 y 1無菌水混勻，室溫反應30 min W上。
[0026]轉化： 取出一8(TC保存的感受態(tài)細胞（D冊a )，放在冰上緩慢解凍； 將感受態(tài)細胞加入連接產(chǎn)物中混勻，冰上放置30 min ; 42°C 熱激 90 S; 冰浴2 min后，加入800 U 1無抗性的LB培養(yǎng)基； 37 °C 培養(yǎng) 45 min ; 5000巧m離必3 min,棄大部分上清，留約100-150 U 1，重懸菌體，選擇有相應抗性的 LB平板，涂板； 瞭干，于37C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。
[0027] 4)測序 選取PCR驗證正確的克隆進行測序。
[002引 實施例5 本實施例為安照本發(fā)明所述方法克隆得到的FTSH基因的表達試驗，采用相對實時 定量PCRCrelative quantitativereal time PCR)分析，提取樣品的總RNA,反轉錄獲得 。0臟，^大豆1'冊]^抑（邑17。6阿1(16117(16-3-口11〇3口11曰16(16117化〇邑6]1曰36)為內(nèi)參基因，采用 實時反轉錄聚合酶鏈式反應（rea-1 time PCR)方法，檢測在干旱、高溫、鹽脅迫和熱脅迫 下、高溫和低溫脅迫下技皿巧5化表達水平，結果顯示該基因與干旱和低溫有關（圖3和圖 4)。
[0029] W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，對本發(fā)明而言僅是說明性的，而非限制性的； 本領域普通技術人員理解，在本發(fā)明權利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改 變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護范圍。
[0030] 沈卵ENCE LISTING <110〉 <120〉一種用于功能基因的克隆及功能研究方法 <130〉 <160〉 <170〉 <210〉 <211〉 <212〉 DNA <213〉GmFts肥基因的核巧酸序列 <400〉 1 1過tggc過gc過t C過tc過gc過tg CCttgt過ggg過過tggttt過t Ct過C過Cgggg t過過t過g過過t過 61 actcttaaga aggacttcaa tggaagaaga tatctctact catcttggag actttcatta 121 ttg過過C過過C過過t過過ggc過tc過過過過gc過ttt tcc過t過過過gg C過tctttgg過gc過過過ggc過過 181 gaagaaagga gaagggggtt tctgaaactg ttgcttggaa atctgggagt tggtttgcct 241 gc過Ct過ttgg g過過gtggc過過過gctt過tgct g過tg過過C過過g gggtttc過tc ctcc過g過過tg 301 tctt過ctcc過ggtttctgg過gt過tttgg過C過過gg過C過g過g tt過過過過過過gt gg過tcttt過t 361 g過C過過tgg過過過C過ctgctgt tgttg過ggct gtttcgcccg 過gttgggg過過 CCggtC過C過g 421 t過tgtt過g過g ttc過過ctccc tgg過Ctt過過C C過過g過gctcc ttc過g過過過tt c過ggg過過過過g 481 aatattgact ttgcagctca tagtccccaa gaagagtcag gttctctttt agctaacctg 541 attgggaatc tggctttccc tttgctcttg attggaggat tgttccttct ctcgagacga 601 tccggaggga tgggaggtcc tggtggccct ggatttcctc ttgcttttgg tcaatccaaa 661 gcc過過gtttc過過過tgg過過CC過過過C過CCgg過gtg過C過tttg過tg過tgttgc tggggtgg過t 721 g過過gcc過過gc Sggsctttst gg過ggtggtg g過gttttt過過過g過過gcctg過 g過ggttt過Ct 了81 gctgttgggg ctcgcattcc taaaggagtt cttcttgttg gtcctccagg aactgggaag 841 accttgttag ccaaggctat tgctggtgaa gctggtgttc catttttctc tatatcaggt 901 tctgagtttg ttgagatgtt tgttggtgtt ggtgcttctc gtgttcgtga tttgttcaag 961過過ggcg過過過g過g過過tgcccc ttgc過ttgtc tttgttg過tg過g過ttg過tgc tgttgg過過g過 1021 C過過過g過ggg過Ctgg過過ttgg tgg過ggg過過t g過tg過過過g過g過gc過g過CCCt C過過CC過過Ctt 1081 ttg過C過g過過過tgg過tgggtt tg過gggt過過C過C過ggt過tc過ttgtcgttgc過gc過過Ct過過C 1141 過gggCtg過C過 ttcttg過C過C ggCCttgttg 過g過CCtggCC g過tttg過t過g 過C過ggtg過C過 1201 gttg過tgttc C過g過t過t過過g ggg過過gg過Ct g過過過tcct過過過ggttc過tgc t過gc過過C過過過 1261 aagtttgatg ctgatgtttc tcttgaagtg attgcaatga gaacacctgg ctttagtgga 1321 gctg過tcttg Cgsstctgtt g過過tg過過get get過t過tt過g ctggtcgccg tgg過過gg過C過 1381 get過tttc過t Ct過過過g過過過t tg過tg過ttct過ttg過t過gg過ttgtggctgg過過tgg過過gg過 1441過C過gtg過tg過C過g過tggg過過g過gc過過過過gt tt過gtggc過t過tc過tg過過gt tggtc過tgct 1501 atttgtggaa ctttgactcc tggtcatgat gctgtgcaaa aggtaacgct agttcctcgc 1561 ggtcaagctc gtggacttac atggttcatt cctaacgatg acccaactct gatctccaaa 1621 C過過C過過Ctct ttgc過過g過過t tgt過gg過gg過Ct過ggtggg過gggctgc過g過過g過過過tt過tt 1681 ttcggtg過gc Ctg過過gtt過C 過過Ctgg過gc過 gctggtg過tt tgc過gc過過過t C過CCSgtttg 1741 gc過過過過C過g過tggtg過CC過C過tttgg過過tg tctg過t過ttg gtccttggtc gctt過tgg過過 1801 CC過tc過gc過C過過ggtgggg過tgtc過tc過tg過g過過tg過tgg C過過gg過過etc過過tgtc過g過g 1861過ggcttgc過g過過g過C過ttg過tgctgcc過tc過過g過gg過tct C過g過tg過過gc過t過tg過過過tt 1921 gc過CtggsgC過t過t過過gg過過C過過CCgtg過g gee過ttg過Cg過g過ttgtgg過過gtccttctg 1981 g過g過過gg過g過 ctctg過gcgg 過g過tg過過ttc Cgtgctstst tgtctg過gtt tgttg過過過tt 2041 ccagctgaaa accgtgttgc tccttcaact ccagtaccag ccactgtttg a <210〉 2 〈211〉 <212> PRT 〈213〉GmFtsH2基因的核昔酸序列對應的氨基酸序列 〈400〉 2 1 maassaclvg nglstrgnri tlkkdfngrr ylysswrlsl Innnkaskaf sikasleqrq 61 eerrrgfIkl Ilgnlgvglp allgsgkaya deqgvsssrm sysrfleyld kdrvkkvdly 121 dngntavvea vspelgnrsq yvrvqlpgln qellqkfrek nidfaahspq eesgsllanl 181 ignlafplll igglfIlsrr sggmggpggp gfplafgqsk akfqmepntg vtfddvagvd 241 eakqdfmevv eflkkperft avgaripkgv Ilvgppgtgk tllakaiage agvpffsisg 301 sefvemfvgv gasrvrdlfk kakenapciv fvdeidavgr qrgtgigggn dereqtlnql 361 Itemdgfegn tgiivvaatn radildtall rpgrfdrqvt vdvpdirgrt eiIkvhasnk 421 kfdadvslev iamrtpgfsg adlanllnea ailagrrgrt aisskeidds idrivagmeg 481 tvmtdgksks Ivayhevgha icgtltpghd avqkvtlvpr gqargltwfi pnddptlisk 541 qqlfarivgg Iggraaeeii fgepevttga agdlqqitsl akqmvttfgm sdigpwslme 601 ps過qggdvim rmm過rnsmse rl過edid過過i krisde過yei 過Iehirnnre 過ideivevll 661 eketlsgdef railsefvei paenrvapst pvpatv
【主權項】
1. 一種用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，包含以下步驟： (1) 制備目的功能基因的多克隆抗體； (2) 利用蛋白質印跡法和熒光PCR檢測該目的功能基因在不同逆境脅迫下的表達變化 情況，明確其與各種逆境的關系； (3) 利用同源克隆分離該基因。2. 根據(jù)權利要求1所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，還包括 以下步驟： 對所述步驟（3)中克隆得到的目的基因進行后續(xù)研究，明確其在相關逆境下的表達規(guī) 律和功能。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述 目的基因為FtsH基因。4. 根據(jù)權利要求3所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述 FtsH基因的多克隆抗體通過以下步驟制備： 1) 根據(jù)保守區(qū)域設計兩條多肽，序列如下： Pepl ：MFVGVGASRVRDLFRKAKENAPC Pep2 ：LGARPPRGVLLVGLPGTGKC ； 2) 合成步驟1)所述的多肽并分別與KLH偶聯(lián)，得到偶聯(lián)蛋白GmFtsH-KLH-1和 GmFtsH-KLH-2 ； 3) 分別用上述步驟中所得偶聯(lián)蛋白對大白兔進行初次免疫，并進行3次加強免疫； 4) 對免疫后的大白兔行耳靜脈取血，測定免疫效價； 5) 對免疫后的大白兔行頸動脈取血，離心收集多抗血清，分別收集兩種多肽對應的多 克隆抗體。5. 根據(jù)權利要求3所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述步 驟（2)為：以分別在干旱、鹽、冷害和大豆胞囊線蟲四種脅迫下大豆的葉片為材料，提取大 豆蛋白，利用蛋白質印跡法和熒光PCR檢測FtsH蛋白在上述各種脅迫下的表達情況。6. 根據(jù)權利要求3所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述同 源克隆步驟為：以鹽處理的大豆葉片為材料提取RNA并反轉錄成cDNA，以所得的cDNA作為 模板進行PCR擴增，將得到的PCR產(chǎn)物連接到T載體上進行測序驗證。7. 根據(jù)權利要求3所述的用于功能基因的克隆及功能研究方法，其特征在于，所述同 源克隆步驟包括： 1) 引物設計，根據(jù)已經(jīng)報道的FtsH基因序列，設計兼并引物； 2) 通過預實驗確定引物序列； 3. PCR擴增， 反應體系：4 μ 1模板，4 μ 1濃度為2. 5 mM的三磷酸脫氧核苷酸，5 μ 1 10X的緩沖液， 5μ 1正向引物，5μ 1反向引物，0. 5μ 1濃度為5unit/y 1的聚合酶，26. 5μ 1 ddH20 ; 反應程序： 95。。，5 min ; 94°C，45 s，55°C，45 s，72°C，2min20 s;35 個循環(huán)； 72°C，10 min;PCR 產(chǎn)物回收； 4) 連接、轉化， 連接：1 μ 1載體，3 μ 1酶切回收產(chǎn)物，5μ1連接酶混合物1 μ 1無菌水混勻，室溫 反應30 min以上； 轉化：取出一 80°C保存的感受態(tài)細胞，放在冰上緩慢解凍，將感受態(tài)細胞加入連接產(chǎn) 物中混勻，冰上放置30 min，然后42°C熱激90 s，再冰浴2 min后，加入800 μ 1無抗性的 LB培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)45 min，5000 rpm離心3 min，棄大部分上清，留約100-150μ1，重懸菌 體，選擇有相應抗性的LB平板，涂板，晾干，于37°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜； 5) 測序：選取PCR驗證正確的克隆進行測序。8. -種根據(jù)權利要求1所述的方法克隆得到的基因，其特征在于該基因具有如SEQ ID NO. 1所述的核苷酸序列。9. 根據(jù)權利要求8所述的基因，其特征在于：該基因的所述的核苷酸序列對應的氨基 酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
【文檔編號】C12N15/10GK105861633SQ201510023370
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月19日
【發(fā)明人】金勛
【申請人】金勛