一種可注射原位自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠的制備方法，該方法為透明質(zhì)酸鈉通過偶聯(lián)試劑4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽（DMTMM）的活化作用，與胱胺制備得到透明質(zhì)酸衍生物，再經(jīng)二硫蘇糖醇（DTT）還原得到透明質(zhì)酸巰基衍生物；同時透明質(zhì)酸鈉通過偶聯(lián)試劑DMTMM的活化作用，與多巴胺反應(yīng)制備得到兒茶酚化透明質(zhì)酸衍生物，兩者在無其它交聯(lián)劑參與下，互相混合形成水凝膠。
【專利說明】
一種可注射原位自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種自組裝、可注射、具有可點擊性的原位交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉水凝膠的制備方法，該透明質(zhì)酸鈉在抗衰老、藥物緩釋、關(guān)節(jié)腔潤滑液、注射美容等方面有潛在應(yīng)用價值。
【背景技術(shù)】
[0002]高分子凝膠是一類常見的水凝膠，其內(nèi)部含有大量水但不溶于水。其三維交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)由高分子主鏈及側(cè)鏈上的親水性和疏水性基團或解離基團組成，溶劑被固定在分子網(wǎng)絡(luò)中。高分子凝膠的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)點，可以是由共價鍵組成化學(xué)交聯(lián)，也可以是物理交聯(lián)，如靜電作用、氫鍵作用、疏水作用等。
[0003]水凝膠，尤其是以細(xì)胞間基質(zhì)材料制備得的高分子水凝膠，具備很多優(yōu)點，如可模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境、高含水量、良好的通透性、更好的生物相容性以及可調(diào)節(jié)的酶降解性能等。同時，細(xì)胞間基質(zhì)具有生物誘導(dǎo)作用，可以定向和誘導(dǎo)組織的特異性修復(fù)。例如透明質(zhì)酸鈉具有管理細(xì)胞粘附和迀移、調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和分化等生物學(xué)功能，以此制備的水凝膠在生物醫(yī)藥領(lǐng)域達(dá)到了越來越多的重視。透明質(zhì)酸是一種天然的高分子直鏈多糖，它是由N-乙?；?D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替連結(jié)而成的線型多糖。其以不同形式和不同濃度廣泛存在于機體的各種組織中，具有特殊的生理功能。
[0004]隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的醫(yī)生和病人傾向于微創(chuàng)手術(shù)，可注射的水凝膠生物醫(yī)用材料產(chǎn)品可以通過內(nèi)窺鏡的方式使用，也可以結(jié)合微創(chuàng)手術(shù)使用，同時適用于一些復(fù)雜形狀的三維傷口，可以很好地粘附于創(chuàng)面，有著廣大的應(yīng)用前景。例如，現(xiàn)市面上有著多種以透明質(zhì)酸鈉為原料制備的可注射交聯(lián)水凝膠，作為新一代的除皺填充材料，在醫(yī)療美容方面得到了廣泛的應(yīng)用。然而，大部分這些水凝膠類生物醫(yī)用材料產(chǎn)品的制備都采用先化學(xué)交聯(lián)，后純化去除殘余交聯(lián)劑和副產(chǎn)物的工藝，這類工藝難以保證徹底去除殘余交聯(lián)劑，或者部分官能團發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的殘余交聯(lián)劑被共價鍵固定在水凝膠中無法去除。這則會導(dǎo)致臨床使用上的炎癥反應(yīng)等毒副作用。其局限性舍得產(chǎn)品制備上需要復(fù)雜的純化工藝，同時提高了臨床使用上的風(fēng)險。
[0005]多巴胺，S卩4-(2-氨基乙基)-1，2_苯二酚，是貽貝粘附蛋白的衍生物，其粘附性主要是由于其兒茶酚基團對有機生物體的強親和作用力。其在氧化條件下，兒茶酚基團會轉(zhuǎn)化成醌，并伴隨著分子結(jié)構(gòu)重排。兒茶酚氧化后的醌結(jié)構(gòu)對很多官能團都能通過邁克爾加成或席夫堿反應(yīng)產(chǎn)生高效活性，如巰基、氨基以及醌本身。而兒茶酚-巰基反應(yīng)因其快速又堅固的性能成為一種制備交聯(lián)水凝膠的有效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于制備一種自組裝、可注射、具有可點擊性的原位交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其基本化學(xué)原理是特定條件下巰基和兒茶酚基團之間的快速化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)。本發(fā)明提供的原位交聯(lián)透明質(zhì)酸鈉水凝膠的有效組成是巰基化透明質(zhì)酸衍生物(組分A)和兒茶酚基團改性的透明質(zhì)酸衍生物(組分B)。本發(fā)明具有生物相容性好、不產(chǎn)生副產(chǎn)物、穩(wěn)定性好、使用方便、成本低廉等許多優(yōu)點。
[0007]在本發(fā)明中，組分A是指由巰基改性的透明質(zhì)酸溶液，組分B是指兒茶酚基團改性的透明質(zhì)酸溶液。兩者都以水為主要溶劑，也可含有一些鹽成分(如氯化鈉、磷酸緩沖鹽成分等)，起調(diào)節(jié)溶液滲透壓和穩(wěn)定溶液PH值等功能。
[0008]本發(fā)明提供的制備方法步驟包括:
(I)巰基化透明質(zhì)酸的制備:
0.01%?10%(w/v)透明質(zhì)酸水溶液中加入胱胺二鹽酸鹽和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM)(透明質(zhì)酸單元與胱胺二鹽酸鹽的摩爾比為1:0.1?3，透明質(zhì)酸單元與DMTMM的摩爾比1: 0.1?3)。攪拌均勻后，置于4?50°C環(huán)境下反應(yīng)一段時間。再通過二硫蘇糖醇(DTT)(DTT與透明質(zhì)酸單元的摩爾比大于等于1: 5)還原，得到透明質(zhì)酸的巰基衍生物。
[0009](2)兒茶酚化透明質(zhì)酸的制備:
0.01%?10%(w/v)透明質(zhì)酸水溶液中加入多巴胺鹽酸鹽和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM)(透明質(zhì)酸單元與多巴胺鹽酸鹽的摩爾比為1: 0.1?3，透明質(zhì)酸單元與DMTMM的摩爾比1:0.1?3)。攪拌均勻后，置于4?50°C環(huán)境下反應(yīng)一段時間，透析后冷凍干燥，即得到不同接枝率的透明質(zhì)酸的兒茶酚衍生物，再配制成不同濃度的兒茶酚化透明質(zhì)酸溶液。
[0010 ] (3)原位交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的制備:
取0.1?10%(w/v)巰基化透明質(zhì)酸溶液與0.1?10%(w/v)兒茶酚化透明質(zhì)酸溶液混合成凝膠。
【附圖說明】
[0011]圖1流變學(xué)時間掃描圖譜。
[0012]圖2樣品不同時間流變圖譜。
[0013]圖3彈性模量流變圖譜。
【具體實施方式】
[0014]現(xiàn)結(jié)合實施例，對本發(fā)明作詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。
[0015]實施例一
將胱胺二鹽酸鹽0.5 g溶解于15 mL水中，調(diào)節(jié)pH為4，稱取I g透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量1,300,000 DA)，攪拌均勻，稱取DMTMM I g用5 mL水完全溶解并將pH值調(diào)為4，然后加入混合液中，待完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)2天。將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每I h更換透析液I次并稱重，直到凝膠質(zhì)量不再增加時，終止透析。將該凝膠粉碎制粒后，用I M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)凝膠pH值為8，混合均勻后，加入二硫蘇糖醇2 g，室溫下過夜反應(yīng)，得到的反應(yīng)液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH到3左右后，將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中(截留分子量10000)，用I mM的鹽酸和0.3 M的氯化鈉溶液透析2天，最后用I mM的鹽酸透析I天。收集透析好的溶液并冷凍干燥得樣品A，待用。
[0016]將0.5 g透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量I，300，000 DA)溶解于25 mL水中，并調(diào)節(jié)pH值至5，再加入0.25 g多巴胺鹽酸鹽和0.5 g DMTMM，避光條件下攪拌反應(yīng)24 h后，用I mM的鹽酸透析3天，冷凍干燥，得樣品B，待用。
[0017]將0.1 g樣品A和0.1 g樣品B分別溶于5 mL PBS溶液，并快速混合兩者溶液，于室溫下得水凝膠。
[0018]實施例二
將胱胺二鹽酸鹽0.25 g溶解于15 mL水中，調(diào)節(jié)pH為6，稱取Ig透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量
310.000DA)，攪拌均勻，稱取DMTMM 0.5 g用5mL水完全溶解并將pH值調(diào)為6，然后加入混合液中，待完全攪拌均勻后，室溫下反應(yīng)I天。將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每I h更換透析液I次并稱重，直到凝膠質(zhì)量不再增加時，終止透析。將該凝膠粉碎制粒后，用IM的NaOH水溶液調(diào)節(jié)凝膠pH值為8，混合均勻后，加入二硫蘇糖醇1.5 g，室溫下過夜反應(yīng)，得到的反應(yīng)液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH到3左右后，將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中(截留分子量10000)，用I mM的鹽酸和0.3 M的氯化鈉溶液透析2天，最后用I mM的鹽酸透析I天。收集透析好的溶液并冷凍干燥得樣品A，待用。
[0019]將0.5 g透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量310,000 DA)溶解于25 mL水中，并調(diào)節(jié)pH值至5，再加入0.5 g多巴胺鹽酸鹽和0.5 g DMTMM，避光條件下攪拌反應(yīng)48 h后，用I mM的鹽酸透析3天，冷凍干燥得樣品B，待用。
[0020]將0.1 g樣品A和0.1 g樣品B分別溶于5 mL PBS溶液，并快速混合兩者溶液，于室溫下得水凝膠。
[0021 ] 實施例三
將胱胺二鹽酸鹽I g溶解于15 mL水中，調(diào)節(jié)pH為7，稱取1.2 g透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量
710.000DA)，攪拌均勻，稱取DMTMM I g用5 mL水完全溶解并將pH值調(diào)為7，然后加入混合液中，待完全攪拌均勻后，4°C下反應(yīng)3天。將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每Ih更換透析液I次并稱重，直到凝膠質(zhì)量不再增加時，終止透析。將該凝膠粉碎制粒后，用I M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)凝膠pH值為8，混合均勻后，加入二硫蘇糖醇2.5 g，室溫下過夜反應(yīng)，得到的反應(yīng)液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH到3左右后，將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中(截留分子量10000)，用ImM的鹽酸和0.3 M的氯化鈉溶液透析2天，最后用I mM的鹽酸透析I天。收集透析好的溶液并冷凍干燥得樣品A，待用。
[0022]將0.6 g透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量710,000 DA)溶解于25 mL水中，并調(diào)節(jié)pH值至5，再加入0.5 g多巴胺鹽酸鹽和I g DMTMM，避光條件下攪拌反應(yīng)24 h后，用I mM的鹽酸透析3天，冷凍干燥得樣品B，待用。
[0023]將0.1 g樣品A和0.1 g樣品B分別溶于5 mL PBS溶液，并快速混合兩者溶液，于室溫下得水凝膠。
[0024]實施例四
將胱胺二鹽酸鹽1.5 g溶解于15 mL水中，調(diào)節(jié)pH為7，稱取1.4 g透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量470，000 DA)，攪拌均勻，稱取DMIlM 1.5 g用5 mL水完全溶解并將pH值調(diào)為7，然后加入混合液中，待完全攪拌均勻后，于4°C下反應(yīng)2天。將反應(yīng)好的凝膠切成塊后，用PBS緩沖液透析，每I h更換透析液I次并稱重，直到凝膠質(zhì)量不再增加時，終止透析。將該凝膠粉碎制粒后，用I M的NaOH水溶液調(diào)節(jié)凝膠pH值為8，混合均勻后，加入二硫蘇糖醇2 g，室溫下過夜反應(yīng)，得到的反應(yīng)液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH到3左右后，將溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中(截留分子量10000)，用I mM的鹽酸和0.3 M的氯化鈉溶液透析3天，最后用I mM的鹽酸透析2天。收集透析好的溶液并冷凍干燥得樣品A，待用。
[0025]將0.4 g透明質(zhì)酸鈉干粉(分子量470,000 DA)溶解于25 mL水中，并調(diào)節(jié)pH值至5，再加入0.5 g多巴胺鹽酸鹽和I g DMTMM，避光條件下攪拌反應(yīng)16 h后，用I mM的鹽酸透析5天，冷凍干燥得樣品B，待用。
[0026]將0.1 g樣品A和0.1 g樣品B分別溶于5 mL PBS溶液，并快速混合兩者溶液，于室溫下得水凝膠。
[0027]實施例五
將實施例一中所制備的白色絮狀固體樣品A(巰基化透明質(zhì)酸)用瑪瑙研缽研磨至細(xì)，隨后放入105°C烘箱恒重至干燥，取出放入干燥皿中冷卻20分鐘。各精密稱取3份2，5_雙(5-叔丁基-1，3-苯并噁唑-2-基)噻酚(BBOT標(biāo)準(zhǔn)品)和樣品(2.5 ± 0.5 )mg，放入錫囊中，擠壓包裹，放入元素分析儀進樣檢測。經(jīng)元素分析法計算而得，制備樣品的巰基含量為24.19%。
[0028]實施例六
將實施例二得到0.1 g樣品A和0.1 g樣品B分別溶于5 mL PBS溶液，并快速混合兩者溶液，于旋轉(zhuǎn)流變儀下檢測其儲存模量G，，損耗模量G”隨時間變化曲線，如圖1所示。
[0029]實施例七
由實施例二得到的水凝膠，分別檢測兩組分混合2小時、6小時、24小時后得到的水凝膠的彈性模量，其儲存模量G’，損耗模量G”隨頻率的變化曲線如圖2所示。
[0030]實施例八
由實施例二、三、四得到的水凝膠，分別檢測其彈性模量，其儲存模量G’，損耗模量G”隨頻率的變化曲線如圖3所示。
【主權(quán)項】
1.一種可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠的制備方法，其主要特征在于是特定條件下巰基和兒茶酚基團之間的快速化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)。2.權(quán)利要求1所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠的制備方法，其特征在于采用下述方法制備巰基化透明質(zhì)酸衍生物(組分A)和兒茶酚基團改性的透明質(zhì)酸衍生物(組分B)，其步驟包括: (1)巰基化透明質(zhì)酸的制備: 0.1%?10%(w/v)透明質(zhì)酸水溶液中加入胱胺二鹽酸鹽和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM);攪拌均勻后，置于2?50°C環(huán)境下反應(yīng)一段時間；再通過二硫蘇糖醇(DTT)還原，得到透明質(zhì)酸的巰基衍生物，再配制成不同濃度的巰基化透明質(zhì)酸溶液； (2)兒茶酚化透明質(zhì)酸的制備: 0.1%?10%(w/v)透明質(zhì)酸水溶液中加入多巴胺鹽酸鹽和4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM);攪拌均勻后，置于2?50°C環(huán)境下反應(yīng)一段時間，透析后冷凍干燥，即得到不同接枝率的透明質(zhì)酸的兒茶酚衍生物，再配制成不同濃度的兒茶酚化透明質(zhì)酸溶液； (3 )原位交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠的制備: 取0.1?10%(w/v)巰基化透明質(zhì)酸溶液與0.1?10%(w/v)兒茶酚化透明質(zhì)酸溶液混合成凝膠。3.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于制備巰基化透明質(zhì)酸使用的修飾試劑為胱胺或胱胺鹽酸鹽，與透明質(zhì)酸鈉的比例為I /10?5/1 (mo I /mo I)。4.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于用于制備巰基化透明質(zhì)酸反應(yīng)的溶液體系的pH為3?9。5.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于使用的透明質(zhì)酸鈉起始反應(yīng)濃度為0.l-10%(m/m%)。6.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于使用的偶聯(lián)試劑4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽(DMTMM)與透明質(zhì)酸鈉的比例為1/10?5/l(mol/mol)07.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于反應(yīng)的溫度范圍為2?50°C。8.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于制備反應(yīng)的時間范圍為2?120 ho9.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于制備巰基化透明質(zhì)酸的二硫蘇糖醇的加入量與透明質(zhì)酸鈉的比例為I/5?10/1 (moI/moI)。10.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于制備兒茶酚化透明質(zhì)酸使用的修飾試劑為多巴胺鹽酸鹽，與透明質(zhì)酸鈉的比例為1/10?5/1 (mol/mol)。11.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于用于制備兒茶酚化透明質(zhì)酸反應(yīng)的溶液體系的pH為2?7。12.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于所述的透析方法為在含有2.5?15克NaCl的pH為2?5的鹽酸水溶液中透析I?5天，在pH為2?5的鹽酸水溶液中透析I?5天。13.如權(quán)利要求2所述的可注射的自組裝透明質(zhì)酸鈉水凝膠，其特征在于所述冷凍干燥得冷阱溫度為-40~-60°C，真空度為<40 Pa。
【文檔編號】A61K9/06GK105906824SQ201610020881
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年1月13日
【發(fā)明人】魏長征, 吳祎, 宋瑞瑞, 蔣麗霞
【申請人】上海其勝生物制劑有限公司