不同血清型肺炎鏈球菌莢膜多糖的水解方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及疫苗制備領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及不同血清型肺炎鏈球菌芙膜多糖的水 解方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎鏈球菌肺炎或稱肺炎球菌肺炎，是由肺炎鏈球菌或稱肺炎球菌 (S化eptococcus pneumoniae)所引起的肺炎，通常急驟起病，W高熱、寒戰(zhàn)、咳嗽、血疲及胸 痛為特征。在過去的兩個(gè)世紀(jì)，沒有幾種傳染性病原體在全球的發(fā)病率和死亡率可與肺炎 鏈球菌相匹敵，每年導(dǎo)致全球一百萬5歲W下兒童死亡。肺炎鏈球菌仍然是社區(qū)獲得性肺炎 的主要原因，在成人中主要引起大葉性肺炎，在兒童中常引發(fā)細(xì)菌性肺炎、腦膜炎、中耳炎、 胸膜炎等疾病。在沒有抗生素之前，約有70% W上因肺炎菌血癥住院的病人死亡。嬰幼兒中 20-48%的急性中耳炎和50%的化脈性中耳炎是由肺炎鏈球菌引起的，菌血癥感染會(huì)引起 較高的死亡率。據(jù)估計(jì)，肺炎鏈球菌性肺炎在成人的發(fā)病率每年為0.1-0.47 %，病死率為 11 %。我國肺炎發(fā)病率一直很高，近40多年來，其菌血癥死亡率一直徘徊在25-29%之間，院 外獲得性肺炎中肺炎鏈球菌性肺炎可達(dá)46-76%。針對(duì)肺炎鏈球菌的感染，多年來一直采用 抗生素治療，然而目前耐藥菌株多達(dá)96% W上，且呈現(xiàn)多重耐藥性狀。因此，開發(fā)疫苗W預(yù) 防該菌引起的疾病至關(guān)重要。
[0003] 已發(fā)現(xiàn)的肺炎鏈球菌有90多個(gè)血清型，是建立在芙膜抗原的微少差異及家兔免疫 器官對(duì)芙膜化學(xué)成份之間的微小差異加 W識(shí)別的，并產(chǎn)生對(duì)每種抗原的特異性抗體基礎(chǔ)上 進(jìn)行分型的。肺炎鏈球菌的芙膜抗原是迄今為止細(xì)菌性疫苗中抗原結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的，其型特 異性多糖是由許多重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成的大分子聚合體，構(gòu)成了胸腺非依賴性抗原(thymus- independent ，ΤΙ) 的特性。芙膜多糖 Kapsular polysaccharide ，CPS) 即是細(xì)菌的毒性因子 又是一種重要的保護(hù)性抗原。
[0004] 利用化學(xué)方法純化的細(xì)菌芙膜多糖制備組分疫苗是20世紀(jì)疫苗發(fā)展的重要成就 之一，也是第二次疫苗革命的標(biāo)志之一。在世界范圍內(nèi)廣泛使用的多糖疫苗如流行性腦膜 炎球菌A、C、Y、W135等4價(jià)多糖疫苗，肺炎23價(jià)多糖疫苗，傷寒Vi多糖疫苗等。大量臨床試驗(yàn) 結(jié)果表明，接種多糖疫苗引起的副反應(yīng)十分罕見，運(yùn)些疫苗對(duì)于預(yù)防成人和大齡兒童的相 應(yīng)感染方面效果顯著。令人遺憾的是多糖疫苗在年幼兒童中產(chǎn)生的抗體親合力低，對(duì)嬰幼 兒的效果甚微或根本無效。將細(xì)菌芙膜多糖與蛋白載體通過化學(xué)方式結(jié)合可W解決運(yùn)個(gè)缺 點(diǎn)，可將多糖胸腺不依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵僖蕾囆钥乖?，從而啟?dòng)T輔助淋己細(xì)胞產(chǎn)生一系 列的免疫增強(qiáng)效應(yīng)，并產(chǎn)生免疫記憶應(yīng)答；1987年B型流感嗜血桿菌化化)結(jié)合疫苗的成功 研制，開創(chuàng)了結(jié)合疫苗發(fā)展史上的又一個(gè)里程碑，結(jié)合疫苗成為兒童疫苗研究中的一個(gè)熱 點(diǎn)。隨后國際市場上陸續(xù)出現(xiàn)了 A+C、ACYWi35群腦膜炎結(jié)合疫苗和7價(jià)、10價(jià)、13價(jià)肺炎鏈球 菌結(jié)合疫苗。其它各類含芙膜多糖或含脂多糖的細(xì)菌的結(jié)合疫苗也陸續(xù)上市。
[0005] 由于肺炎鏈球菌芙膜多糖的分子量較大，導(dǎo)致多糖溶液的粘度也大，造成多糖活 化、結(jié)合物制備和純化等步驟難W操作。使用大分子多糖作為原料多糖將導(dǎo)致結(jié)合物過度 交聯(lián)、結(jié)合物的分子量過大，從而對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量造成風(fēng)險(xiǎn)，可能使免疫效果變差。為改變芙 膜多糖的分子量大的運(yùn)種情況，在進(jìn)行活化、結(jié)合工藝之前，對(duì)肺炎球菌芙膜多糖進(jìn)行降解 處理。
[0006] 常用的肺炎球菌芙膜多糖降解方法有W下幾種：1、乙酸降解法;2、Ξ氣乙酸降解 法;3、氨氧化鋼降解法。
[0007] 本發(fā)明采用過氧化氨法降解肺炎球菌芙膜多糖，并對(duì)該方法進(jìn)行了改良，W獲得 相對(duì)分子量變小的肺炎鏈球菌芙膜多糖或寡糖，從而滿足活化結(jié)合的工藝要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供利用過氧化氨實(shí)現(xiàn)對(duì)不同血清型肺炎鏈球菌芙膜多糖水解 的方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的不同血清型肺炎鏈球菌芙膜多糖的水解方法，包 括:向不同血清型肺炎鏈球菌芙膜多糖的水溶液中加入過氧化氨溶液與無機(jī)鹽溶液對(duì)多糖 進(jìn)行水解，于50°c-8(rc反應(yīng)3-5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后，將含有不同大小多糖水解片段的反應(yīng)混 合物進(jìn)行超濾濃縮，然后過S邱harose 4FF凝膠層析柱進(jìn)行純化，收集kD值0.2-0.65的分離 峰，經(jīng)超濾濃縮、凍干后得到不同血清型肺炎鏈球菌芙膜多糖的水解產(chǎn)物。
[0010] 本發(fā)明所述的不同血清的型肺炎鏈球菌包括血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、9N、 14、18C、19F、19A、22F、23F、33F。
[0011] 本發(fā)明所述的無機(jī)鹽包括硫酸鋒、硫酸銅、硫酸儀、硫酸儘等;優(yōu)選硫酸鋒。
[0012] 前述的方法，反應(yīng)體系中芙膜多糖、過氧化氨與硫酸鋒的質(zhì)量比為1-5 :4.5-9: 0.161。
[0013] 對(duì)于1、2、3、4、18C、23F血清型的芙膜多糖，反應(yīng)體系中芙膜多糖、過氧化氨與硫酸 鋒的質(zhì)量比為1 -5:9:0.161。過柱純化后，收集kD值0.2-0.6的分離峰。
[0014] 對(duì)于6A、7F、9N、14、19F血清型的芙膜多糖，反應(yīng)體系中芙膜多糖、過氧化氨與硫酸 鋒的質(zhì)量比為1 -5:9:0.161。過柱純化后，收集kD值0.3-0.6的分離峰。
[0015] 對(duì)于5、68、9￥、194、22。、33。血清型的芙膜多糖，反應(yīng)體系中芙膜多糖、過氧化氨與 硫酸鋒的質(zhì)量比為1 -5:9:0.161。過柱純化后，收集kD值0.35-0.65的分離峰。
[0016] 前述的方法，優(yōu)選使用截留分子量lOkD的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮。
[0017] 本發(fā)明還提供采用上述方法獲得的肺炎鏈球菌芙膜多糖水解產(chǎn)物在制備肺炎鏈 球菌多糖疫苗或肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗中的應(yīng)用。
[0018] 采用本發(fā)明提供的改良的過氧化氨法可W實(shí)現(xiàn)對(duì)不同血清型肺炎鏈球菌芙膜多 糖的水解，將芙膜多糖水解為不同大小的片段，所得水解片段均保留了抗原性，未破壞抗原 決定簇的基本結(jié)構(gòu)，符合多價(jià)肺炎結(jié)合疫苗制備工藝的要求，可用于制備適合于2歲W下嬰 幼兒的多價(jià)肺炎結(jié)合疫苗。
【具體實(shí)施方式】
[0019] W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。W下實(shí) 施例中使用的1 OkD超濾膜購自PU化公司；S巧harose 4FF凝膠層析柱購自GE公司。
[0020] 本發(fā)明中設(shè)及到的百分號(hào)"％"，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分 比，除另有規(guī)定外，是指1 OOmL溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)。
[0021] 實(shí)施例1 1、2、3、4、18C、23F型肺炎球菌芙膜多糖的水解
[0022] 用注射用水溶解多糖l-5mg，使其完全溶解，加入終濃度為3%的過氧化氨與終濃 度為ImM硫酸鋒溶液(相當(dāng)于芙膜多糖、過氧化氨與硫酸鋒的質(zhì)量比為1-5:9:0.16)，反應(yīng)溫 度50°C-80°C，反應(yīng)3-5小時(shí)。用lOkD超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，0.85%氯化鋼溶液超濾換液，換 液5次，每次8倍體積稀釋。濃縮到反應(yīng)混合物體積的5倍，用Se地arose 4FF凝膠層析柱純 化，收集kD值0.2-0.6的分離峰，收集后超濾濃縮至原上樣體積，凍干回收肺炎鏈球菌芙膜 多糖的水解產(chǎn)物。采用瓊脂雙擴(kuò)散法，檢測水解后產(chǎn)物，與肺炎球菌血清形成明顯的沉淀 線。
[0023] 實(shí)施例2 6A、7F、9N、14、19F型肺炎球菌芙膜多糖的水解
[0024] 用注射用水溶解多糖l-5mg，使其完全溶解，加入終濃度為2%的過氧化氨與終濃 度為ImM硫酸鋒溶液(相當(dāng)于芙膜多糖、過氧化氨與硫酸鋒的質(zhì)量比為1-5:6:0.161)，反應(yīng) 溫度50°C-80°C，反應(yīng)3-5小時(shí)。用1 OkD超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，0.85%氯化鋼溶液超濾換液， 換液5次，每次8倍體積稀釋。濃縮到反應(yīng)混合物體積的5倍，用Se地aro