一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)dna生物傳感器及制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于三維石墨烯?樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器的制備方法。將三維石墨烯(3DGR)和樹(shù)枝狀納米金(Au)依次固定到離子液體修飾碳糊電極(CILE)表面構(gòu)建傳感界面，然后利用巰基乙酸(MAA)將ssDNA固定在該界面之上，以增大探針ssDNA的固定量和界面導(dǎo)電性。通過(guò)掃描電鏡(SEM)觀察電極表面納米材料的形貌結(jié)構(gòu)，使用亞甲基藍(lán)(MB)作為電化學(xué)雜交指示劑，利用循環(huán)伏安(CV)和示差脈沖伏安(DPV)等電化學(xué)技術(shù)，考察了所構(gòu)建傳感器的電化學(xué)行為、選擇性和靈敏度等電化學(xué)性能參數(shù)，結(jié)果表明此種電化學(xué)DNA生物傳感器具有較低的檢測(cè)限、較寬的檢測(cè)范圍和良好的選擇性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物電化學(xué)分析及電化學(xué)傳感器的制備領(lǐng)域，具體涉及一種三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金修飾的電化學(xué)DNA生物傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]電化學(xué)DNA生物傳感器是DNA生物傳感器的一種，其一般由一個(gè)固定ssDNA片段的電極和用于檢測(cè)雜交反應(yīng)的電活性雜交指示劑構(gòu)成。Ghanbari等在鉑電極表面電化學(xué)聚合了具有納米結(jié)構(gòu)的導(dǎo)電聚合物，并將探針ssDNA固定在其表面，以亞精胺為雜交指示劑進(jìn)行檢測(cè)。(Ghanbari K., Bathaie S.Z., Mousavi M.F.，Electrochemical Iyfabricated polypyrrole nanofiber-modified electrode as a new electrochemicalDNA b1sensor, B1sensors and B1electronic, 2008, 23: 1825-1831)。探針DNA分子在電極表面的固定量及其雜交活性會(huì)直接影響電化學(xué)DNA傳感器的靈敏度。Sun等人在離子液體修飾碳糊電極表面恒電位法沉積三維石墨烯，三維石墨烯修飾電極的有效面積是裸電極的5.5倍，有效的提高了修飾電極的比表面積(Wei Sun, Fei Hou, Shixing Gong, LinHan, Wencheng Wang, Fan Shi, Jingwen Xi, Xiuli Wang, Guangjiu Li , Directelectrochemistry and electrocatalysis of hemoglobin on three-dimens1nalgraphene modified carbon 1nic liquid electrode, Sensors and Actuators B:Chemical 2015 , 219, 331-337) oShakoori等在1，6己二硫醇修飾的金電極上靜電吸附金納米棒，使用鐵氰化鉀作為指示劑，金納米棒修飾電極的氧化還原峰電流是裸電極峰電流的1.3倍，電極表面的金納米棒加快了電子的傳遞速率(Zahra Shakoori SamanehSalimian Sharmin Kharrazi Mahdi Adabi Reza Saber, Electrochemical DNAb1sensor based on gold nanorods for detecting hepatitis B virus, Analyticaland B1analytical Chemistry, 2015, 407: 455-461)。
[0003]納米材料具有大的表面積和孔體積，常用來(lái)做為電極表面的修飾劑以增大電極的有效面積，又因其具有良好的生物相容性和吸附性，在生物電分析化學(xué)方面起著重要的作用。
[0004]石墨烯是一種新型的二維碳納米材料，具有由單層碳原子緊密堆積而成的二維蜂窩狀晶體結(jié)構(gòu)。三維石墨烯是以二維石墨烯納米片為基本單元構(gòu)建的宏觀材料。具有柔韌性好、多孔性、高活性表面積、突出的電子傳遞性能等獨(dú)特的性質(zhì)，在能源、環(huán)境、傳感器和生物分析等領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明意在制備具有高靈敏度、檢測(cè)范圍寬、選擇性高的電化學(xué)DNA生物傳感器，這對(duì)電極表面DNA的固定量和雜交活性有很高的要求，本研究提供了一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案:
(I)納米材料修飾電極的制備
利用電化學(xué)沉積方法，將三維石墨烯和樹(shù)枝狀納米金于沉積溶液中修飾在CILE表面，使用二次蒸餾水清洗電極表面后室溫下晾干，即可制得Au/3DGR/CILE;
(2 )MAA在電極表面的自組裝
將步驟I中制備的修飾電極浸泡在MAA溶液中，室溫條件下避光自組裝24小時(shí)，取出后用二次蒸餾水沖洗，記為MAA/Au/3DGR/CILE ；
(3)ssDNA探針的固定及與目標(biāo)ssDNA的雜交
將步驟2中處理后的電極繼續(xù)浸泡在電極活化液中，活化30分鐘，取出后分別用5% SDS溶液和二次蒸餾水沖洗，然后在電極表面均勻滴涂10 pL探針ssDNA儲(chǔ)備液。自然晾干后分別用5% SDS溶液和二次蒸餾水沖洗。隨后將10 uL含有目標(biāo)序列的TE緩沖溶液直接滴涂在ssDNA/MAA/Au/3DGR/CILE表面，室溫下雜交反應(yīng)30分鐘后分別用5% SDS溶液和二次蒸餾水沖洗，即完成分子雜交反應(yīng)，得到dsDNA/MAA/Au/3DGR/CILE。
[0007]一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法，所述步驟(I)中三維石墨稀和樹(shù)枝狀納米金的沉積溶液分別為3.0 mg/L氧化石墨稀與1.0 mg/L高氯酸鋰的混合溶液液和5.0 mmol/L HAuCl4與0.5 mol/L KNO3混合溶液，沉積電位和時(shí)間分別為-1.3 V, 50 s和-0.4 V, 300 S。
[0008]一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法，所述步驟(2)MAA的濃度為10 mmol/L。
[0009]一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法，所述步驟(3)電極活化液為含有5.0 mmol/L EDC和8.0 mmo/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液(PBS) ;TE緩沖溶液是由三羥甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)配制而成;探針ssDNA儲(chǔ)備液為含有1.0 X 10—6 mol/L的氨基化探針ssDNA序列的pH8.0的TE緩沖溶液。
[0010]本發(fā)明設(shè)計(jì)的電化學(xué)DNA生物傳感器，以CILE離子液體修飾碳糊電極作為基底電極，分別將三維石墨烯和樹(shù)枝狀納米金依次通過(guò)電化學(xué)沉積到電極表面，然后利用MAA與Au之間的Au-S共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的MAA自組裝膜修飾電極，最后利用縮合反應(yīng)將氨基化探針DNA固定到電極表面，制備出相應(yīng)的ssDNA修飾電極。使用滴涂法完成探針ssDNA與目標(biāo)ssDNA的雜交，最后采用MB作為電化學(xué)指示劑，通過(guò)CV和DPV等電化學(xué)技術(shù)進(jìn)行電化學(xué)信號(hào)檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為電極表面不同納米材料的SEM圖，A，B為沉積在裸電極表面上的三維石墨烯于不同放大尺寸下的電鏡圖；C，D為沉積在三維石墨烯上的樹(shù)枝狀納米金的電鏡圖。
[0012]圖2為不同修飾電極(a到f分別為CILE，Au/CILE,dsDNA/MAA/Au/3D_GR/CILE，ssDNA/MAA/Au/3D-GR/CILE, MAA/Au/3D_GR/CILE和Au/3D_GR/CILE)在I.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5 mol/L KCl混合溶液中的循環(huán)伏安曲線。
[0013]圖3為MB在不同雜交情況電極上的DPV曲線。a到e分別為雜交前、與非互補(bǔ)序列雜交后、與三堿基錯(cuò)配序列雜交后、與單堿基錯(cuò)配序列雜交后、與目標(biāo)序列雜交后的DPV曲線。
[0014]圖4為ssDNA/MAA/Au/3DGR/CILE與不同濃度的目標(biāo)序列雜交后MB的DPV曲線。a到j(luò)的目標(biāo)序列濃度依次為O，1.0X10—14，1.0X10—13，1.0X10—12，1.0X10—n, 1.0X10—10，1.0X10-9，1.0X10-8，1.0X10—7，1.0X10—6 mol/L，(內(nèi)嵌圖為 MB 的的還原峰電流與目標(biāo)序列濃度間的線性關(guān)系)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面給出的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不超出本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。
[0016]實(shí)施例1
電化學(xué)DNA傳感器的制備 I試劑和儀器
試劑:石墨粉，1-己基吡啶六氟磷酸鹽，氧化石墨烯，高氯酸鋰，氯金酸，硝酸鉀，巰基乙酸，乙基-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，N-羥基琥珀酰亞胺，鐵氰化鉀，氯化鉀；
儀器:CHI 750B電化學(xué)工作站，三電極系統(tǒng)(工作電極、參比電極和鉑電極)；
2方法
(1)基底電極的制備
按一定的比例將石墨粉、離子液體和液體石蠟充分混合研磨后，裝入內(nèi)插細(xì)銅絲的玻璃電極管內(nèi)壓實(shí)，即得離子液體修飾碳糊電極(CILE)。使用前在拋光紙上打磨至鏡面；
(2)納米材料修飾電極的制備
將新制備CILE電極浸泡在含有3.0 11^/1氧化石墨烯和1.0 mg/L高氯酸鋰的混合液中，緩慢攪拌并通入氮?dú)?，?1.3V恒電位沉積還原50 S。取出后用二次蒸餾水沖洗，室溫晾干后得到3DGR/CILE。其表觀結(jié)構(gòu)如圖1中A和B所示，三維石墨烯表現(xiàn)出卷曲、薄片和多孔等微觀結(jié)構(gòu)。將上述制備的3061?/(:11^放在5.0 mmol/L HAuCl4和0.5 mol/L KNO3混合溶液中-
0.4 V恒電位沉積300 S。取出后用二次蒸餾水沖洗，室溫晾干后得到Au/3DGR/CILE。其表觀結(jié)構(gòu)如圖1中C和D，納米金表現(xiàn)為樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)，均勻分布在石墨烯表面之上；
(3)電化學(xué)DNA傳感器的制備
將Au/3DGR/CILE浸泡在10.0 mmol/L巰基乙酸溶液中，室溫條件下避光自組裝24小時(shí)，取出后用二次蒸餾水沖洗，記為嫩4/^11/3061?/(:11^。繼續(xù)將其浸入含5.0 mmol/L EDC和8.0mmo/L NHS的pH 7.0的PBS溶液中活化30分鐘，然后在電極表面均勻地滴涂10 探針ssDNA儲(chǔ)備液。室溫晾干后分別用5% SDS溶液和二次蒸餾水沖洗。隨后將10 pL含有目標(biāo)序列的TE緩沖溶液直接滴涂在ssDNA/MAA/Au/3DGR/CILE表面。室溫下雜交反應(yīng)30分鐘后分別用5%SDS溶液和二次蒸餾水沖洗，得到dsDNA/MAA/Au/3DGR/CILE。
[0017]實(shí)施例2
不同修飾電極的電化學(xué)行為
圖2為CILE (a), Au/CILE (b), dsDNA/MAA/Au/3D_GR/CILE (c), ssDNA/MAA/Au/3D_GR/CILE (d), MAA/Au/3D-GR/CILE (e)和Au/3D_GR/CILE ⑴在 1.0 mmol/L K3[Fe (CN)6]和0.5 mol/L KCl混合溶液中的循環(huán)伏安圖。曲線b的氧化還原峰電流大于曲線a的，說(shuō)明納米金的存在可以加快電極表面電子的傳遞速率；曲線f的氧化還原峰電流明顯大于曲線b的，說(shuō)明具有大的比表面積的二維石墨稀可以大幅度的提尚電極的有效面積，為納米金的生成提供更多的結(jié)合位點(diǎn)。納米金在三維石墨烯表面沉積后形成復(fù)合材料具有更好的電學(xué)性能，相應(yīng)的氧化還原峰電流最大:曲線e為自組裝一層MAA膜后電化學(xué)響應(yīng)，由于MAA帶負(fù)電性會(huì)排斥溶液中的[Fe(CN)6]3—/4—探針，因此峰電流比曲線f的要小;進(jìn)一步固定ssDNA后，曲線d所對(duì)應(yīng)的電流進(jìn)一步降低，這是由于ssDNA上的帶負(fù)電的磷酸骨架進(jìn)一步阻礙了 [Fe(CN)6]3V4—的擴(kuò)散;在dsDNA修飾電極(曲線c)上電流比曲線d降低，這是由于dsDNA的存在比ssDNA的阻礙作用更強(qiáng)。
[0018]實(shí)施例3
電化學(xué)DNA生物傳感器的選擇性
通過(guò)ssDNA/MAA/Au/3D-GR/CILE與不同序列的ssDNA進(jìn)行雜交，研究構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器的選擇性。圖3所示了MB在不同雜交情況電極上的DPV響應(yīng)信號(hào)(電極浸入含有5.0 X10_5 mol/L MB的pH 7.0 PBS溶液中)，曲線a到e分別為雜交前、與非互補(bǔ)序列雜交后、與三堿基錯(cuò)配序列雜交后、與單堿基錯(cuò)配序列雜交后、與目標(biāo)序列雜交后的DPV曲線，其響應(yīng)結(jié)果依次逐漸增大。原因可歸結(jié)為MB僅與ssDNA發(fā)生靜電吸附，然而與dsDNA不僅發(fā)生靜電吸附，還與dsDNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)存在溝槽作用，因此MB和dsDNA分子之間的親和能力更強(qiáng)。隨著堿基錯(cuò)配序列的減少，形成的雙鏈結(jié)構(gòu)越完整，所結(jié)合的MB分子越多，MB的DPV信號(hào)逐漸增強(qiáng)。因此本發(fā)明構(gòu)建的電化學(xué)DNA生物傳感器具有良好的選擇性。
[0019]實(shí)例4
電化學(xué)DNA生物傳感器的靈敏度
通過(guò)考察ssDNA/MAA/Au/3D-GR/CILE與不同濃度的目標(biāo)ssDNA序列之間的雜交反應(yīng)，研究了本發(fā)明中電化學(xué)DNA生物傳感器的靈敏度。圖4中可以看到，MB的還原峰電流值隨著目標(biāo)序列濃度的增大而逐漸的增大，且在1.0X 10—14?1.0X10—6 mol/L的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為A I (μΑ) = -21.71 log[C / (moI ^)1-337.90 ( γ =
0.996)，檢測(cè)限為3.3X10—15 mo I L—1。表明構(gòu)建的電化學(xué)DNA生物傳感器具有低的檢測(cè)限和較寬的檢測(cè)范圍，呈現(xiàn)出良好的靈敏度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法，其特征在于:以CILE離子液體修飾碳糊電極作為基底電極，分別將三維石墨烯和樹(shù)枝狀納米金依次地固定在電極表面，然后利用MAA與納米金之間的Au-S共價(jià)鍵形成穩(wěn)定的MAA自組裝膜修飾電極，利用縮合反應(yīng)將氨基化探針ssDNA固定到電極表面形成ssDNA修飾界面，最后采用滴涂法完成探針ssDNA與目標(biāo)ssDNA的雜交，達(dá)到對(duì)目標(biāo)ssDNA特異性識(shí)別檢測(cè)的目的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法，修飾電極的制備方法其特征在于包括以下步驟: (I)納米材料修飾電極的制備 利用電化學(xué)沉積方法，依次將三維石墨烯和樹(shù)枝狀納米金于沉積溶液中固定在CILE修飾電極表面，用二次蒸餾水清洗電極表面后室溫下晾干，即可制得Au/3DGR/CILE; (2 )MAA在電極表面的自組裝 將步驟I中制備的修飾電極浸泡在MAA溶液中，室溫條件下避光自組裝24小時(shí)，取出后用二次蒸餾水沖洗，記為MAA/Au/3DGR/CILE ； (3)DNA探針的固定及與目標(biāo)ssDNA序列的雜交 將步驟2中處理后的電極繼續(xù)浸泡在電極活化液中，活化30分鐘后取出分別用5%十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液和二次蒸餾水沖洗，然后在電極表面均勻滴涂10 uL探針ssDNA儲(chǔ)備液，自然晾干后分別用5% SDS溶液和二次蒸餾水沖洗，隨后將10 uL含有目標(biāo)ssDNA序列的TE緩沖溶液直接滴涂在ssDNA/MAA/Au/3DGR/CILE表面，室溫下雜交反應(yīng)30分鐘后分別用5%SDS溶液和二次蒸餾水沖洗，即完成分子雜交反應(yīng)，得到dsDNA/MAA/Au/3DGR/CILE。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中三維石墨烯和樹(shù)枝狀納米金的沉積溶液分別為3.0 mg/L氧化石墨稀與1.0 mg/L高氯酸鋰的混合溶液和5.0 mmol/L HA11CI4與0.5 mol/LKNO3混合溶液，沉積電位和時(shí)間分別為-1.3 V, 50 s和-0.4 V, 300 S。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中MAA的濃度為1 mmo 1/L。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于三維石墨烯-樹(shù)枝狀納米金的電化學(xué)DNA生物傳感器及制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中電極活化液為含有5.0 mmol/L乙基_(3_二甲基氨丙基)碳二胺鹽酸鹽(EDC)和8.0 mmo/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液(PBS) ;TE緩沖溶液是由三羥甲基氨基甲烷(Tris)和乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)配制而成;探針ssDNA儲(chǔ)備液為含有1.0X 10—6 mol/L的氨基化探針ssDNA序列的pH 8.0的TE緩沖溶液。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105907844SQ201610215433
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月8日
【發(fā)明人】孫偉, 閆麗君, 文作瑞, 牛學(xué)良, 沈青鳳
【申請(qǐng)人】海南師范大學(xué)