一種用于動(dòng)脈血栓的分子標(biāo)記物和試劑及其應(yīng)用
【專利摘要】一種用于動(dòng)脈血栓的分子標(biāo)記物和試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于動(dòng)脈血栓診斷的分子標(biāo)志物，尤其涉及血液中的分子標(biāo)志物Atf3基因及Atf3基因表達(dá)產(chǎn)物在制備動(dòng)脈血栓試劑中的應(yīng)用，以及用于診斷動(dòng)脈血栓的試劑。所述分子標(biāo)記物為激活轉(zhuǎn)錄因子Atf3基因和/或Atf3基因的表達(dá)產(chǎn)物。所述試劑包括激活轉(zhuǎn)錄因子Atf3基因和/或Atf3基因的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了Atf3基因表達(dá)與動(dòng)脈血栓的相關(guān)性，通過(guò)檢測(cè)受試者中Atf3基因的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有動(dòng)脈血栓癥、或者判斷受試者是否存在患有動(dòng)脈血栓癥的風(fēng)險(xiǎn)，從而將其應(yīng)用在制備診斷動(dòng)脈血栓的試劑中。
【專利說(shuō)明】
一種用于動(dòng)脈血栓的分子標(biāo)記物和試劑及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于動(dòng)脈血栓診斷的分子標(biāo)志物， 尤其涉及一種用于動(dòng)脈血栓診斷的分子標(biāo)志物激活轉(zhuǎn)錄因子3 ( a c t i V a t i n g transcription factor 3，Atf3)基因及Atf3基因表達(dá)產(chǎn)物，在制備動(dòng)脈血栓試劑中的應(yīng) 用，以及用于診斷動(dòng)脈血栓的試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)脈血栓大多是在動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上形成的。由于動(dòng)脈中血流速度高，所以 即使凝血過(guò)程被激活，在局部也不能積蓄足夠的凝血酶，只有在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破潰、內(nèi) 皮細(xì)胞受到損傷時(shí)才會(huì)使血小板黏附、聚集，造成管腔狹窄，使得局部積蓄有效濃度的凝血 酶。凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白而形成血栓。動(dòng)脈粥樣硬化除了與一些先天性因 素相關(guān)外，大多與飲食生活習(xí)慣有關(guān)。飲食結(jié)構(gòu)不合理，大量攝入高脂肪、高糖食物會(huì)增加 患病幾率。另外，吸煙、酗酒、缺乏運(yùn)動(dòng)也是動(dòng)脈血栓形成的重要因素。
[0003] 血管源性動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈硬化時(shí)動(dòng)脈硬化粥樣物質(zhì)形成的栓塞。大的栓塞可來(lái)源于 大的動(dòng)脈粥樣物質(zhì)、血栓和膽因醇結(jié)晶的混合物，脫落到動(dòng)脈循環(huán)。小的栓塞由于膽因醇結(jié) 晶的釋放或由于潰瘍性動(dòng)脈硬化斑點(diǎn)脫落引起。許多報(bào)道說(shuō)明周圍動(dòng)脈栓塞最常病因是心 源性。栓塞來(lái)自心臟病者占94 %，其中77 %伴有心房顫動(dòng)。動(dòng)脈硬化性的冠狀動(dòng)脈心臟病， 包括心肌梗塞、房顫、充血性心力衰竭和室壁動(dòng)脈瘤約占60 %，風(fēng)濕性心臟病占20%。風(fēng)濕 性心臟病和冠狀動(dòng)脈性心臟病，二者都有左心內(nèi)的血栓形成?；疾∪巳褐饕獮橹欣夏耆?高 血壓、高血脂、高(血液)粘度、高煙癮的人;冠心病、發(fā)作心梗的人、房顫的人、動(dòng)脈粥樣硬化 和腹主動(dòng)脈瘤的人是高發(fā)動(dòng)脈栓塞人群。
[0004] 為了提高動(dòng)脈血栓的治療有效率，降低患者和國(guó)家的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，尋找一種用于動(dòng) 脈血栓早期診斷的方法是亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所解決的現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題是:現(xiàn)有技術(shù)中并沒(méi)有針對(duì)動(dòng)脈血栓的快速檢測(cè) 產(chǎn)品，動(dòng)脈血栓發(fā)現(xiàn)時(shí)往往都是后期，給病人帶來(lái)極大的危害。
[0006] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明人在銳意研究之后，發(fā)現(xiàn)一種用于動(dòng)脈血栓早期診斷 的分子標(biāo)記物，即Atf3基因及其編碼的ATF3蛋白（轉(zhuǎn)錄激活因子，Activating transcription factor 3)，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈血栓患者中Atf3基因的表達(dá)水平明顯增高。 相比傳統(tǒng)的動(dòng)脈血栓的診斷方法，使用基因標(biāo)志物來(lái)診斷動(dòng)脈血栓具有及時(shí)性、特異性、靈 敏性，從而使患者在疾病早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)大小采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措 施。
[0007] 具體而言，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：
[0008] -方面，本發(fā)明提供了一種用于動(dòng)脈血栓的分子標(biāo)記物，所述分子標(biāo)記物為激活 轉(zhuǎn)錄因子Atf3基因和/或Atf3基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0009] 優(yōu)選的，所述Aft3基因的表達(dá)產(chǎn)物包括Atf3mRNA和/或激活轉(zhuǎn)錄因子ATF3蛋白。 [0010] 優(yōu)選的，所述Atf3基因的序列包括以下任意一種DNA分子：
[0011] (1):序列SEQ ID N0 · 1 所不的DNA序列；
[0012] (2):與序列SEQ ID NO. 1雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0013] (3):與（1)或（2)限定的DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA分子。
[0014] 更優(yōu)選的，所述Atf3基因的序列與（1)或（2)限定的DNA序列具有具有90%以上同 源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0015] 優(yōu)選的，所述ATF3蛋白包括以下任意一種蛋白質(zhì)分子：
[0016] (1):序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0017] (2):序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加，且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所 示的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)；
[0018] (3):與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少為90%至95%的同源性，更優(yōu)選地，為96 %、97 %、98%、99 %同 源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0019] 更優(yōu)選的，第(2)種中，所述取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，進(jìn) 一步優(yōu)選為1-10個(gè)。
[0020] 更優(yōu)選的，第(3)種中，與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少為90%至95%的同 源性，進(jìn)一步優(yōu)選為96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0021] 另一方面，本發(fā)明提供了用于動(dòng)脈血栓的試劑，所述試劑包括激活轉(zhuǎn)錄因子Atf3 基因和/或Atf 3基因的表達(dá)產(chǎn)物。
[0022] 優(yōu)選的，所述試劑包括芯片、試劑盒、試紙和高通量測(cè)序用試劑。
[0023] 優(yōu)選的，所述試劑包括用于序列SEQ ID NO. 1擴(kuò)增的引物序列SEQ ID N0.3和SEQ ID NO .4所示。
[0024] 優(yōu)選的，所述試劑通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量 測(cè)序平臺(tái)制得。
[0025] 優(yōu)選的，所述試劑的作用對(duì)象包括血液、組織液、尿液、唾液或脊髓液。
[0026] 優(yōu)選的，所述Atf3基因的序列包括以下任意一種DNA分子：
[0027] (1):序列SEQ ID N0 · 1 所不的DNA序列；
[0028] (2):與序列SEQ ID NO. 1雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0029] (3):與（1)或（2)限定的DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的 DNA分子。
[0030] 更優(yōu)選的，所述Atf3基因的序列與（1)或（2)限定的DNA序列具有具有90%以上同 源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0031] 優(yōu)選的，所述ATF3蛋白包括以下任意一種蛋白質(zhì)分子：
[0032] (1):序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0033] (2):序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加，且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所 示的氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)；
[0034] (3):與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少為90%至95%的同源性，更優(yōu)選地，為96 %、97 %、98%、99 %同 源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0035] 更優(yōu)選的，第(2)種中，所述取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，進(jìn) 一步優(yōu)選為1-10個(gè)。
[0036] 更優(yōu)選的，第(3)種中，與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少為90%至95%的同 源性，進(jìn)一步優(yōu)選為96 %、97 %、98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。第三方面，本 發(fā)明提供了以上任一項(xiàng)所述的分子標(biāo)記物在制備診斷和/或治療動(dòng)脈血栓的試劑中的應(yīng) 用。
[0037]本發(fā)明人經(jīng)過(guò)銳意研究發(fā)現(xiàn)了 Atf3基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物作為動(dòng)脈血栓診斷的分 子標(biāo)記物，并將其應(yīng)用在制備診斷動(dòng)脈血栓的試劑或工具中。
[0038] 進(jìn)一步，上面所提到的試劑或工具包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原 位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)Atf3基因表達(dá)水平以診斷動(dòng)脈血栓的試劑。
[0039]其中，用RT-PCR獲得的試劑至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增Atf3基因的引物；用實(shí)時(shí)定量 PCR的方法獲得的試劑至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增Atf 3基因的引物；
[0040] 用免疫檢測(cè)方法獲得的試劑包括與Atf3蛋白特異結(jié)合的抗體;用原位雜交方法獲 得的試劑包括:與Atf 3基因的核酸序列雜交的探針;用芯片方法獲得的試劑包括:蛋白芯片 和基因芯片。其中，蛋白芯片包括與Atf3蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與Atf3基因 的核酸序列雜交的探針。
[0041] 隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便利的工 作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常患者的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。 因此，在高通量測(cè)序中獲知Atf3基因的異常與動(dòng)脈血栓相關(guān)也屬于Atf3基因的用途，同樣 在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0042] 本發(fā)明中的芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固 定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)Atf3基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì) Atf3基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的Atf3蛋 白的特異性抗體;所述基因芯片可用于檢測(cè)包括Atf3基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與動(dòng)脈血 栓相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與動(dòng)脈血栓的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可以大大提 高動(dòng)脈血栓診斷的準(zhǔn)確率。
[0043] 其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)Atf3基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括Atf3蛋白的特 異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方 法檢測(cè)Atf3基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對(duì)Atf3基因的引物 和/或探針。根據(jù)Atf3基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)Atf3基因表達(dá)水平 的引物和探針。
[0044] 所述高通量測(cè)序試劑為檢測(cè)Atf3基因表達(dá)水平的試劑。
[0045] 所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測(cè) Atf 3基因的轉(zhuǎn)錄水平。
[0046] 與Atf3基因的核苷酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要能完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié) 合，任何長(zhǎng)度都可以。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探 針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的 長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效 率。
[0047] 進(jìn)一步，所述Atf3蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述Atf3蛋白 的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾。只要所述片段能夠保留與 Atf3蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且 本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗體。
[0048] 用于診斷動(dòng)脈血栓的Atf3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源包括但不限于血液、組織液、 尿液、唾液、脊髓液等可以獲得基因組DNA的體液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，用于診斷動(dòng) 脈血栓的Atf 3基因及其表達(dá)產(chǎn)物的來(lái)源是血液。
[0049] 本發(fā)明所取得的有益效果為：
[0050] (1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了Atf3基因表達(dá)與動(dòng)脈血栓的相關(guān)性，通過(guò)檢測(cè)受試者中 Atf3基因的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有動(dòng)脈血栓癥、或者判斷受試者是否存在患有動(dòng) 脈血栓癥的風(fēng)險(xiǎn)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)生給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0051] (2)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物Atf3基因及其表達(dá)產(chǎn)物，利用本發(fā)明的分 子標(biāo)記物制備用于檢測(cè)動(dòng)脈血栓的試劑，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，基因診斷更及時(shí)、更特異、 更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)動(dòng)脈血栓的早期診斷，從而降低動(dòng)脈血栓病癥的死亡率。
[0052]下面結(jié)合附圖和各個(gè)【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明及其有益技術(shù)效果進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0053]圖1為利用QPCR檢測(cè)Atf3基因 （SEQ ID N0.1)在動(dòng)脈血栓患者和正常人中的表達(dá) 差異圖。
[0054] 圖2為利用Western Blot檢測(cè)Atf3蛋白（SEQ ID N0.2)在動(dòng)脈血栓患者和正常人 中的表達(dá)差異圖。
[0055] 圖3顯示利用Western Blot檢測(cè)Atf3蛋白（SEQ ID N0.2)在動(dòng)脈血栓患者和正常 人中的表達(dá)差異圖。
【具體實(shí)施方式】
[0056] 如上所述，本發(fā)明提供了一種用于動(dòng)脈血栓的分子標(biāo)記物Atf3基因和/或Atf3基 因表達(dá)產(chǎn)物，以及它們?cè)谥苽湓\斷或治療動(dòng)脈血栓的試劑中的應(yīng)用和診斷或治療動(dòng)脈血栓 的試劑。
[0057] 其中，在一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于動(dòng)脈血栓的試劑，所述試劑 包括DNA序列SEQ ID N0.1。
[0058] 在另一種優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于動(dòng)脈血栓的試劑，所述試劑包 括蛋白質(zhì)序列SEQ ID N0.2。
[0059] Atf3基因序列SEQ ID Ν0· 1為：
[0060]
[0062] Atf3蛋白序列SEQ ID N0.2序列：
[0063] MMLQHPGQVSASEVSASAIVPCLSPPGSLVFEDFANLTPFVKEELRFAIQNKHLCHRMSSALESVTVSD RPLGVSITKAEVAPEEDERKKRRRERNKIAAAKCRNKKKEKTECLQKESEKLESVNAELKAQIEELKNEKQHLIYML NLHRPTCIVRAQNGRTPEDERNLFIQQIKEGTLQS
[0064] 需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中的Atf3基因?yàn)閺V義上的Atf3基因，包括狹義上的Atf3基 因以及任何與狹義上的Atf3基因功能等同的多核苷酸片段。而狹義上的Atf3基因包括與 DNA序列SEQ ID N0.1具有70%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白的DNA序列。
[0065] 在本發(fā)明的上下文中，Atf 3基因表達(dá)產(chǎn)物包括Atf 3mRNA和/或ATF3蛋白以及ATF3 蛋白的部分肽段。而本發(fā)明中的Atf3蛋白的部分肽段是指ATF3蛋白中與動(dòng)脈血栓相關(guān)的功 能域。
[0066] 本發(fā)明中的Atf3蛋白是指廣義上的Atf3蛋白，包括序列SEQIDN0.2本身，以及由 序列SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加，且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列 衍生的蛋白質(zhì);優(yōu)選地，取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，更優(yōu)選地是1-10個(gè)；以及與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，優(yōu)選地，與SEQ ID N0.2 所示的氨基酸序列至少為90 %至95 %的同源性，更優(yōu)選地，為96 %、97 %、98 %、99 %同源性 的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0067]而本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，通常蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋 白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠得知的是，改變蛋白質(zhì)中的單個(gè)氨基酸或者改變蛋白質(zhì) 中一定比例(小百分比）的氨基酸或者對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行個(gè)別氨基酸的添加、缺失、插入、替換等 保守性修飾，只要改變不會(huì)引起蛋白質(zhì)主要功能的改變，仍然是具有相似功能的蛋白質(zhì)，就 包含在本發(fā)明的廣義的Atf3蛋白的保護(hù)范圍之內(nèi)。其中，通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基 酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是ATF3蛋白的融合蛋白。對(duì)于與Atf3蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì) 沒(méi)有限制，只要所得的融合蛋白保留Atf3蛋白的生物學(xué)活性即可。
[0068]在本發(fā)明的上下文中，診斷動(dòng)脈血栓既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有動(dòng)脈血栓、 也包括判斷受試者是否存在患有動(dòng)脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)。
[0069] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。其中，實(shí)施例中未注明條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)（New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。
[0070] 其中，本發(fā)明實(shí)施例中所用試劑和試劑盒的型號(hào)及廠商如下：
[0071] 血液RNA提取試劑盒，購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；
[0072] 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)于：日本Toyobo公司，貨號(hào):FSQ_101
[0073] QPCR試劑盒，購(gòu)于：美國(guó)Applied Biosystems公司，貨號(hào)：4472908
[0074] 蛋白提取試劑盒，購(gòu)于:美國(guó)Sigma公司，貨號(hào):PR0TT0T-1KT
[0075] BCA蛋白測(cè)定試劑盒，購(gòu)于:美國(guó)Sigma公司，貨號(hào):BCA1-1KT
[0076] 實(shí)施例一
[0077] QPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證動(dòng)脈血栓患者和正常人中差異表達(dá)的基因
[0078] 1、研究對(duì)象：
[0079] 隨機(jī)選擇已經(jīng)進(jìn)行影像學(xué)檢測(cè)確診為動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈血栓的患者25例，正常人對(duì) 照組20例，年齡50-68歲。問(wèn)卷方式調(diào)查受試者生活方式和健康狀況。
[0080] 2、血液總RNA提取
[0081 ] 使用百泰克血液RNA提取試劑盒進(jìn)行血液總RNA的提取
[0082] (1)取全血250μ1 (或0 · 25g)至RNase-Free過(guò)濾柱中，13000rpm離心2min，收集下 液，加入0.75ml裂解液RLS。
[0083] (2)將勻漿樣品劇烈震蕩混勾，在15-30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分 解。
[0084] (3)可選步驟:4°C條件下12000rpm離心10分鐘，小心取上清轉(zhuǎn)入一個(gè)新的無(wú) RNA酶 的離心管中。
[0085] (4)每lml RLS加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈震蕩15秒并將其在室溫下孵育3 分鐘。
[0086] (5)于4°C 12000rpm離心10分鐘，樣品會(huì)分成三層:下層有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色 水相，RNA存在于水相中。水相層的容量大約為所加 RLS體積的60%，把水相轉(zhuǎn)移到新管中， 進(jìn)行下一步操作。
[0087] (6)加入1倍體積70%乙醇，顛倒混勻（可能會(huì)有沉淀），得到的溶液和可能沉淀一 起轉(zhuǎn)入吸附柱RA中（吸附柱套在收集管內(nèi)）。
[0088] (7) lOOOOrpm離心45秒，棄掉廢液，將吸附柱重新套回收集管。
[0089] (8)加500μ1去蛋白液RE，12000rpm離心45秒，棄掉廢液。
[0090] (9)加入700μ1漂洗液RW，12000rpm離心60秒，棄掉廢液。
[0091] (10)加入500μ1漂洗液RW，12000rpm離心60秒，棄掉廢液。
[0092] (11)將吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂 洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。
[0093] (12)取出吸附柱RA，放入一個(gè)無(wú) RNA酶的離心管中，根據(jù)預(yù)期RNA產(chǎn)量在吸附膜的 中間部位加50-80μ1無(wú) RNA酶的超純水，室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集洗脫液。
[0094] 3、RNA樣品的質(zhì)量(eppendorf分光光度計(jì)）
[0095] Eppendorf分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品，RNA-seq測(cè)序的樣品要求：0D260/0D280為 1·8_2·2 〇
[0096] 4、逆轉(zhuǎn)錄
[0097] 用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lyg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用25μ1反應(yīng)體系，每個(gè)樣品 取lyg總RNA作為模板RNA，在PCR管中按照表1所示，分別加入如下組分，然后在42 °C孵育lh， 72 °C 1 Omin，短暫離心。
[0098] 表1 PCR逆轉(zhuǎn)錄體系
[0099]
[0100] 5、QPCR
[0101] 采用25μ1反應(yīng)體系，按照表2所示的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系和表3所示的引物序列進(jìn) 行0?〇財(cái)廣增，擴(kuò)增程序?yàn)?95 ￡€5!1^11，（95°(：158,6〇1€6〇8)42個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行 管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可靠性。注意各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行。
[0102] 表2 SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系 「01031
[0104] 表3用于Atf3基因和GAPDH基因擴(kuò)增的引物序列
[0105]
[0106]
[0107] 以SYBR Green(購(gòu)于life technologies)作為焚光標(biāo)記物，在Light Cycler焚光 實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線和電泳確定目的條帶，CT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0108] 6、結(jié)果
[0109] 結(jié)果如圖1所示。從圖1的結(jié)果可以看出，與正常人相比，動(dòng)脈血栓患者血液中Atf3 基因的mRNA水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。
[0110] 實(shí)施例二
[0111] Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證動(dòng)脈血栓患者與正常人Atf3蛋白表達(dá)差異
[0112] 1、研究對(duì)象：
[0113] 隨機(jī)選擇已經(jīng)進(jìn)行影像學(xué)檢測(cè)確診為動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈血栓的患者9例，正常人對(duì)照 組7例，年齡50-68歲。問(wèn)卷方式調(diào)查受試者生活方式和健康狀況。
[0114] 2、提取蛋白
[0115] (1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，加入裂解液和蛋白酶抑制劑（100:1)(美國(guó)Invitrogen 公司），吹勻，冰上放置30min，期間渦旋4次每次10秒。
[0116] (2)4°C 12000rpm離心10min。
[0117] (3)取上清液，_80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0118] 3、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
[0119] 按BCA蛋白測(cè)定試劑盒(美國(guó)Sigma公司)操作
[0120] (1)取4支1.5ml EP管，標(biāo)記1、2、3、空白，各加入含蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂 解液25μ1，再取2mgAil標(biāo)準(zhǔn)液(BSA)25yl，加入1號(hào)管，混勻后取出25μ1加入2號(hào)管，混勻后取 出25μ1加入3號(hào)管，混勻后取出25μ1棄去，完成稀釋過(guò)程。
[0121] (2)取25μ1樣品蛋白加入1.5ml ΕΡ管中
[0122] (3)取試劑A=(標(biāo)準(zhǔn)管數(shù)+空白管數(shù)+樣品管數(shù))200μ1，Β=(標(biāo)準(zhǔn)管數(shù)+空白管數(shù)+ 樣品管數(shù))4μ1，將兩試劑混勻，配成工作液。
[0123] (4)向1、2、3、空白及樣品管中加入200μ1工作液，混勻后置于37°C孵育30min，之后 冷卻至室溫。
[0124] (5)采用紫外分光光度法，以A = 562nm波長(zhǎng)比色，用空白管液調(diào)零，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)， 計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)濃度。
[0125] (6)將準(zhǔn)備好的樣品加入適量的5 X loading buffer，99°C蛋白變性5-1 Omin，獲得 蛋白樣品，準(zhǔn)備SDS-PAGE電泳。
[0126] 4、SDS-PAGE 電泳
[0127] (1)準(zhǔn)備
[0128] 將玻璃板徹底清洗干凈，固定好之后加水檢漏。
[0129] (2)配膠
[0130]分離膠加膠達(dá)2/3再加水壓膠20_左右，凝膠后傾去水，加濃縮膠至滿，裝梳子。
[0131] (3)待膠凝固后，拔出梳子在電泳槽中加500μ1 1 Xrunning buffer上樣。
[0132] (4)蓋上蓋子，接通電源，濃縮膠用80V，45min，分離膠用110V，60min，當(dāng)溴酚藍(lán)剛 好跑出膠或者目的蛋白跑至下膠中央時(shí)可終止電泳，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜。
[0133] 5、轉(zhuǎn)膜
[0134] (1)準(zhǔn)備三個(gè)平皿，分別盛甲醇、超純水、轉(zhuǎn)膜緩沖液同時(shí)裁剪兩張 PVDF膜，四張3M 濾紙，與膠大小一致即可。PVDF膜要大于濾紙，提前30min準(zhǔn)備，每個(gè)皿中浸泡lOmin。
[0135] (2)撬掉玻璃板，裁去上膠，取下膠，將下膠與3M濾紙?jiān)谵D(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡lOmin。 同時(shí)將膜依次在甲醇、純水、轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡lOmin。從膠上切去需要的部分，記錄好加樣 順序，同時(shí)標(biāo)記好PVDF膜的方向。
[0136] (3)用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕電轉(zhuǎn)儀，從下到上依次為濾紙、膜、膠、濾紙，疊方式要不斷 攆去氣泡，務(wù)使兩邊濾紙相互接觸，以防發(fā)生短路。
[0137] (4)蓋上金屬蓋，接通電源，轉(zhuǎn)膜電壓25V，轉(zhuǎn)移45min。
[0138] 6、封閉
[0139] (1)轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗1-2分 鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。
[0140] (2)用微型臺(tái)式真空栗吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫 封閉60分鐘。
[0141] 7、一抗孵育
[0142] (1)參考一抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用Western-抗稀釋液稀釋一抗。
[0143] (2)用微型臺(tái)式真空栗吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4°C在側(cè)擺搖 床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以在4°C緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜。
[0144] (3)回收一抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗 滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。
[0145] 8、二抗孵育
[0146] (1)參考二抗的說(shuō)明書(shū)，按照適當(dāng)比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的二抗。
[0147] (2)用微型臺(tái)式真空栗吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4°C在側(cè)擺搖 床上緩慢搖動(dòng)孵育一小時(shí)。
[0148] (3)回收二抗。加入Western洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動(dòng)洗滌5-10分鐘。吸盡洗 滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。
[0149] 9、蛋白檢測(cè)
[0150] 洗片時(shí)可以使用X光片自動(dòng)洗片機(jī)。如果沒(méi)有自動(dòng)洗片機(jī)，可以用顯影定影試劑盒 自行配制顯影液和定影液進(jìn)行手工洗片。
[0151] 1〇、結(jié)果
[0152] Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示。其中，從圖2和圖3的結(jié)果可以看出，與正 常人相比，動(dòng)脈血栓患者的血液中Atf3蛋白的水平明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈 0.05)〇
[0153] 上述實(shí)驗(yàn)例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和 修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0154] SEQUENCE LISTING <110>天津脈絡(luò)生物科支有限公司 <120 -種用于動(dòng)脈血栓的分子標(biāo)記物和試劑及其應(yīng)用 <13. OICNI60011 < 160 > 6 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 543 <212> DNA <213> .人屬（Homo sapiens ) <40Q> 1 atgatgcttc aacacccagg ccaggtctct gcctcggaag tgagtgcttc tgccatcgtc 60 ecGtgcctgt cceetcctgg gtcaetggtg tttgaggatt ttgctaaGct gaegGCCttt 120 gtcaaggaag agctgaggtt tgccatccag aacaagcacc tctgccaccg gatgtcctct 180 gcgctggaat cagtcactgt cagcgacaga cccctcgggg tgtccatcac aaaagccgag 240 gtagcccctg aagaagatga aaggaaaaag aggcgacgag aaagaaaraa gattgcagct 300 gcaaagtgcc gaaacaagaa gaaggagaag acggagtgcc tgcagaaaga gtcggagaag 360
[0155] ctggaaagtg tgaatgctga actgaaggct cagattgagg agctcaagaa cgagaagcag 420 catttgatat acatgeteaa ccttcatcgg cccacgtgta ttglGCgggc tcagaatggg 480 aggactccag aagatgagag aaacctcttt atccaacaga taaaagaagg aacattgcag 540 age 54.3 <210> 2 <211> 181 <212> PRT <213> 人屬（Home) sapiens ) <400> 2 Met Met Leu Gin His Pro Gly Gin Val Ser Ala Ser Glu Val Ser Ala 1 5 10 15 Ser Ala lie Val Pro Cys Leu Ser Pro Pro Gly Ser Leu Val Phe Glu 20 2.5 30 Asp Phe Ala Asn Leu Thr Pro Phe Val Lys Glu Glu Leu Arg PLi? Ala 35 40 45 He Gin Asn Lys His Leu Cys His Arg Met Ser Ser Ala Leu Glu Ser 50 55 60 Val 'Thr Val Ser Asp Arg Pro Leu Gly Val Ser lie Thr Lys Ala Glu 65 70 75 80 Val Ala Pro Glu G!u Asp Glu Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Arg Asn 85 90 95 Lys lie Ala Ala Ala Lys Cys Arg Asn Lys Lys Lys Glu Lys Thr Glu 100 105 110
[0156] Cys Leu Gin Lys Giu Ser Glu Lys Leu Giu Ser Va! Asn Ala Glu Leu 115 120 12、 Lys Ala Gin lie Glu Glu Leu Lys Asn GIli Lys Gin His Leu lie 丁yr 130 135 140 Met Leu A§n ,Leu .Hi:$ Arg Pro 丁hr Cy s. lie Val Afg Ala Asn _Gly 145 150 155 160 Arg Thr Pro Glu Asp Glu Arg Asn Leu Fhe lie Gin Gin lie Lys Glu 165 170 175 Gly Thr Leu Gin Ser 180 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉
[0157] <400 3 argatgcttc aacacccagg c 21 <2i0> 4 <21!> 30 <212> DNA <213>人工序列： <220> <223> <400> 4 gctUgcaal gUt^ttctt ttatctgttg 30 <210〉 5 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> <400> 5 tttaactctg glaaagtgga tat 23
[0158] 。 <210> 6 <21]> 20 <212> DNA <2丨3>人工序列 <220> <223> <400> 6 ggtggaatea tattggaaca 20
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于動(dòng)脈血栓的分子標(biāo)記物，其特征在于，所述分子標(biāo)記物為激活轉(zhuǎn)錄因子 Atf3基因和/或Atf 3基因的表達(dá)產(chǎn)物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記物，其特征在于，所述Aft3基因的表達(dá)產(chǎn)物包括Atf 3 mRNA和/或激活轉(zhuǎn)錄因子ATF3蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分子標(biāo)記物，其特征在于，所述Atf3基因的序列包括以下 任意一種DNA分子： (1) :序列SEQ ID NO. 1所不的DNA序列； (2) :與序列SEQ ID NO.1雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列； ⑶：與⑴或⑵限定的DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分 子;優(yōu)選地，具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的分子標(biāo)記物，其特征在于，所述ATF3蛋白包括以下任意一 種蛋白質(zhì)分子： (1) :序列SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (2) :序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加，且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的 氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)；優(yōu)選地，取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，更 優(yōu)選地是1 _1〇個(gè)； (3) :與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列至少為90 %至95 %的同源性，更優(yōu)選地，為96 %、97 %、98 %、99 %同源性 的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。5. -種用于動(dòng)脈血栓的試劑，其特征在于，所述試劑包括激活轉(zhuǎn)錄因子Atf 3基因和/或 Atf3基因的表達(dá)產(chǎn)物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑，其特征在于，所述試劑包括芯片、試劑盒、試紙和高通量 測(cè)序用試劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑，其特征在于，所述試劑包括用于序列SEQ ID NO. 1擴(kuò) 增的引物序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)所述的試劑，其特征在于，所述試劑通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定 量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)制得。9. 根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)所述的試劑，其特征在于，所述試劑的作用對(duì)象包括血 液、組織液、尿液、唾液或脊髓液。10. 根據(jù)權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)所述的試劑，其特征在于，所述Atf3基因的序列包括以 下任意一種DNA分子： (1) :序列SEQ ID NO. 1所不的DNA序列； (2) :與序列SEQ ID NO.1雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列； ⑶：與⑴或⑵限定的DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分 子;優(yōu)選地，具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA分子。11. 根據(jù)權(quán)利要求5-10中任一項(xiàng)所述的試劑，其特征在于，所述ATF3蛋白包括以下任意 一種蛋白質(zhì)分子： (1):序列SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (2) :序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加，且與SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的 氨基酸序列衍生的蛋白質(zhì)；優(yōu)選地，取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，更 優(yōu)選地是1 _1〇個(gè)； (3) :與SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，優(yōu)選地，與SEQ ID NO. 2 所示的氨基酸序列至少為90 %至95 %的同源性，更優(yōu)選地，為96 %、97 %、98 %、99 %同源性 的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。12.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的分子標(biāo)記物在制備診斷和/或治療動(dòng)脈血栓的試劑中 的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105907857SQ201610287125
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】劉鵬飛, 王菁蕊, 韓雪, 姬曉兵
【申請(qǐng)人】天津脈絡(luò)生物科技有限公司