用于高效且特異性靶向包含高度重復(fù)基序的dna序列的稀有切割核酸內(nèi)切酶的設(shè)計(jì)的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及遺傳編輯工具及遺傳工程方法的領(lǐng)域。本發(fā)明涉及被設(shè)計(jì)來縮小染色體中高度重復(fù)基序的稀有切割核酸內(nèi)切酶的工程化，所述高度重復(fù)基序是某些遺傳性疾病的病因，特別是所謂的“三聯(lián)體重復(fù)疾病”，諸如亨廷頓病。本發(fā)明包括用于縮小重復(fù)基序的方法，用于縮小經(jīng)歷重復(fù)病癥的基因中重復(fù)基序的稀有切割核酸內(nèi)切酶，編碼所述稀有切割核酸內(nèi)切酶的多核苷酸和載體以及所得到的藥物組合物?！緦＠f明】用于高效且特異性靶向包含高度重復(fù)基序的DNA序列的稀有切割核酸內(nèi)切酶的設(shè)計(jì)發(fā)明領(lǐng)域[0001]本發(fā)明的發(fā)明領(lǐng)域?yàn)檫z傳編輯工具及其用途。本發(fā)明涉及被設(shè)計(jì)來縮小染色體中的高度重復(fù)基序(motive)的稀有切割核酸內(nèi)切酶的工程化，所述高度重復(fù)基序是某些遺傳性疾病的病因，特別是所謂的"三聯(lián)體重復(fù)疾病"，諸如亨廷頓病。本發(fā)明包括用于縮小重復(fù)基序的方法、用于縮小經(jīng)歷重復(fù)病癥的基因中重復(fù)基序的稀有切割核酸內(nèi)切酶、編碼其的多核苷酸和載體以及所得的藥物組合物。[0002]發(fā)明背景[0003]自20世紀(jì)90年代初以來，不穩(wěn)定的核苷酸(微衛(wèi)星）重復(fù)(repeat)(特別是三核苷酸重復(fù))的擴(kuò)展被鑒定為是某些人類疾病內(nèi)在的新型突變機(jī)制。多年來，幾種另外的發(fā)育和神經(jīng)肌肉病癥被鑒定為由三核苷酸重復(fù)以及不穩(wěn)定的四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸和更長(zhǎng)重復(fù)的插入或復(fù)制((1卯1;[031:;[011)引起的(1;^1^112007)。多核苷酸重復(fù)的此種插入或復(fù)制可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的功能損失、RNA毒性的功能獲得或蛋白質(zhì)毒性的功能獲得，從而導(dǎo)致病癥。此類病癥的實(shí)例包括亨廷頓病、遺傳性共濟(jì)失調(diào)、脆性X綜合征、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良（常見的遺傳性肌營(yíng)養(yǎng)不良）、一組顯性遺傳性共濟(jì)失調(diào)和最近發(fā)現(xiàn)C90RF72基因中不穩(wěn)定六核苷酸重復(fù)為額顳葉癡呆/肌萎縮側(cè)索硬化癥的常見原因（Dejesus-Hernandez，Mackenzie等2011;Renton，Majounie等2011)(綜述參見（Nelson，0rr等2013))。[0004]針對(duì)大多數(shù)重復(fù)擴(kuò)展型病癥的治療選擇極其有限。設(shè)想用于各種神經(jīng)退行性疾病的最吸引人的治療策略之一是基因療法。事實(shí)上，已經(jīng)開發(fā)了關(guān)閉重復(fù)擴(kuò)展的表達(dá)的幾種策略。具體地，使用RNA干擾技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)沉默突變基因已被實(shí)現(xiàn)用于阻止蛋白質(zhì)或RNA的毒性功能（如叫，1^11等2005;]\^(311丨(1&，01^(1&等2006;0丨？丨81丨&，3611&48七6￥68等2007)。然而，RNA干擾的設(shè)計(jì)基本上不允許區(qū)分正常與重復(fù)擴(kuò)展序列，并且誘導(dǎo)突變基因和野生型基因的同時(shí)下降（Caplen，Taylor等2002)。然而，亨廷頓蛋白廣泛表達(dá)并且是神經(jīng)元功能和在腦中的存活所需的（Duyao，Auerbach等1995;Dragatsis，Levine等2000)。因此，特異性減少突變基因的表達(dá)而使野生型蛋白質(zhì)的表達(dá)不受影響是重要的。[0005]最近，鋅指蛋白被設(shè)計(jì)來結(jié)合亨廷頓基因的多-三核苷酸重復(fù)，所述基因造成亨廷頓病。鋅指與適當(dāng)?shù)慕宇^拼接(concatenate)成長(zhǎng)鏈以獲得用于相較于較短的重復(fù)優(yōu)先抑制重復(fù)擴(kuò)展的亨廷頓基因的最佳構(gòu)型。該策略允許相較于野生型基因，更高效地抑制突變基因的表達(dá)。然而，一直不清楚抑制是否會(huì)足以降低基因療法的蛋白質(zhì)水平（Garriga-〇已11111:，厶81181:;[11-?&￥011等，國(guó)際申請(qǐng)：￥02013/130824)。[0006]先前的研究（Richard，Dujon等1999)已經(jīng)表明，誘導(dǎo)重復(fù)序列內(nèi)的切割事件與三核苷酸重復(fù)陣列的縮小相關(guān)，這可通過兩個(gè)不同的機(jī)制來解釋：（1)斷裂的兩個(gè)末端可用于侵入模板，但它們可在模板內(nèi)的任意位置侵入，因?yàn)樗鼈兙哂信c模板同源的重復(fù)序列；或(2)只有一個(gè)末端侵入模板并且新合成的鏈被從它的模板取代，但可與含有重復(fù)的另一個(gè)末端退火(Richard，Dujon等1999)。然而，由于基因組內(nèi)存在高頻率的重復(fù)序列，因此被設(shè)計(jì)來特異性針對(duì)所述重復(fù)序列的工程化DNA結(jié)合核酸酶可能在整個(gè)人基因組的幾個(gè)位置上誘導(dǎo)位點(diǎn)外誘變(〇ff-sitemutagenesis)。因此，十分希望的是僅在所需基因組位置上在重復(fù)序列中產(chǎn)生切割的能力。[0007]為了克服上述限制，本發(fā)明人已開發(fā)了通過使用DNA結(jié)合核酸酶來減少擴(kuò)展的多核苷酸重復(fù)的數(shù)目的基因治療策略，同時(shí)維持基因組的完整性和經(jīng)校正基因的功能性。該策略主要依賴于DNA結(jié)合核酸酶的設(shè)計(jì)連同特異性靶向與三聯(lián)體重復(fù)病癥相關(guān)的重復(fù)序列的基因組序列的選擇。[0008]發(fā)明概述[0009]在一般方面，本發(fā)明涉及用于縮小多核苷酸重復(fù)(優(yōu)選在經(jīng)歷重復(fù)病癥的特定基因中）的稀有切割核酸內(nèi)切酶。具體地，對(duì)稀有切割核酸內(nèi)切酶進(jìn)行工程化以特異性切割重復(fù)序列，其特征在于所述稀有切割核酸內(nèi)切酶識(shí)別包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列。本發(fā)明涉及工程化用于誘導(dǎo)特定區(qū)域中高度重復(fù)基序內(nèi)的縮小的稀有切割核酸內(nèi)切酶的方法。優(yōu)選地，所述稀有切割核酸內(nèi)切酶靶向包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的序列，使得稀有切割核酸內(nèi)切酶特異性結(jié)合所選靶序列并切割該重復(fù)序列。重復(fù)序列的切割誘導(dǎo)修復(fù)過程，進(jìn)行該修復(fù)過程以縮小特定基因內(nèi)的重復(fù)序列，從而使擴(kuò)展的重復(fù)序列減少至接近野生型構(gòu)型。優(yōu)選地，所述稀有切割核酸內(nèi)切酶為特異性切割重復(fù)序列的Cas9-指導(dǎo)RNA復(fù)合物，其特征在于該指導(dǎo)RNA與包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列雜交。優(yōu)選地，所述稀有切割核酸內(nèi)切酶是模塊化DNA結(jié)合核酸酶，其包含與核酸內(nèi)切酶的催化域融合的DNA結(jié)合域(諸如TALE、MBBBD、鋅指(ZF)域）。所述DNA結(jié)合核酸酶可作為單體或二聚體起作用。二聚體DNA結(jié)合核酸酶包含第一DNA結(jié)合域和第二DNA結(jié)合域，所述第一DNA結(jié)合域能夠與重復(fù)序列相鄰的序列結(jié)合并與核酸酶催化域融合，所述第二DNA結(jié)合域能夠結(jié)合重復(fù)序列并與核酸酶催化域融合(參見圖1)。作為二聚體起作用的所述核酸酶催化域優(yōu)選是FokI催化域。本發(fā)明的稀有切割核酸內(nèi)切酶特別適合用于通過縮小高度重復(fù)基序區(qū)域治療或預(yù)防重復(fù)疾病(諸如予廷頓?。?。[0010]附圖和表的簡(jiǎn)述：[0011]圖1:經(jīng)工程化以特異性切割重復(fù)序列的TALE核酸酶的示意圖。[0012]圖2:經(jīng)工程化以特異性切割重復(fù)序列的二聚體TALE-核酸酶的用途的示意圖。將一個(gè)TALE-核酸酶半域工程化以識(shí)別包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列，并將另一個(gè)TALE-核酸酶半域工程化以識(shí)別重復(fù)序列內(nèi)的靶序列，諸如二聚體TALE-核酸酶切割該重復(fù)序列。重復(fù)序列的切割誘導(dǎo)修復(fù)過程，諸如導(dǎo)致縮小重復(fù)的單鏈退火(SSA)過程。[0013]圖3:經(jīng)工程化以特異性切割重復(fù)序列的單體TALE-核酸酶的用途的示意圖。經(jīng)工程化以特異性切割重復(fù)序列的單體TALE-核酸酶識(shí)別包含與該重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列。重復(fù)序列的切割誘導(dǎo)修復(fù)過程，諸如導(dǎo)致縮小重復(fù)的單鏈退火(SSA)過程。[0014]圖4:經(jīng)工程化以特異性切割重復(fù)序列的Cas9_指導(dǎo)RNA復(fù)合物的用途的示意圖。該指導(dǎo)RNA經(jīng)工程化以特異性識(shí)別包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列，使得Cas9-指導(dǎo)RNA復(fù)合物切割該重復(fù)序列。重復(fù)序列的切割誘導(dǎo)修復(fù)過程，諸如導(dǎo)致縮小重復(fù)的單鏈退火(SSA)過程。[0015]表1:被兩個(gè)TALEN對(duì)靶向的序列的列表。由TALEN祀向的側(cè)接重復(fù)序列的16bp序列(省略位置T0)被加下劃線。[0016]表2:在37°C下，TALEN在如先前描述的我們的酵母SSA測(cè)定（國(guó)際PCT申請(qǐng)W02004/067736和于Epinat，A;rnould等2003;Chames，Epinat等2005;A;rnould，Chames等2006;Smith，GriZ〇t等2006中）中的活性。-代表不可檢測(cè)的活性，+表示弱活性以及++代表高活性。n.a.表示無可獲得的數(shù)據(jù)。[0017]發(fā)明描述[0018]除非本文中具體定義，否則所使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與由基因治療、生物化學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。[0019]除非另有所指，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，所述技術(shù)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中得以全面解釋。參見，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology(FrederickM.AUSUBEL,2000,ffileyandsonInc,LibraryofCongress,USA)；MolecularCloning:ALaboratoryManual，第3版（Sambrook等，2001,ColdSpringHarbor,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress);01igonucleotideSynthesis(M.J.Gait編輯，1984);Mullis等美國(guó)專利號(hào)4,683，195;NucleicAcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins編輯1984);TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higgins編輯1984);CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc·，1987);ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986)；B.Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984);系列MethodsInENZYM0L0GY(J.Abelson和M.Simon，主編，AcademicPress，Inc.，NewYork)，具體地，第154和155卷(Wu等編輯）和第185卷，〃GeneExpressionTechnology〃（D.Goeddel，編輯）；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller和M.P.Calos編輯，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker，編輯，AcademicPress,London,1987)；HandbookOfExperimentalImmunology,第I-IV卷（D.M.Weir和C.C.Blackwell，編輯，1986)和ManipulatingtheMouseEmbryo,(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，Ν·Υ·，1986)〇[0020]用于縮小多核苷酸重復(fù)的工程化稀有切割核酸內(nèi)切酶[0021]本發(fā)明涉及能夠特異性識(shí)別和切割重復(fù)序列的稀有切割核酸內(nèi)切酶。為了避免位點(diǎn)外靶向，本發(fā)明人工程化稀有切割核酸內(nèi)切酶以特異性切割重復(fù)序列，其特征在于所述稀有切割核酸內(nèi)切酶識(shí)別包含與該重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列。重復(fù)序列的裂解誘導(dǎo)進(jìn)行來縮小多核苷酸重復(fù)(優(yōu)選存在于經(jīng)歷重復(fù)病癥的基因中）的修復(fù)過程。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及工程化特異性切割重復(fù)序列的稀有切割核酸內(nèi)切酶的方法。具體地，所述方法包括以下步驟：（a)選擇包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列；（b)工程化能夠識(shí)別所述靶序列并切割該重復(fù)序列的稀有切割核酸內(nèi)切酶。[0022]根據(jù)本發(fā)明的靶序列可存在于染色體、附加體、細(xì)胞器基因組(諸如線粒體或葉綠體基因組）或遺傳物質(zhì)中，所述遺傳物質(zhì)可獨(dú)立于遺傳物質(zhì)的主體(諸如感染性病毒基因組、質(zhì)粒、附加體、轉(zhuǎn)座子)而存在。靶核酸序列可存在于基因的編碼序列內(nèi)、轉(zhuǎn)錄的非編碼序列(諸如，例如，前導(dǎo)序列、尾隨序列或內(nèi)含子）內(nèi)或編碼序列的上游或下游的非轉(zhuǎn)錄序列內(nèi)。核酸靶序列由所述靶的一條鏈的5'至3'序列界定。具體地，靶序列包含重復(fù)序列的一部分和與其相鄰的序列。[0023]重復(fù)序列可以是三核苷酸重復(fù)，但也可以是四核苷酸、五核苷酸或六核苷酸。作為非限制性實(shí)例，所述重復(fù)序列可以是(CGC)n，（GAA)n，（CTG)n，（CCTG)n，（CGG)n，（ATTCT)n，(CAG)n，其中n可包括1-20000,優(yōu)選10-15000,優(yōu)選大20的數(shù)（綜述參見：（Orr和2%1!1^2007))。所述靶序列包含重復(fù)序列的一部分，其包含至少3個(gè)，優(yōu)選至少4、5、6、7、8、9、10個(gè)核苷酸。[0024]與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域需要足夠長(zhǎng)以被稀有切割核酸內(nèi)切酶特異性識(shí)別。與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域包含至少5個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少6、7、8、9、10、11、12、15個(gè)核苷酸。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述相鄰序列包含5-10個(gè)核苷酸。相鄰序列可在相對(duì)重復(fù)序列的5'或3'區(qū)域中。所述靶序列優(yōu)選在其中不穩(wěn)定重復(fù)的擴(kuò)展可引起神經(jīng)學(xué)病癥的基因序列內(nèi)。作為非限制性實(shí)例，所述基因序列可選自：包含(CGG)n重復(fù)單位的脆性X智力低下基因1(FMR1，MM號(hào):309550，NG_007529.1)的5'非翻譯區(qū)(UTR)序列;包含(CCG)n重復(fù)單位的脆性X智力低下基因2(FMR2，M頂號(hào)300806，NG_016313.1)的5'UTR序列、包含(GAA)n重復(fù)單位的弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)1基因（FRDA，M頂號(hào)：606829，NG_008845.2)的第一內(nèi)含子;包含(CTG)n重復(fù)單位的營(yíng)養(yǎng)不良性肌強(qiáng)直-蛋白激酶基因（DMPK，Μ頂號(hào)605377，NG_009784.1)的3'UTR;包含(CCTG)η重復(fù)單位的鋅指（Zingfinger)9基因（ZNF9，M頂號(hào)：602668，NG_011902.1)的第一內(nèi)含子；包含（0六6)11重復(fù)單位的共濟(jì)失調(diào)蛋白（4七31111)8(4了乂湖，]\〇]\1號(hào)：613289,6611831^:DQ641254.1);包含(CTG)n重復(fù)單位的共濟(jì)失調(diào)蛋白8相反鏈(ATXN80S，MIM號(hào)：603680，NR_002717.2)，包含（CAGT)n重復(fù)單位的共濟(jì)失調(diào)蛋白10基因（ΑΤΧΝΙΟ,ΜΙΜ號(hào)：611150，NG_016212.1)的內(nèi)含子9;包含（CAG)n重復(fù)單位的蛋白磷酸酶2調(diào)節(jié)亞單位Ββ基因（PPP2R2B，ΜΙΜ號(hào)：604325，如_011570.1)的5'17^序列；包含(046)11重復(fù)單位的亨廷頓基因（!11'1'，]\〇]\1號(hào):613004，NG_009378.1)的Ν-末端;包含(CAG)n重復(fù)單位的共濟(jì)失調(diào)蛋白1(ΑΤΧΝ1，Μ頂號(hào)：601556，NG_011571·1);包含（CAG)n重復(fù)的共濟(jì)失調(diào)蛋白2(ΑΤΧΝ2;ΜΙΜ號(hào)：601517，NG_011572.1);包含（CAG)n重復(fù)單位的共濟(jì)失調(diào)蛋白3(ATXN3,Μ頂號(hào)：607047,NG_008198.1);包含(CAG)n重復(fù)單位的鈣通道電壓依賴性P/Q型α-1Α亞單位基因（CACNA1A，MIM號(hào):601011,NC_000019·9)的外顯子47;包含（CAG)n重復(fù)單位的ataxin7(ΑΤΧΝ7,ΜΙΜ號(hào)：607640，NG_008227.1);包含(CAG)n和/或（CAA)n重復(fù)單位的TATA框結(jié)合蛋白基因（ΤΒΡ,Μ頂號(hào)：60075,NG_008165.1);包含（CAG)n重復(fù)單位的脊椎和雄激素受體基因（AR，MIM號(hào)：313700，NG_009014.2)的外顯子1;包含(046)11重復(fù)單位的的3廿(^11丨111基因（4了附，]\〇]\1號(hào)：607462，如_008047.1)及其同源物。[0025]在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述靶序列選自編碼亨廷頓蛋白的序列（SEQIDNO:1)內(nèi)，優(yōu)選編碼亨廷頓蛋白的N-末端部分的序列（SEQIDN0:2)內(nèi)，更優(yōu)選靶序列選自序列SEQIDN0:3ft。[0026]"稀有切割核酸內(nèi)切酶"意指能夠催化DNA或RNA分子(優(yōu)選DNA分子）內(nèi)的核酸之間的鍵的水解(切割）的任何野生型酶或變體酶。稀有切割核酸內(nèi)切酶是高度特異性的，識(shí)別長(zhǎng)度范圍在10至45個(gè)堿基對(duì)(bp)、通常長(zhǎng)度范圍在10至35個(gè)堿基對(duì)的核酸靶位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的核酸內(nèi)切酶識(shí)別并切割特定多核苷酸序列(還稱為"靶系列"）處的核酸。稀有切割核酸內(nèi)切酶可識(shí)別和產(chǎn)生特定多核苷酸序列處的單鏈或雙鏈斷裂。[0027]根據(jù)本發(fā)明的稀有切割核酸內(nèi)切酶可以是Cas9核酸內(nèi)切酶。最近，已基于來自II型原核生物CRISPR(規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)）適應(yīng)性免疫系統(tǒng)（綜述參見（Sorek，Lawrence等2013))的RNA指導(dǎo)的Cas9核酸酶（Gasiunas，Barrangous等2012;Jinek，Chylinski等2012;Cong,Ran等2013;Mali，Yang等2013)開發(fā)了新的基因組工程化工具。CRISPR相關(guān)(Cas)系統(tǒng)首先在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，并起到防御外來DNA(病毒或質(zhì)粒DNA)的作用。CRISPR-介導(dǎo)的基因組工程化首先進(jìn)行通常側(cè)接短序列基序（稱為原間隔子（proto-spacer)鄰近基序(PAM))的靶序列的選擇。在靶序列選擇后，工程化與該靶序列互補(bǔ)的特定crRNAXRISPRII型系統(tǒng)中所需的反式激活crRNA(tracrRNA)與crRNA配對(duì)并結(jié)合于所提供的Cas9蛋白。Cas9用作促進(jìn)tracRNA與cRNA堿基配對(duì)的分子錨（Deltcheva，Chylinski等2011)。在該三元復(fù)合物中，雙tracrRNA:crRNA結(jié)構(gòu)用作將核酸內(nèi)切酶Cas9導(dǎo)向關(guān)聯(lián)靶序列的指導(dǎo)RNA。在本發(fā)明中，指導(dǎo)RNA可與包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列雜交。由Cas9-tracrRNA:crRNA復(fù)合物進(jìn)行的革E識(shí)別通過就革E序列與crRNA之間的同源性掃描革E序列來啟動(dòng)。除了靶序列-crRNA互補(bǔ)性以外，DNA靶向還需要與原間隔子相鄰的短基序(原間隔子鄰近基序-PAM)的存在。在雙RNA與靶序列之間配對(duì)后，Cas9隨后在PAM基序的上游3個(gè)堿基引入平端雙鏈斷裂(Garneau，Dupuis等2010)。根據(jù)本發(fā)明，在雙-RNA(指導(dǎo)RNA)與包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列雜交后，Cas9切割重復(fù)序列(參見圖4)。[0028]稀有切割核酸內(nèi)切酶還可以是歸巢核酸內(nèi)切酶，也稱為兆核酸酶。此類歸巢核酸內(nèi)切酶在本領(lǐng)域中是眾所周知的（Stoddard2005)。歸巢核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA靶序列并產(chǎn)生單鏈斷裂或雙鏈斷裂。歸巢核酸內(nèi)切酶是高度特異性的，識(shí)別長(zhǎng)度范圍在12至45個(gè)堿基對(duì)(bp)、通常長(zhǎng)度范圍在14至40bp的DNA靶位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明的歸巢核酸內(nèi)切酶可以例如對(duì)應(yīng)于LAGLIDADG核酸內(nèi)切酶、HNH核酸內(nèi)切酶或GIY-YIG核酸內(nèi)切酶。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選歸巢核酸內(nèi)切酶可以是I-CreI變體。"變體"核酸內(nèi)切酶（即在自然界中非天然存在的并通過遺傳工程或通過隨機(jī)誘變獲得的核酸內(nèi)切酶)可結(jié)合與被野生型核酸內(nèi)切酶識(shí)別的DNA序列不同的DNA序列（參見國(guó)際申請(qǐng)W02006/097854)。[0029]所述稀有切割核酸內(nèi)切酶可以是模塊化DNA結(jié)合核酸酶或嵌合核酸內(nèi)切酶。嵌合核酸內(nèi)切酶或模塊化DNA結(jié)合核酸酶意指包含核酸內(nèi)切酶的至少一個(gè)催化域和至少一個(gè)DNA結(jié)合域或規(guī)定核酸靶序列的蛋白質(zhì)的任何融合蛋白。[0030]所述DNA結(jié)合域一般為由獨(dú)立折疊的多肽蛋白域(其含有至少一個(gè)識(shí)別雙鏈或單鏈多核苷酸的基序)形成的RNA結(jié)合域或DNA結(jié)合域。所述核酸結(jié)合域優(yōu)選識(shí)別稱為靶序列的特定核酸序列。許多此類多肽已在本領(lǐng)域中被描述為具有結(jié)合特定核酸序列的能力。此類結(jié)合域通常包含(作為非限制性實(shí)例）螺旋-轉(zhuǎn)角螺旋域、亮氨酸拉鏈域、有翼螺旋域、螺旋-環(huán)-螺旋域、HMG-盒域、免疫球蛋白域、B3域或工程化鋅指域。[0031]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，DNA結(jié)合域來源于轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子(TALE)，其中序列特異性由一系列源自黃單胞菌屬(Xanthomonas)或青枯菌屬(Ralstonia)細(xì)菌蛋白質(zhì)的33-35個(gè)氨基酸重復(fù)驅(qū)動(dòng)。這些重復(fù)基本上相異在于規(guī)定與堿基對(duì)的相互作用的2個(gè)氨基酸位置(Boch，Scholze等2009;Moscou和Bogdanove2009)aDNA革El中的每一個(gè)喊基對(duì)被單個(gè)重復(fù)接觸，特異性由重復(fù)的兩個(gè)變異氨基酸(所謂的重復(fù)可變二肽，RVD)導(dǎo)致。TALE結(jié)合域還可包含負(fù)責(zé)靶序列的第一胸腺嘧啶堿基(To)的需要的N-末端轉(zhuǎn)運(yùn)域和含有細(xì)胞核定位信號(hào)(NLS)的C-末端域。TALE核酸結(jié)合域一般對(duì)應(yīng)于包含多個(gè)TALE重復(fù)序列的工程化核心TALE支架，每一個(gè)重復(fù)包含特異于TALE識(shí)別位點(diǎn)的每一個(gè)核苷酸堿基的RVD。在本發(fā)明中，所述核心支架的每一個(gè)TALE重復(fù)序列由30至42個(gè)氨基酸、更優(yōu)選33或34個(gè)氨基酸組成，其中位于位置12和13上的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸(所謂的重復(fù)可變二肽，RVD)介導(dǎo)識(shí)別所述TALE結(jié)合位點(diǎn)序列的一個(gè)核苷酸;等價(jià)的兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸可位于除了位置12和13之外的位置，尤其在長(zhǎng)度大于33或34個(gè)氨基酸的TALE重復(fù)序列中。優(yōu)選地，與不同核苷酸的識(shí)別相關(guān)的RVD為HD(用于識(shí)別C)、NG(用于識(shí)別T)、NI(用于識(shí)別A)、NN(用于識(shí)別G或A)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將關(guān)鍵氨基酸12和13突變成其它氨基酸殘基以調(diào)節(jié)它們對(duì)于核苷酸A、T、C和G的特異性，并且特別是增強(qiáng)該特異性。其它氨基酸殘基是指20個(gè)天然氨基酸殘基或非天然氨基酸衍生物中的任一個(gè)。[0032]TALE核酸結(jié)合域通常包含8至30個(gè)TALE重復(fù)序列。更優(yōu)選地，本發(fā)明的所述核心支架包含8至20個(gè)TALE重復(fù)序列；又更優(yōu)選為15個(gè)TALE重復(fù)序列。它還包含由位于所述一組TALE重復(fù)序列的C-末端的20個(gè)氨基酸，即另外的C-末端半-TALE重復(fù)序列組成的另外的單個(gè)截短的TALE重復(fù)序列。根據(jù)本發(fā)明的TALE核酸結(jié)合域優(yōu)選包含選自SEQIDN0:4和SEQIDN0:5的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述工程化TALE結(jié)合域包含與選自SEQIDNO:4和SEQIDN0:5的核酸序列具有至少80%，更優(yōu)選90%，又更優(yōu)選95%同一性的核酸序列。[0033]其它工程化DNA結(jié)合域?yàn)槟K化堿基-每個(gè)-堿基(base-per-base)特異性核酸結(jié)合域(MBBBD)(PCT/US2013/051783)?？梢岳鐝男妈b定的蛋白質(zhì)（即來自內(nèi)共生體真菌BurkholderiaRhizoxinica的最近測(cè)序的基因組的EAV36_BURRH、E5AW43_BURRH、E5AW45_BURRH和E5AW46_BURRH蛋白（Lackner，Moebius等2011))工程化所述MBBBDJBBBD蛋白包含為堿基特異性的約31至33個(gè)氨基酸的模塊。這些模塊顯示與黃單胞菌屬(Xanthomonas)TALE共同重復(fù)具有小于40%的同一性，然而它們呈現(xiàn)更大的多肽序列可變性。當(dāng)將它們組裝在一起時(shí)，這些模塊化多肽仍可以與黃單胞菌屬TAL-核酸酶十分相似的方式靶向特定的核酸序列。[0034]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述DNA結(jié)合域是包含10至30個(gè)模塊、優(yōu)選16至20個(gè)模塊的工程化MBBBD結(jié)合域。來自上述伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)和黃單胞菌屬的蛋白質(zhì)(模塊，N-末端和C-末端)的不同域用于對(duì)具有針對(duì)特定核酸序列的結(jié)合性質(zhì)的新蛋白質(zhì)或支架進(jìn)行工程化。具體地，工程化MBBBD的另外的N-末端和C-末端域可來源于天然TALE，像作為非限制性實(shí)例的AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Ta11c。[0035]"TALE-核酸酶"或"MBBBD-核酸酶"是指由通常來源于轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)蛋白(TALE)或MBBBD結(jié)合域的DNA結(jié)合域與核酸內(nèi)切酶催化域的融合產(chǎn)生的工程化蛋白質(zhì)。此種催化域優(yōu)選為核酸酶域，更優(yōu)選具有核酸內(nèi)切酶活性的域，像例如I-TevI、ColE7、NucA和F〇k-I。在具體實(shí)施方案中，所述核酸酶是單體TALE-核酸酶或MBBBD-核酸酶。單體核酸酶為進(jìn)行特異性識(shí)別和切割不需要二聚化的核酸酶，諸如工程化DNA結(jié)合域與W02012138927中描述的I-TevI的催化域的融合(參見圖3)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述稀有切割核酸內(nèi)切酶為二聚體TALE-核酸酶或MBBBD-核酸酶，優(yōu)選包含融合至FokI的DNA結(jié)合域(參見圖1)。所述二聚體核酸酶包含第一DNA結(jié)合核酸酶和第二DNA結(jié)合核酸酶，所述第一DNA結(jié)合核酸酶能夠結(jié)合包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列，所述第二DNA結(jié)合核酸酶能夠結(jié)合重復(fù)序列內(nèi)的靶序列，使得二聚體核酸酶誘導(dǎo)重復(fù)序列內(nèi)的切割事件(參見圖2)JALE-核酸酶已被描述并用于刺激基因革巴向和基因修飾（Boch，Scholze等2009;Moscou和Bogdanove2009;0^丨8^311，〇6現(xiàn)31^等2010)。此類工程化了41^-核酸酶可在商標(biāo)名了41^~1￥(〇6116(^18，8ruedelaCroixJarry，75013Paris,France)下商購(gòu)獲得。[0036]在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及此處公開的稀有切割核酸內(nèi)切酶，優(yōu)選可通過上述方法獲得的稀有切割核酸內(nèi)切酶。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及與選自SEQIDN0:8、SEQIDN0:10和SEQIDN0:15的氨基酸序列具有至少70%，優(yōu)選80%、85%、90%、95%同一性的稀有切割核酸內(nèi)切酶。[0037]多核苷酸、載體:[0038]本發(fā)明還涉及編碼上述根據(jù)本發(fā)明的稀有切割核酸內(nèi)切酶的多核苷酸、載體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含選自SEQIDN0:9、SEQIDN0:11和SEQIDN0:16的核酸序列的多核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多核苷酸與選自SEQIDN0:9、SEQIDN0:11和SEQIDNO:16的核酸序列具有至少70%，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%、95%、97%或99%序列同一'性。[0039]所述多核苷酸可存在于表達(dá)盒或表達(dá)載體(例如，用于引入細(xì)菌宿主細(xì)胞的質(zhì)粒，或用于轉(zhuǎn)染昆蟲宿主細(xì)胞的病毒載體諸如桿狀病毒載體，或用于轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的質(zhì)?；虿《据d體諸如慢病毒）。[0040]在具體實(shí)施方案中，可在一個(gè)包含編碼核糖體跳過序列（ribosomalskipsequence)的核酸序列諸如編碼2A肽的序列的多核苷酸或載體中包含不同的核酸序列。在小RNA病毒的口蹄疫病毒亞群中鑒定的2A肽引起從一個(gè)密碼子至下一個(gè)密碼子的核糖體"跳過"而不在由所述密碼子編碼的兩個(gè)氨基酸之間形成肽鍵(參見(Donnelly和Elliott，2001;Donnelly，Luke等2001;Atkins，Wills等2007;Doronina，Wu等2008))。"密碼子"意指mRNA上（或DNA分子的有義鏈上）上的通過核糖體翻譯成一個(gè)氨基酸殘基的3個(gè)核苷酸。因此，當(dāng)多肽被讀框內(nèi)的2A寡肽分隔時(shí)，可從mRNA內(nèi)的單個(gè)連續(xù)開放閱讀框合成兩條多肽。此類核糖體跳過機(jī)制在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且已知通過幾個(gè)載體用于表達(dá)由單個(gè)信使RNA編碼的幾個(gè)蛋白質(zhì)。[0041]本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的是，鑒于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，在這些多核苷酸分子中可能存在相當(dāng)多的序列變異。優(yōu)選地，將本發(fā)明的核酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化以用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，優(yōu)選用于在人細(xì)胞中表達(dá)。密碼子優(yōu)化是指目標(biāo)序列中給定的物種的高度表達(dá)的基因中通常罕見的密碼子與此類物種的高度表達(dá)的基因中的一般常見的密碼子(此類密碼子與將被交換的密碼子編碼相同的氨基酸)的交換。[0042]用于縮小經(jīng)歷重復(fù)病癥的重復(fù)序列的方法[0043]在另一個(gè)方面，本發(fā)明還涉及用于將經(jīng)歷重復(fù)病癥的基因序列內(nèi)的重復(fù)序列縮小進(jìn)活細(xì)胞的方法。該方法包括以下步驟：（a)選擇包含與重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列；（b)提供至少一種能夠結(jié)合所述靶序列并切割重復(fù)序列的稀有切割核酸內(nèi)切酶；（c)將所述稀有切割核酸內(nèi)切酶引入所述細(xì)胞并且(d)將所述稀有切割核酸內(nèi)切酶與基因序列接觸，使得所述稀有切割核酸內(nèi)切酶切割重復(fù)序列，從而誘導(dǎo)進(jìn)行來縮小所述重復(fù)序列的修復(fù)過程。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述修復(fù)過程是單鏈退火(SSA)。單鏈退火(SSA)是當(dāng)在以相同方向取向的兩個(gè)重復(fù)序列之間產(chǎn)生切割時(shí)啟動(dòng)的過程。在斷裂附近產(chǎn)生延伸至重復(fù)序列的單鏈區(qū)域，以便互補(bǔ)鏈可相互退火。該退火的中間體可通過消化掉單鏈尾并在退火過程中填充缺口來進(jìn)行加工。在具體實(shí)施方案中，所述方法包括在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)能夠結(jié)合根據(jù)本發(fā)明的靶序列的稀有切割核酸內(nèi)切酶。在更具體的實(shí)施方案中，所述方法包括用至少一種編碼如上所述的稀有切割核酸內(nèi)切酶的多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并將所述多核苷酸表達(dá)進(jìn)所述細(xì)胞。[0044]上述方法包括將稀有切割核酸內(nèi)切酶引入細(xì)胞。作為非限制性實(shí)例，可將所述稀有切割核酸內(nèi)切酶作為由一個(gè)質(zhì)粒載體編碼的轉(zhuǎn)基因引入。所述質(zhì)粒載體還可含有提供用于鑒定和/或選擇接受所述載體的細(xì)胞的選擇標(biāo)記。[0045]可作為將編碼所述多肽的多核苷酸引入細(xì)胞的結(jié)果，在細(xì)胞中原位合成多肽?；蛘撸稍诩?xì)胞外部產(chǎn)生所述多肽，隨后將所述多肽引入該細(xì)胞。用于將多核苷酸構(gòu)建體引入細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且作為非限定性實(shí)例包括其中將多核苷酸構(gòu)建體整合進(jìn)細(xì)胞的基因組的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化法、其中將多核苷酸構(gòu)建體不整合進(jìn)細(xì)胞的基因組的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法以及病毒介導(dǎo)法。可通過例如重組病毒載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒）、脂質(zhì)體等將所述多核苷酸引入細(xì)胞。例如，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法包括例如顯微注射、電穿孔或粒子轟擊。為了在細(xì)胞中表達(dá)，可將所述多核苷酸包含在載體、更具體地質(zhì)?；虿《局?。[0046]本發(fā)明還涉及易于通過上述段落中所述的方法獲得的分離的細(xì)胞或細(xì)胞系。具體地，所述分離的細(xì)胞包含至少一種如上所述的稀有切割核酸內(nèi)切酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的細(xì)胞包含減小的重復(fù)擴(kuò)展序列。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述分離的細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。[0047]麵[0048]在另一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的所述稀有切割核酸內(nèi)切酶可用于治療或預(yù)防由不穩(wěn)定的重復(fù)擴(kuò)展引起的疾病，優(yōu)選作為非限制性實(shí)例：脆性X綜合征(FRAXA)、脆性XE綜合征(FRAXE)、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)(FRDA)、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良（DM1)、脆性X相關(guān)震顫共濟(jì)失調(diào)綜合征(FXTAS)、CAG重復(fù)擴(kuò)展疾病諸如脊髓延髓肌肉萎縮癥(SBMA)、亨廷頓病(HD)、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)1型、齒狀紅核蒼白球（dentatorubal-pallidoluysian)萎縮癥、Machado-Joseph病、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)2、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)6和脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)7。本發(fā)明的所述稀有切割核酸內(nèi)切酶優(yōu)選用于治療亨廷頓病?？墒褂美绮《据d體向受試者直接施用所述稀有切割核酸內(nèi)切酶(體內(nèi)）?？赏ㄟ^全身性施用(例如靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或顱內(nèi)輸注)或局部施用來施用所述稀有切割核酸內(nèi)切酶?；蛘撸蓪⑺鱿∮星懈詈怂醿?nèi)切酶用于體外處理細(xì)胞，隨后通常在選擇已整合了載體的細(xì)胞后向受試者施用經(jīng)修飾的細(xì)胞(離體)。[0049]本發(fā)明還涉及包含特異于重復(fù)序列的根據(jù)本發(fā)明的稀有切割核酸內(nèi)切酶的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可用于縮小細(xì)胞內(nèi)的特定重復(fù)序列。根據(jù)待施用的特定組合物以及根據(jù)用于施用組合物的特定方法來部分確定藥學(xué)上可接受的載體。因此，存在可獲得的各種各樣的藥物組合物的適合制劑。[0050]本發(fā)明的方法和組合物還可用于設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)體外和體內(nèi)模型，例如重復(fù)病癥的動(dòng)物模型，所述模型允許研究這些病癥。合適的體外模型的非限制性實(shí)例包括來自任何生物的細(xì)胞或細(xì)胞系，包括成纖維細(xì)胞。用作動(dòng)物模型的合適動(dòng)物的非限制性實(shí)例包括無脊椎動(dòng)物(秀麗隱桿線蟲(C.elegans)、果繩(Drsophi1ia))、嗤齒類動(dòng)物(例如，大鼠或小鼠）、靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物）。[0051][0052]在上述描述中，許多術(shù)語(yǔ)被廣泛使用。以下定義被提供來幫助理解本發(fā)明的實(shí)施方案。[0053]如本文中所用，"一個(gè)(a)"或"一個(gè)(an)"可意指一個(gè)或不止一個(gè)。[0054]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"大約"表示包括用于測(cè)定值的方法的固有誤差變化或?qū)嶒?yàn)之間存在的變化的值。[0055]-本文中按照單字母代碼來指定多肽序列中的氨基酸殘基，其中，例如，Q意指Gin或谷氨酰胺殘基，R意指Arg或精氨酸殘基以及D意指Asp或天冬氨酸殘基。[0056]-氨基酸取代意指另一個(gè)氨基酸對(duì)一個(gè)氨基酸的替代，例如肽序列中谷氨酰胺殘基對(duì)精氨酸殘基的替代是一種氨基酸取代。[0057]-如下指定核苷酸:一字母代碼用于指定核苷的堿基:a為腺噪呤，t為胸腺啼啶，c為胞嘧啶，以及g為鳥嘌呤。對(duì)于簡(jiǎn)并核苷酸，r表示g或a(嘌呤核苷酸），k表示g或t，s表示g或c，w表示a或t，m表示a或c，y表示t或c(啼啶核苷酸），d表示g、a或t，v表示g、a或c，b表示g、t或c，h表不a、t或c，以及η表不g、a、t或c。[0058]-如本文中所用，"核酸"或"核酸分子"是指核苷酸和/或多核苷酸，諸如脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段，以及通過連接、切斷、核酸內(nèi)切酶作用和核酸酶外切酶作用的任一種產(chǎn)生的片段。核酸分子可由為天然存在的核苷酸(諸如DNA和RNA)或天然存在的核苷酸的類似物(例如，天然存在的核苷酸的對(duì)映體形式）的單體或兩者的組合的組成。經(jīng)修飾的核苷酸可在糖部分和/或嘧啶或嘌呤堿基部分中有改變。糖修飾包括，例如，鹵素、烷基、胺基和疊氮基對(duì)一個(gè)或多個(gè)羥基的替代，或糖可被官能化為醚或酯。此外，可用空間上和電子上相似的結(jié)構(gòu)，諸如氮雜-糖和碳環(huán)糖類似物替換整個(gè)糖部分。堿基部分中修飾的實(shí)例包括烷基化嘌呤和嘧啶、?；堰驶蜞奏?，或其它眾所周知的雜環(huán)取代物?？赏ㄟ^磷酸二酯鍵或此類鍵的類似物連接核酸單體。核酸可以是單鏈或雙鏈。[0059]基因"意指遺傳的基本單位，其由以線性方式沿染色體排列的DNA的區(qū)段組成，其編碼特定的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的區(qū)段?；蛲ǔ０▎?dòng)子、5'非翻譯區(qū)、一個(gè)或多個(gè)編碼序列（外顯子）、任選地內(nèi)含子、3'非翻譯區(qū)?；蜻€可包含終止子、增強(qiáng)子和/或沉默子。[0060]-術(shù)語(yǔ)"切割"是指多核苷酸共價(jià)主鏈的斷裂。切割可通過各種方法起始，包括、但不限于磷酸二酯鍵的酶促或化學(xué)水解。單鏈切割和雙鏈切割兩者都是可能的，雙鏈切割可作為兩個(gè)不同的單鏈切割事件的結(jié)果發(fā)生。雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交體切割可導(dǎo)致平末端或交錯(cuò)末端的產(chǎn)生。[0061]催化域"旨在指酶的含有所述酶的活性部位的蛋白質(zhì)域或模塊，活性部位旨在指在該部位發(fā)生底物催化的所述酶的部分。按照它們催化的反應(yīng)分類和命名酶以及它們的催化域。酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)(EC編號(hào))為酶基于它們催化的化學(xué)反應(yīng)的數(shù)值分類10方案。[0062]-根據(jù)本發(fā)明，"同源的"意指，相對(duì)于氨基酸的第一序列，與所述第一氨基酸序列具有至少60%或至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%同源性并且具有類似生物學(xué)活性的任何氨基酸序列。[0063]序列同源性可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域中常用的任何方法來鑒定。各種比對(duì)算法和/或程序可用于計(jì)算兩個(gè)序列之間的同一性，其包括可作為GCG序列分析包(UniversityofWisconsin,Madison，Wis.)的部分獲得的并且可利用例如默認(rèn)設(shè)置來進(jìn)行使用的FASTA或BLAST。[0064]同一性"是指兩個(gè)核酸分子或多肽之間的序列同一性。同一性可通過比較可為了比較目的而被對(duì)齊的每條序列中的位置來確定。當(dāng)被比較的序列中的位置被相同堿基占據(jù)時(shí)，則所述分子在該位置被鑒定為是同一的。核酸或氨基酸序列之間的相似性或同一性的程度是由核酸序列所共有的位置上的相同或匹配核苷酸的數(shù)目的函數(shù)。各種比對(duì)算法和/或程序可用于計(jì)算兩個(gè)序列之間的同一性，包括可作為GCG序列分析包(UniversityofWisconsin，Madison，Wis.)的部分獲得的并且可利用例如默認(rèn)設(shè)置來進(jìn)行使用的FASTA或BLAST。[0065]雜交序列"意指可在標(biāo)準(zhǔn)低嚴(yán)格條件下與其他寡核苷酸之一雜交的寡核苷酸的序列部分。此類條件可以是例如通過使用緩沖液(含有25%甲酰胺，4XSSC，50mMNaH2P04/Na2HP04緩沖液；pH7.0,5XDenhardt's，lmMEDTA，lmg/mlDNA+20-200ng/ml待測(cè)試的探針(約20-200ng/ml))在室溫下進(jìn)行2小時(shí)。如文獻(xiàn)中所提供的，這也可通過在室溫下使用序列內(nèi)的互補(bǔ)堿基的數(shù)目和G-C的含量，通過雜交的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算來預(yù)測(cè)。優(yōu)選地，雜交序列按照兩個(gè)核酸鏈之間的互補(bǔ)性(依賴于鏈之間的Watson-Crick堿基配對(duì)（即腺噪呤與胸腺啼啶(A-T)核苷酸之間以及鳥嘌呤與胞嘧啶(G-C)核苷酸之間的固有堿基配對(duì)））彼此互補(bǔ)。等同于Watson-Crick堿基配對(duì)的精確堿基配對(duì)包括標(biāo)準(zhǔn)核苷與經(jīng)修飾的核苷之間的堿基配對(duì)以及經(jīng)修飾的核苷之間的堿基配對(duì)，其中所述經(jīng)修飾的核苷能夠按照Watson-Crick配體取代適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)核苷。單鏈寡核苷酸的互補(bǔ)序列可以是在反應(yīng)條件下支持兩條單鏈寡核苷酸之間的特異性和穩(wěn)定的雜交的任何長(zhǎng)度。[0066]遞送載體"旨指可在本發(fā)明中用于與細(xì)胞接觸（8卩"接觸"）或?qū)⒈景l(fā)明中所需要的試劑/化學(xué)物質(zhì)和分子(蛋白質(zhì)或核酸)遞送至細(xì)胞或亞細(xì)胞區(qū)室內(nèi)部的任何遞送載體。它包括、但不限于脂質(zhì)體遞送載體、病毒遞送載體、藥物遞送載體、化學(xué)載體、聚合物載體、脂質(zhì)復(fù)合物（lipoplex)、多聚物復(fù)合物(polyplex)、樹狀聚合物、微泡(超聲對(duì)比劑）、納米顆粒、乳劑或其它適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移載體。這些遞送載體允許遞送分子、化學(xué)品、大分子(基因、蛋白質(zhì)）或其它載體諸如由Diatos開發(fā)的質(zhì)粒、肽。在這些情況下，遞送載體是分子運(yùn)載體。"遞送載體"也指進(jìn)行轉(zhuǎn)染的遞送方法。[0067]-術(shù)語(yǔ)"載體"是指能夠?qū)⑥D(zhuǎn)運(yùn)已與其連接的另一個(gè)核酸的核酸分子。本發(fā)明中的"載體"包括、但不限于，病毒載體、質(zhì)粒、RNA載體或線性或環(huán)狀DNA或RNA分子，其可由染色體、非染色體、半合成或合成核酸組成。優(yōu)選載體是能夠自主復(fù)制（附加型載體)和/或表達(dá)與它們連接的核酸(表達(dá)載體)的那些載體。許多合適的載體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的并且可商購(gòu)獲得。[0068]-病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、細(xì)小病毒(例如腺相關(guān)病毒）、冠狀病毒、負(fù)鏈RNA病毒諸如正粘病毒(例如，流感病毒）、彈狀病毒(例如，狂犬病和水皰性口炎病毒）、副粘病毒(例如麻疼和仙臺(tái)病毒）、正鏈RNA病毒諸如小RNA病毒和α病毒，以及雙鏈DNA病毒，包括腺病毒、皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒1型和2型、ΕΒ病毒、巨細(xì)胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、雞痘和金絲雀痘）。其它病毒包括例如諾沃克病毒、披膜病毒、黃病毒、呼腸孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的實(shí)例包括:禽白血病肉瘤、哺乳動(dòng)物C-型、8-型病毒、0-型病毒、!111^-81^群、慢病毒、泡沫病毒（〇^打11，入]^，1^讓〇￥丨4(^6:1116virusesandtheirreplication,InFundamentalVirology，第3版，B.N.Fields，等，編輯，Lippincott-RavenPublishers，Philadelphia,1996)〇[0069]-細(xì)胞旨在指任何原核或真核生物活細(xì)胞，用于體外培養(yǎng)的來源于這些生物的細(xì)胞系，來自動(dòng)物或植物來源的原代細(xì)胞。[0070]原代細(xì)胞"旨在指從活組織（即活檢材料)直接獲取并被建立用于體外生長(zhǎng)的細(xì)胞，其已經(jīng)歷極少的群體倍增，從而相較于連續(xù)致瘤或人工永生化的細(xì)胞系，更加能夠代表它們所源自的組織的主要功能組分和特征。這些細(xì)胞從而代表針對(duì)它們所指的體內(nèi)狀態(tài)的更具價(jià)值的模型。[0071]在本發(fā)明的框架內(nèi)，"真核細(xì)胞"是指真菌、植物或動(dòng)物細(xì)胞或來源于下面所列的生物并被建立用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞系。[0072]更優(yōu)選，動(dòng)物細(xì)胞為以下屬的細(xì)胞：智人（Homo)、鼠（Rattus)、小鼠（Mus)、野豬(Sus)、牛(Bos)、斑馬魚(Danio)、犬(Canis)、貓(Felis)、馬(Equus)、鱒鮭魚(Salmo)、大麻哈魚（〇11(301'11711(311118)、雞（6&11118)、火雞（]\1616&81^8)、果繩（〇1'080卩11；[1&)、隱桿線蟲(Caenorhabditis);更優(yōu)選地、動(dòng)物細(xì)胞為以下種的細(xì)胞：智人(Homosapiens)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、小家鼠（Musmusculus)、野豬（Susscrofa)、黃牛（Bostaurus)、斑馬魚（Daniorerio)、灰狼（Canislupus)、家貓(Feliscatus)、馬（Equuscaballus)、大西洋娃（Salmosalar)、虹蹲（Oncorhynchusmykiss)、原雞（Gallusgallus)、野生火雞(Meleagrisgallopavo)、黑腹果繩（Drosophilamelanogaster)、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)。[0073]在本發(fā)明中，細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物細(xì)胞、魚細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或來源于這些生物用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞系或直接從活組織獲取并被建立用于體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞。作為非限制性實(shí)例，細(xì)胞系可選自CH0-K1細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、Caco2細(xì)胞、U2-0S細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、NS0細(xì)胞、SP2細(xì)胞、CH0-S細(xì)胞、DG44細(xì)胞、K-562細(xì)胞，U-937細(xì)胞、MRC5細(xì)胞、頂R90細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、HT-1080細(xì)胞、HCT-116細(xì)胞、Hu-h7細(xì)胞、Huvec細(xì)胞、Molt4細(xì)胞。還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的細(xì)胞是干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)。[0074]所有這些細(xì)胞系可通過本發(fā)明的方法來修飾以提供細(xì)胞系模型。[0075]-如本文中所用，"受試者"包括動(dòng)物界的所有成員，包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人。實(shí)施例：[0076]TALE主鏈中的RVD陣列集合的克隆[0077]用于這些實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)TALE主鏈(pCLS9303和pCLS9312，SEQID勵(lì):4和5)在(：末端與N末端域之間含有兩個(gè)BsmBI限制性位點(diǎn)。使用II型限制性酶BsmBI(用于接受質(zhì)粒）以及Bbvl和SfaNI(用于插入的RVD陣列）將靶向側(cè)接重復(fù)三核苷酸（SEQIDN0:6至7)的區(qū)域的單個(gè)重復(fù)陣列亞克隆入PCLS9303中，產(chǎn)生pCLS9984和pCLS16715(SEQIDN0:9編碼的SEQIDN0:8和SEQIDNO:11編碼的SEQIDNO:10)。使用II型限制性酶BsmBI(用于接受質(zhì)粒）以及Bbvl和SfaNI(用于插入的RVD陣列）將靶向側(cè)接重復(fù)三核苷酸（SEQIDNO:14)的區(qū)域的單個(gè)重復(fù)陣列亞克隆入PCLS9312,產(chǎn)生pCLS9996(SEQIDN0:16編碼的SEQIDN0:15)。通過DNA測(cè)序評(píng)估每一個(gè)單個(gè)克隆的單克隆性DNA序列。[0078]酵母中TALE-核酸酶的活性[0079]如先前所述（國(guó)際PCT申請(qǐng)W02004/067736和于Epinat，Arnould等2003;Chames，Epinat等2005;Arnould，Chames等2006;Smith，Grizot等2006中），構(gòu)建兩個(gè)含有TALEN?DNA靶序列的酵母靶報(bào)告質(zhì)粒。在先前所述的我們的酵母SSA測(cè)定（國(guó)際PCT申請(qǐng)W02004/067736和于Epinat，Arnould等2003;Chames，Epinat等2005;Arnould，Chames等2006;Smith，Grizot等2006中）中，在37°C和30°C下，對(duì)兩個(gè)靶（SEQID如：12至13，表1)測(cè)試TALEN?對(duì)(pCLS9984/pCLS9996和pCLS16715/pCLS9996)。TALEN?在酵母中對(duì)它們的靶的切割活性水平示于表2中。[0080]表1:被2個(gè)TALEN對(duì)靶向的序列的列表。[0081][0082]由TALEN?祀向的側(cè)接重復(fù)序列的16bp序列（省略位置T0)被加下劃線。[0083]表2:在37°C和30°C下，TALEN?在如先前所述的我們的酵母SSA測(cè)定（國(guó)際PCT申請(qǐng)W02004/067736和于Epinat，Arnould等2003;Chames，Epinat等2005;Arnould，Chames等2006;Smith，Grizot等2006;Smith，Grizot等2006中）中的活性。[0084][0085]~-代表不可檢測(cè)的活性，+表示弱活性，++表示高活性。n.a.表示無可獲得的數(shù)據(jù)。[0086]參考文獻(xiàn)[0087]Arnould，S·，P·Chames，etal·(2006)·"EngineeringoflargenumbersofhighlyspecifichomingendonucleasesthatinducerecombinationonnovelDNAtargets/7MolBiol355(3):443-58.[0088]Atkins，J.F.，N.M.Wills，etal·(2007)·"Acasefor"StopGo":reprogrammingtranslationtoaugmentcodonmeaningofGGNbypromotingunconventionaltermination(Stop)afteradditionofglycineandthenallowingcontinuedtranslation(Go)."Rna13(6):803-10.[0089]Boch，J·，H·Scholze，etal·(2009)·"BreakingthecodeofDNAbindingspecificityofTAL-typeIIIeffectors."Science326(5959):1509-12.[0090]Caplen，N.J.，J.P.Taylor，etal·(2002)·"Rescueofpolyglutamine-mediatedcytotoxicitybydouble-strandedRNA-mediatedRNAinterference.〃HumMolGenet11(2):175-84.[0091]Chames,P.,J.C.Epinat,etal.(2005).^Invivoselectionofengineeredhomingendonucleasesusingdouble-strandbreakinducedhomologousrecombination.^NucleicAcidsRes33(20):el78.[0092]Christian，M·，T·Cermak，etal·(2010)·"TargetingDNAdouble-strandbreakswithTALeffectornucleases.''Genetics186(2):757-61.[0093]Cong,L.,F.A.Ran,etal·(2013).''MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems."Science339(6121):819-23.[0094]Dejesus-Hernandez，M·，I·R·Mackenzie，etal·(2011)·"ExpandedGGGGCChexanucleotiderepeatinnoncodingregionofC90RF72causeschromosome9p-1inkedFTDandALS.〃Neuron72(2):245-56.[0095]Deltcheva，E·，K·Chylinski，etal·(2011)·"CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII."Nature471(7340):602-7.[0096]DiFiglia，Μ·，M.Sena-Esteves，etal·(2007)·"TherapeuticsilencingofmutanthuntingtinwithsiRNAattenuatesstriatalandcorticalneuropathologyandbehavioraldeficits·"ProcNatlAcadSciUSA104(43):17204-9.[0097]Donnelly,M.andG.Elliott(2001).^NuclearlocalizationandshuttlingofherpessimplexvirustegumentproteinVP13/14.〃JVirol75(6):2566-74.[0098]Donnelly，M.L.，G.Luke，etal·(2001)·"Analysisoftheaphthovirus2A/2Bpolyprotein'cleavage'mechanismindicatesnotaproteolyticreaction,butanoveltranslationaleffect:aputativeribosomal'skip'."JGenVirol82(Pt5):1013-25.[0099]Doronina，V·A·，C.Wu，etal·(2008)·"Site-specificreleaseofnascentchainsfromribosomesatasensecodon."MolCellBiol28(13):4227-39.[0100]Dragatsis，I·，M·S·Levine，etal·(2000)·"InactivationofHdhinthebrainandtestisresultsinprogressiveneurodegenerationandsterilityinmice.〃NatGenet26(3):300-6.[0101]Duyao，M·P·，A·B·Auerbach，etal·(1995)·"InactivationofthemouseHuntington'sdiseasegenehomologHdh.''Science269(5222):407-10.[0102]Epinat，J.C.，S.Arnould，etal·(2003),Anovelengineeredmeganucleaseinduceshomologousrecombinationinyeastandmammaliancells."NucleicAcidsRes31(11):2952-62.[0103]Garneau，J.E.，M.E.Dupuis，etal·(2010)."TheCRISPR/CasbacterialimmunesystemcleavesbacteriophageandplasmidDNA.''Nature468(7320):67-71.[0104]Garriga-Canut，M·，C·Agustin-Pavon，etal.^SyntheticzincfingerrepressorsreducemutanthuntingtinexpressioninthebrainofR6/2mice,ProcNatlAcadSciUSA109(45):E3136_45.[0105]Gasiunas,G.,R.Barrangou,etal·(2012),Cas9_crRNAribonucleoproteincomplexmediatesspecificDNAcleavageforadaptiveimmunityinbacteria,ProcNatlAcadSciUSA109(39):E2579_86.[0106]Jinek，M.，K.Chylinski，etal·(2012)·"Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.''Science337(6096):816-21.[0107]Lackner，G·，N·Moebius，etal·(2011).''CompletegenomesequenceofBurkholderiarhizoxinica,anEndosymbiontofRhizopusmicrosporus.〃JBacteriol193(3):783-4.[0108]Machida，Y.，T.0kada，etal·(2006)·"rAAV-mediatedshRNAamelioratedneuropathologyinHuntingtondiseasemodelmouse."BiochemBiophysResCommun343(1):190-7.[0109]Mali，P.，L.Yang，etal·(2013),RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9."Science339(6121):823-6.[0110]Mirkin，S.M.(2007)·"ExpandableDNArepeatsandhumandisease."Nature447(7147):932-40.[0111]Moscou,M.J.andA.J.Bogdanove(2009).^AsimpleciphergovernsDNArecognitionbyTALeffectors.''Science326(5959):1501.[0112]Ne1son，D·L·，Η·T·Orr，etal.(2013)·"Theunstablerepeats-threeevolvingfacesofneurologicaldisease.''Neuron77(5):825-43.[0113]Orr，Η·T·andΗ.Y·Zoghbi(2007)·"Trinucleotiderepeatdisorders.〃AnnuRevNeurosci30:575-621.[0114]Renton,A.E.,E.Majounie,etal.(2011),AhexanucleotiderepeatexpansioninC90RF72isthecauseofchromosome9p21_linkedALS-FTD.''Neuron72(2):257-68.[0115]Richard,G.F.,B.Dujon,etal.(1999).^Double-strandbreakrepaircanleadtohighfrequenciesofdeletionswithinshortCAG/CTGtrinucleotiderepeats·"MolGenGenet261(4-5):871-82.[0116]Smith，J.，S.Grizot，etal.(2006).combinatorialapproachtocreateartificialhomingendonucleasescleavingchosensequences.''NucleicAcidsRes34(22):el49.[0117]Smith，J.，S.Grizot，etal.(2006).combinatorialapproachtocreateartificialhomingendonucleasescleavingchosensequences."NucleicAcidsRes.[0118]Sorek,R.,C.M.Lawrence,etal.(2013).^CRISPR-mediatedAdaptiveImmuneSystemsinBacteriaandArchaea.〃AnnuRevBiochem.[0119]Stoddard，B.L.(2005),Homingendonucleasestructureandfunction.〃QRevBiophys38(1):49-95.[0120]Wang，Y.L.，W.Liu，etal·(2005)·"Clinico-pathologicalrescueofamodelmouseofHuntington'sdiseasebysiRNA.''NeurosciRes53(3):241-9.【主權(quán)項(xiàng)】1.一種稀有切割核酸內(nèi)切酶，其用于在細(xì)胞中縮小經(jīng)歷重復(fù)病癥的基因中的多核苷酸重復(fù)，所述稀有切割核酸內(nèi)切酶被工程化來特異性切割重復(fù)序列，其特征在于所述稀有切割核酸內(nèi)切酶識(shí)別包含與所述重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列。2.權(quán)利要求1的稀有切割核酸內(nèi)切酶，其中所述稀有切割核酸內(nèi)切酶識(shí)別橫跨與所述序列重復(fù)相鄰的至少10個(gè)核酸堿基和所述重復(fù)序列內(nèi)的至少5個(gè)核酸堿基的靶序列。3.權(quán)利要求1的稀有切割核酸內(nèi)切酶，其中所述稀有切割核酸內(nèi)切酶為嵌合核酸內(nèi)切酶，其包含識(shí)別包含與所述重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶區(qū)域的結(jié)合域和在所述重復(fù)序列內(nèi)切割的核酸內(nèi)切酶域。4.權(quán)利要求3的稀有切割核酸內(nèi)切酶，其中所述結(jié)合域是工程化的TALE、MBBBD或ZF結(jié)合域。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述核酸內(nèi)切酶域選自I-TevI、NucA、ColE7或Fok-I。6.權(quán)利要求1的稀有切割核酸內(nèi)切酶，其中所述稀有切割核酸內(nèi)切酶為Cas9并且其中所述靶序列的識(shí)別是通過能夠與所述靶序列雜交的引導(dǎo)RNA獲得的。7.權(quán)利要求1的稀有切割核酸內(nèi)切酶，其中所述靶序列在選自SEQIDNO:1至SEQIDNO:3的序列內(nèi)。8.權(quán)利要求7的稀有切割核酸內(nèi)切酶，其具有SEQIDN0:8、10和15的至少80%，優(yōu)選85%、90%、95%的氨基酸序列。9.權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的稀有切割核酸內(nèi)切酶，其用于治療或預(yù)防重復(fù)疾病。10.權(quán)利要求1至8的任一項(xiàng)的稀有切割核酸內(nèi)切酶，其用于治療或預(yù)防所述亨廷頓病。11.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)的所述稀有切割核酸內(nèi)切酶。12.-種載體，其包含權(quán)利要求11的多核苷酸。13.-種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)的至少一種稀有切割核酸內(nèi)切酶，或權(quán)利要求11或12的多核苷酸。14.一種縮小經(jīng)歷重復(fù)病癥的基因序列內(nèi)的重復(fù)序列進(jìn)入活細(xì)胞的方法：(a)選擇包含與所述重復(fù)序列相鄰的區(qū)域的靶序列；(b)提供能夠結(jié)合所述靶序列并切割所述重復(fù)序列的稀有切割核酸內(nèi)切酶；(c)將所述稀有切割核酸內(nèi)切酶引入所述細(xì)胞；使得所述DNA結(jié)合核酸酶誘導(dǎo)重復(fù)序列內(nèi)的切割和誘導(dǎo)進(jìn)行來縮小所述重復(fù)序列的修復(fù)過程。15.權(quán)利要求14的方法，其中進(jìn)行來縮小所述重復(fù)序列的修復(fù)過程是SSA(單鏈退火）。16.-種縮小權(quán)利要求15的細(xì)胞的基因序列內(nèi)的重復(fù)序列的方法，其中所述稀有切割核酸內(nèi)切酶是權(quán)利要求1至10的任一項(xiàng)的稀有切割核酸內(nèi)切酶。17.-種分離的細(xì)胞，其包含權(quán)利要求9至12的任一項(xiàng)的至少一種稀有切割核酸內(nèi)切酶，或權(quán)利要求13的一種多核苷酸。18.權(quán)利要求17的分離的細(xì)胞，其為哺乳動(dòng)物細(xì)胞?！疚臋n編號(hào)】C12N15/90GK105916983SQ201480066491【公開日】2016年8月31日【申請(qǐng)日】2014年10月24日【發(fā)明人】P·杜察特烏,A·朱雷拉特【申請(qǐng)人】塞勒克提斯公司