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      用于使用自體細胞系統(tǒng)從生殖系細胞離體產生有發(fā)育能力的卵的方法和組合物的制作方法

      文檔序號:10556816閱讀:801來源:國知局
      用于使用自體細胞系統(tǒng)從生殖系細胞離體產生有發(fā)育能力的卵的方法和組合物的制作方法
      【專利摘要】本技術提供用于多潛能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞向卵母細胞、顆粒細胞和/或顆粒前體細胞,即,“人造顆粒細胞”定向分化的方法。所述人造顆粒細胞可用在用于卵泡或卵泡樣結構和未成熟卵母細胞的生長和成熟的方法中。另外,所述人造顆粒細胞可用于在有需要的受試者中增加卵巢衍生的激素和生長因子的方法中。
      【專利說明】用于使用自體細胞系統(tǒng)從生殖系細胞離體產生有發(fā)育能力的卵的方法和組合物
      [0001]與相關申請的交叉引用
      本申請要求于2013年1月7日提交的美國臨時申請?zhí)?1 /887,569的優(yōu)先權,所述臨時申請的內容通過引用以其整體結合到本文中。
      [0002]政府支持
      本技術在國立衛(wèi)生研究院授予的基金R37-AG012279和F32-AG034809的美國政府支持下作出。政府在本技術中具有一定的權利。
      [0003]發(fā)明背景
      在美國大約7,000,000夫婦患有不育,然而,每年僅進行約150,000個體外受精(IVF)周期并且這些有限的數(shù)目反映一些夫婦在同一年中參加該程序兩次。有需要的那些和尋找不育的解決方案的那些之間的巨大下降(也就是說小于2%的不育夫婦實際上經受輔助生殖)是由于普遍高的不育治療費用之外的因素。值得注意地,許多婦女不被認為是IVF的“良好候選人”,這是因為她們將不能響應為了取卵用于抑制然后過度刺激卵巢的當前激素注射方案而產生卵。不被認為是IVF的良好候選人的婦女的實例包括在其卵巢中保留嚴重減少的未成熟卵細胞(卵母細胞)群的處于高齡產婦年齡(advanced maternal ages)的婦女或由于多種原因包括,但不限于,遺傳原因、免疫(自身免疫)異?;蛳惹氨┞队趽p傷卵巢的細胞毒治療而顯示卵巢早衰(POF)/過早的卵巢功能不全(POI)的婦女(例如進行癌癥治療的年輕女孩和育齡婦女)。
      [0004]卵巢衰竭,以及導致的絕經,由于卵巢卵泡喪失而發(fā)生,每一卵巢卵泡由稱為顆粒細胞的支持性體細胞圍繞的單個卵母細胞組成。除了用作卵巢中主要的內分泌生產結構之夕卜,還需要卵泡來支持被封入的卵母細胞的發(fā)育和成熟。無顆粒細胞支持,新形成的卵細胞將會迅速死亡。卵泡喪失下產類固醇的卵巢顆粒細胞出現(xiàn)生育力的喪失和減小的產類固醇激素能力,后者導致對婦女健康的深遠的有害作用,其不僅影響生殖器官和組織還影響骨骼、腦和心血管系統(tǒng),等等。凈結果為骨密度和認知功能隨年齡下降,以及心血管疾病(CVDs)增加,其為全世界婦女死亡的主要原因。
      [0005]發(fā)明概述
      在一個方面,本技術提供用于多能細胞向顆粒細胞和/或顆粒前體細胞定向分化的方法,所述方法包括:在將多能細胞定向至分化為顆粒細胞和/或顆粒前體細胞的培養(yǎng)條件中培養(yǎng)多能細胞,其中所述培養(yǎng)條件包括缺乏MEFs和LIF以及存在GSK抑制劑。
      [0006]在一些實施方案中,所述培養(yǎng)條件進一步包括存在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4)和/或視黃酸(RA)。
      [0007]在一些實施方案中,多能細胞包含顆粒細胞特異性受體,其中所述顆粒細胞特異性受體的表達指示為顆粒細胞或顆粒細胞前體的細胞。
      [0008]在一些實施方案中,所述GSK-3抑制劑選自SB216763、B10、CHIR99021、氯化鋰(LiCl)、馬來酰亞胺衍生物、星形孢菌素、吲哚衍生物、paullone衍生物、嘧啶和氟嘧啶衍生物、噁二唑衍生物、噻唑衍生物、雜環(huán)衍生物及其組合。
      [0009]在一些實施方案中,所述方法還包括使所述多能細胞與用于顆粒細胞特化的信號傳導通路的生長因子或激活劑接觸。
      [0010]在一些實施方案中,所述用于顆粒細胞特化的信號傳導通路的生長因子或激活劑為bFGF、Jaggedl或Jagged2的一種或多種。
      [0011]在另一個方面,本技術提供用于多能細胞向顆粒細胞和/或顆粒前體細胞定向分化的方法,所述方法包括:在將多能細胞定向為顆粒細胞和/或顆粒前體細胞的培養(yǎng)條件中培養(yǎng)多能細胞,其中所述條件包括缺乏MEFs和LIF以及存在GSK抑制劑,其中所述多能細胞經工程改造以包含一個或多個可誘導的顆粒細胞-特異性基因;誘導一個或多個卵巢顆粒細胞-特異性基因表達;和形成人造顆粒細胞。
      [0012]在一些實施方案中,所述方法還包括在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4)和/或視黃酸(RA)存在下培養(yǎng)多能細胞。
      [0013]在一些實施方案中,所述多能細胞包含顆粒細胞特異性受體,其中所述顆粒細胞特異性受體的表達指示為顆粒細胞或顆粒細胞前體的細胞。
      [0014]在一些實施方案中,所述一個或多個可誘導的顆粒細胞-特異性基因選自叉頭框L2(forkhead box L2) (Foxl2)、無翅型MMTV整合位點家族成員4 (WNT4)、Nr5al、Dax_l、ATP-結合盒亞家族9 (Abca9)、乙酰輔酶A?;D移酶2 (線粒體3_氧代?;?oxoacyl)-輔酶A硫解酶;Acaa2)、主動脈平滑肌肌動蛋白a2 (Acta2)、具有I型凝血酶基序的解聯(lián)蛋白-樣和金屬肽酶(reprolysin-樣)17 (Adamtsl7)、ADAMTS_樣2 (Adamtsl2)、AF4/FMR2家族成員I (Affl)、表達序列AI314831 (AI314831)、醛-酮還原酶家族I成員C14 (Akrlcl4)、醛-酮還原酶家族I %1^112和成員0樣(410'1(31)。
      [0015]在另一個方面,本技術提供離體人工卵巢環(huán)境,所述人工卵巢環(huán)境包括:人造顆粒細胞,其中所述人造顆粒細胞使用上述方法的任一產生;卵母細胞前體細胞;和卵巢組織。在一些實施方案中,所述人造顆粒細胞、所述卵母細胞前體細胞和卵巢組織為自體的。
      [0016]在另一個方面,本技術提供用于制造成熟卵泡和成熟卵母細胞的方法,所述方法包括:使用用于制備顆粒細胞和/或顆粒前體細胞的上述方法的任一使多能細胞定向分化為顆粒細胞和/或顆粒前體細胞(人造顆粒細胞);使人造顆粒細胞與卵母細胞前體細胞和卵巢組織組合;和在適合形成成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件下培養(yǎng)人造顆粒細胞與卵母細胞前體細胞和卵巢組織的組合。
      [0017]在一些實施方案中,所述適合形成成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件包括存在卵泡刺激激素(FSH)和/或促黃體激素(LH)。
      [0018]在另一個方面,本技術提供有需要的受試者的卵巢組織中卵泡和未成熟卵母細胞的生長和成熟,其包括使卵巢組織與顆粒細胞和/或顆粒前體細胞(人造顆粒細胞)接觸,其中所述人造顆粒細胞使用前述方法的任一產生。
      [0019]在一些實施方案中,人造顆粒細胞與卵巢組織在體內接觸。
      [0020]在一些實施方案中,將人造顆粒細胞直接注射入受試者的卵巢組織中。
      [0021]在一些實施方案中,所述有需要的受試者患有一種或多種以下問題,所述問題選自受孕困難、處于不育治療中、處于體外受精中、治療過癌癥和經受過細胞毒治療。
      [0022]在另一個方面,本技術提供用于增加有需要的受試者中的一種或多種卵巢衍生的激素或生長因子的水平的方法,所述方法包括:使多能細胞定向分化為顆粒細胞和/或顆粒前體細胞(人造顆粒細胞),其中所述人造顆粒細胞使用上述方法的任一產生;基于顆粒細胞特異性受體的表達分離富集的人造顆粒細胞群;和給予受試者有效量的富集的人造顆粒細胞群,其中所述顆粒細胞或顆粒細胞前體分泌一種或多種卵巢衍生的激素和生長因子,并且其中與給予富集的人造顆粒細胞群之前的受試者相比給予人造顆粒細胞之后受試者顯示提高的一種或多種卵巢衍生的激素或生長因子的水平。
      [0023]在一些實施方案中,所述方法還包括刺激人造顆粒細胞以分泌卵巢衍生的激素。
      [0024]在一些實施方案中,所述卵巢衍生的激素選自:雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和孕酮。
      [0025]在一些實施方案中,所述顆粒細胞或顆粒細胞前體用卵泡-刺激激素(FSH)、8-溴腺苷3’,5’_環(huán)單磷酸酯(8-br-cAMP)和促黃體激素(LH)刺激以分泌卵巢衍生的激素。
      [0026]在一些實施方案中,所述人造顆粒細胞群為受試者自體的。在一些實施方案中,所述受試者為人類。
      [0027]在另一個方面,本技術提供用于產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的離體方法,所述方法包括:組合人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織;和在足以產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件下培養(yǎng)人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織的組合,其中所述人造顆粒細胞使用上述方法的任一產生并且其中所述人造顆粒細胞、所述卵母細胞前體細胞和所述卵巢組織為自體的。
      [0028]在一些實施方案中,所述卵母細胞前體細胞衍生自多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞(OSCs)。在一些實施方案中,所述卵母細胞前體細胞為原始生殖細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞。
      [0029]在一些實施方案中,所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞經遺傳修飾以校正基因缺陷。在一些實施方案中所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞使用選自電穿孔、直接注射編碼mRNA、基于脂質的轉染、逆轉錄病毒轉導、腺病毒轉導、慢病毒轉導、CRISPR/Cas9、TALENs、鋅指核酸酶(ZFNs)、經工程改造的大范圍核酸酶和定點突變的一種或多種技術遺傳修飾。
      [0030]在一些實施方案中,本發(fā)明提供用于為診斷有遺傳疾病或病癥的受試者開發(fā)遺傳修飾的成熟卵母細胞的方法,包括:遺傳修飾來自受試者的多能細胞或卵母細胞前體細胞(例如,雌性生殖系干細胞或卵原干細胞s)以校正基因缺陷;在足以產生卵母細胞前體細胞的條件下培養(yǎng)所述經遺傳修飾的多能細胞;在無或有人造顆粒細胞下組合遺傳修飾的卵母細胞前體細胞與卵巢組織,其中,若使用,人造顆粒細胞使用上述方法的任一產生并且其中人造顆粒細胞,若使用,和卵巢組織為受試者自體的;和在足以產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件下培養(yǎng)卵母細胞前體細胞和卵巢組織,在無或有人造顆粒細胞下,的組合,其中所述成熟卵母細胞不攜帶遺傳疾病。
      [0031]在一些實施方案中,所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞使用選自電穿孔、直接注射編碼mRNA、基于脂質的轉染、逆轉錄病毒轉導、腺病毒轉導、慢病毒轉導、CRISPR/Cas9、TALENs、鋅指核酸酶(ZFNs)、經工程改造的大范圍核酸酶和定點突變的一種或多種技術遺傳修飾。
      [0032]在另一個方面,本技術提供在體外受精中使用的離體產生成熟卵母細胞的方法,所述方法包括組合人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織;和在足以產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件下培養(yǎng)人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織的組合,其中所述人造顆粒細胞使用上述方法的任一產生并且其中所述人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織為自體的。
      [0033]在一些實施方案中,所述卵母細胞前體細胞衍生自多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞。在一些實施方案中,所述卵母細胞前體細胞為原始生殖細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞。在一些實施方案中,所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞經遺傳修飾以校正基因缺陷。在一些實施方案中,所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞使用選自電穿孔、直接注射編碼mRNA、基于脂質的轉染、逆轉錄病毒轉導、腺病毒轉導、慢病毒轉導、CRISPR/Cas9、TALENs、鋅指核酸酶(ZFNs)、經工程改造的大范圍核酸酶和定點突變的一種或多種技術遺傳修飾。
      [0034]在一些實施方案中,所述方法還包括冷凍所述成熟卵母細胞。
      [0035]附圖簡述
      圖1A為顯示卵原干細胞(OSCs)在老齡小鼠卵巢中存留的圖。使用抗-Ddx4抗體與熒光-激活細胞分選(FACS)偶聯(lián)從C57B1/6小鼠卵巢分離生殖系干細胞(也稱為卵原干細胞或OSCs) (Woods 和 Tilly, Nature Protocols, 8:966-88 (2013)),其中小鼠在3、6、10、15和20個月的年齡范圍內。
      [0036]圖1B顯示在從圖1A的3-月齡和20-月齡雌性小鼠卵巢分離的OSCs的培養(yǎng)物中產生的未成熟卵母細胞的實例(對于方案,參見Woods和Tilly,Nature Protocols, 8:966-88(2013)),證實來自老齡雌性的OSCs仍能夠形成卵母細胞,盡管事實上其卵巢缺乏卵母細胞。
      [0037]圖2A-D為顯示老齡小鼠的OSCs喪失支持原始卵泡形成的能力的圖。分別在自殺基因激活和滅活后檢驗了具有可誘導的“自殺基因”(單純皰疹病毒胸苷激酶或HSVtk)的2-11個月范圍內的轉基因小鼠喪失和重獲其卵母細胞保留(reserves)的能力,所述“自殺基因”僅在HSVtk前藥更昔洛韋(GCV)存在下特異性中斷OSC向卵母細胞分化。
      [0038]圖3為顯示富集顆粒細胞的幼齡小鼠卵巢體細胞的卵巢內移植增加不再能夠使用其內源OSCs產生新卵母細胞和卵泡(參見圖2)的受體老齡小鼠(即,10-月大小鼠)中的原始卵泡池的圖。每對柱的左側柱為老齡模擬-移植的對照小鼠,每對柱的右側柱為接受幼齡卵巢組織-衍生細胞移植的老齡小鼠。反應代表可新形成的卵母細胞的最早階段的原始卵泡數(shù)目(柱所包圍的)的柱在圖的中心被放大(enhanced)。
      [0039]圖4A為顯示OSCs從絕經前(22-47歲)和絕經后(53和58歲)生命期二者期間的婦女的產率的圖表,證實OSCs在老齡人卵巢中仍然存在。
      [0040]圖4B為從培養(yǎng)的自絕經后(53歲)人卵巢皮質組織片段分離的OCSs體外產生的未成熟卵母細胞的圖片。
      [0041 ] 圖5A為顯示FACS-純化的陽性細胞(2 x 13細胞/孔)的雌二醇產生的圖,其在胚胎干細胞培養(yǎng)物中自發(fā)分化,在培養(yǎng)物中維持多達3天(FSH,100 ng/ml; 8-br-cAMP, I mM)。數(shù)據(jù)為3個獨立培養(yǎng)物的平均值土 SEM (*,與溶媒對照相比P < 0.05)。
      [0042] 圖5B為顯示FACS-純化的陽性細胞(2 x 13細胞/孔)的孕酮產生的圖,其在胚胎干細胞培養(yǎng)物中自發(fā)分化,在培養(yǎng)物中維持多達3天(FSH,100 ng/ml; 8-br-cAMP, I mM)。數(shù)據(jù)為3個獨立培養(yǎng)物的平均值土 SEM (*,與溶媒對照相比P < 0.05)。
      [0043]圖6A為顯示注射從分化12天后的ESC培養(yǎng)物分離的DsRed-表達細胞之前的野生型新生卵巢的圖像。
      [0044]圖6B為顯示注射從分化12天后的ESC培養(yǎng)物分離的DsRed-表達細胞之后的野生型新生卵巢的圖像。
      [0045]圖6C為顯示移植8天后卵巢間質(stroma)中存在DsRed-表達細胞的圖像(左);通過雙重免疫熒光,這些細胞經常與未成熟卵母細胞相關聯(lián),其通過卵母細胞標志Dazl的表達鑒定(綠色;右側面板)。
      [0046]圖6D為顯示移植14天時DsRed-表達細胞僅存在于生長卵泡的顆粒細胞層中的圖像。
      [0047]圖7A顯示在離體培養(yǎng)2周的人卵巢皮質條中通過光學顯微術可視化生長中的卵泡(直徑大約250微米;箭頭)。
      [0048]圖7B顯示離體培養(yǎng)14天后通過DDX4免疫熒光評估人卵巢皮質組織中的卵母細胞,其顯示許多原始和初級卵泡(左)和若干多層卵泡(右)。
      [0049]圖8A為描繪顆粒/卵丘細胞復合體中包含的卵母細胞體外成熟至完全成熟的中期II卵的速率的圖,其中所述顆粒/卵丘細胞-卵母細胞復合體初始從成年牛卵巢皮質片段中存在的未成熟竇前階段(直徑〈2 mm)卵泡,或更成熟的早期竇階段(直徑〉3 mm)卵泡收集(每組分析的卵母細胞的數(shù)目在各自的條上方顯示)。
      [0050]圖SB顯示成功地從自直徑小于2mm的卵泡收集的顆粒細胞-卵母細胞復合體徹底體外成熟的完全成熟中期II卵的圖像,其中伸出的第一極體可見(箭頭)。
      [0051 ]發(fā)明詳述
      上文引入和下文更詳細討論的各種概念可以以許多方式的任一實現(xiàn),因為所描述的概念不限于任何具體的實現(xiàn)方式。具體實現(xiàn)和應用的實例主要為說明性目的而提供。
      [0052]如本文所使用的,單數(shù)形式“一個”、“一種”或“所述”包括復數(shù)指示物,除非內容另有明確指示。例如,提及“一個細胞”包括兩個或多個細胞的組合,等。
      [0053]如本文所使用的,“約”將由本領域技術人員所理解并且將根據(jù)其使用的上下文而在一定程度上不同。如果使用了本領域技術人員不清楚的術語,給定其所使用的上下文,“約”將指至多該具體術語的正或負10%。
      [0054]如本文所使用的,“給予”受試者劑、藥物、化合物或細胞包括將劑、藥物、化合物或細胞引入或遞送至受試者以執(zhí)行其預期功能的任何途徑。給予可通過任何合適的途徑實施,包括,例如,局部注射(例如,導管給予或直接卵巢內注射)、全身性注射、靜脈內注射、子宮內注射、口服、鼻內和胃腸外給予。給予包括自身給予和由另一給予。
      [0055]如本文所使用的,“分化”指譜系定型的發(fā)育過程。“譜系”是指細胞發(fā)育的途徑,其中前體或“祖”細胞經歷漸進的生理變化以成為具有特征功能的特定細胞類型(例如,神經細胞、肌肉細胞或顆粒細胞)。分化按階段發(fā)生,借此細胞逐漸變得更特化直至達到它們完全成熟,其也稱為“終末分化” ο “終末分化細胞”為已經定型為特定譜系并且達到分化的最終階段的細胞(即,完全成熟的細胞)。卵母細胞為終末分化細胞類型的一個實例。
      [0056]如本文所使用的,術語“有效量”或“治療有效量”指適合達到期需作用的量,例如,將例如,提高有需要的受試者中卵巢衍生的激素和生長因子水平或支持卵母細胞前體細胞分化為卵母細胞的顆粒細胞,例如,人造顆粒細胞的量。舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,治療有效量的顆粒細胞為升高受試者的卵巢衍生的激素和/或生長因子水平所需要的顆粒細胞的量。在激素治療應用的背景中,在一些實施方案中,給予受試者的顆粒細胞或顆粒細胞前體的量將取決于受試者的病況或疾病狀態(tài),例如,絕經的受試者或做過子宮切除術的受試者,以及取決于受試者的特征,例如一般健康、年齡、性別、體重和藥物耐受性。技術人員將能夠根據(jù)這些和其它因素確定適當?shù)膭┝俊?br>[0057]如本文所使用的,術語“富集的群”指純化或半純化的細胞群,例如顆粒細胞或顆粒細胞前體(例如,人造顆粒細胞)。在一些實施方案中,特定的顆粒細胞或顆粒細胞前體群通過從分化多能細胞的群分選顆粒細胞或顆粒細胞前體,例如通過熒光激活細胞分選(FACS)、磁輔助細胞分選(MACS)或本領域已知的用于從一般細胞群分離特定細胞群的其它細胞純化策略來富集。以舉例而非限制的方式,在一些實施方案中,富集的顆粒細胞或顆粒細胞前體群為已經通過FACS從分化多能細胞分離的純化或半純化的顆粒細胞或顆粒細胞前體群。
      [0058]如本文所使用的,“卵泡”指包含體(無或由膜-間質的顆粒)細胞圍繞的單個卵母細胞的卵巢結構。每一完全成形的卵泡被包封在完整的基膜中。盡管這些新形成的卵泡中的一些幾乎立即開始生長,但其大部分保持在靜止期直至它們退化或一些信號激活它們進入生長期。
      [0059]如本文所使用的,術語“未成熟卵母細胞”指停止在前期I的初級卵母細胞。
      [0060]如本文所使用的,術語“成熟卵泡”指具有活躍增殖的圍繞發(fā)育中的卵母細胞的顆粒細胞的卵泡,其響應外源激素,特別地促性腺激素(卵泡-刺激激素或FSH,和促黃體激素或LH)。舉例來說,而非限制,由于重新開始減數(shù)分裂之后顆粒細胞增殖、卵母細胞膨脹和/或由于充滿流體的竇的發(fā)育,成熟或成熟中的卵泡尺寸增加。
      [0061]如本文所使用的,術語“成熟卵母細胞”(也稱為卵)指停止在減數(shù)分裂的中期II的能夠在精子穿入之后受精或通過加入鈣離子載體激活孤雌生殖的卵母細胞。
      [0062]如本文所使用的,術語“顆粒刺激劑”指刺激顆粒細胞或顆粒細胞前體分泌卵巢衍生的激素,例如,雌二醇或孕酮,和生長因子的任何化合物、激素、肽、藥物或其它劑。舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,顆粒刺激劑包括但不限于卵泡刺激激素(FSH)和8-溴腺苷3,,5 環(huán)單磷酸酯(8-br-cAMP)。
      [0063]如本文所使用的,術語“受試者”、“個體”或“患者”可為個體生物、脊椎動物、哺乳動物或人。
      [0064]如本文所使用的,術語“人工顆?!敝钢辽俨糠稚蠌亩嗄芗毎亩ㄏ蚍只w外產生的顆粒細胞和/或顆粒前體細胞。
      [0065]通常(General)
      研究顯示小鼠胚胎干細胞(ESCs)和誘導的多潛能干細胞(iPSCs)可分化為能夠受精、胚胎發(fā)生和分娩可存活后代的卵母細胞,雖然是以低頻率。Hayashi等人,Science 338:971-975 (2012)。這些研究還證明在分化的ESCs或iPSCs的培養(yǎng)物中自發(fā)出現(xiàn)的并且與胎兒生殖腺中的內源原始生殖細胞(PGCs)類似的原始生殖細胞(PGC)-樣細胞(PGCLCs)需要與發(fā)育匹配的胚胎卵巢體細胞相互作用以實現(xiàn)它們在體內的全部潛能。為了提供卵子發(fā)生、卵泡發(fā)生和最終從PGCLCs形成卵所必需的微環(huán)境提示,需要發(fā)育匹配的卵巢體細胞源。
      [0066]小鼠ESCs體外形成的卵泡樣結構包含單個卵母細胞-樣細胞,其可生長至直徑70μπι大,被一層或多層緊密附著的一定程度上與卵巢顆粒細胞類似的體細胞圍繞。Hubner等A, Science 300: 1251-1256 (2003)。類似于卵巢中正常卵泡形成期間所觀察到的,ESC-衍生的卵泡樣結構中的體細胞經由胞間橋與它們包封的生殖細胞連接,這可用于促進正常卵泡發(fā)育所需的細胞與細胞相互作用。另外,增加的類固醇生成途徑基因的表達,以及雌激素分泌入培養(yǎng)基,伴隨體外卵泡樣結構從ESC形成而發(fā)生。盡管這些觀察共同支持以下觀念:體外-衍生的卵泡樣結構的體細胞具有與內源顆粒細胞超結構和功能上相似的特征,從分化ESCs分離和表征這些細胞是困難的。
      [0067]卵巢衰竭和由此導致的絕經由于卵巢卵泡的喪失而發(fā)生,所述卵泡是卵巢中主要的內分泌產生結構。卵泡喪失下,產類固醇的卵巢顆粒細胞出現(xiàn)減小的產類固醇激素的能力,導致對婦女健康的深遠的有害作用,這不僅影響生殖器官和組織還影響骨骼、腦和心血管系統(tǒng)。凈結果為骨密度和認知功能隨年齡下降,以及心血管疾病(CVDs)增加,其為全世界婦女死亡的主要原因。當前,使用絕經期激素治療(MHT,先前稱為激素替代治療,或HRT)來暫時抵消伴隨絕經的一些癥狀,但MHT帶來許多證據(jù)充分的警告和健康風險。因此,可以與下丘腦生殖腺軸合作工作的從干細胞產生產類固醇的卵巢顆粒細胞的策略可填充當前對卵巢衰竭和絕經的管理的關鍵空白。
      [0068]已經發(fā)表了在體外重演卵巢-樣環(huán)境的嘗試。使用3-維(3-D)體外成熟(IVM)培養(yǎng)系統(tǒng),已經證明組合三種卵泡亞型(例如,膜、顆粒和卵母細胞)創(chuàng)建支持人卵母細胞成熟的“人工”卵巢-或卵泡-樣環(huán)境。在小鼠、大鼠和靈長類中報道了相似的卵泡培養(yǎng)策略,其中離體卵泡發(fā)育導致卵母細胞成熟。然后,在MHT中的潛在效用最近才被探索。借鑒先前對卵巢卵泡培養(yǎng)物使用3-D藻酸鹽包封的工作,一些數(shù)據(jù)表明從小鼠卵巢獲得的膜和顆粒細胞的多層共培養(yǎng)物可以在體外維持至少一個月。在這段時間,包封的共培養(yǎng)物以與天然卵泡相似的能力發(fā)揮功能,這通過雌二醇和孕酮的合成以及促性腺激素刺激后抑制素的分泌證明。考慮到MHT最明顯的缺點是缺乏下丘腦-垂體-性腺(HPG)軸所有組分之間的通訊,促進內分泌功能的基于細胞或組織的策略具有真正避開該問題的潛能。然而,當前可用于這種治療的細胞源有限,因為需要這種治療的患者具有很少甚至沒有顆?;蚰ぜ毎?br>[0069]本技術提供一種改善的用于通過使用產生顆粒和/或顆粒前體細胞的基于多能細胞的方法重演人工卵巢環(huán)境的方法。一般而言,本技術涉及用于多能細胞向顆粒和/或顆粒前體細胞定向分化的方法。另外,本技術涉及通過多能細胞的定向分化產生的顆粒和/或顆粒前體細胞的用途。
      [0070]用于多能細胞向顆粒細胞和/或顆粒前體細胞定向分化的方法
      在一些實施方案中,用于多能細胞向顆粒和/或顆粒前體細胞(后文“人造顆粒細胞”)定向分化的方法包括在適合多能細胞向人造顆粒細胞分化的條件中培養(yǎng)多能細胞。
      [0071]在一些實施方案中,適合多能細胞向人造顆粒細胞分化的條件包括但不限于,通過差異性貼壁從有絲分裂-失活的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養(yǎng)層分離多能細胞(例如,胚胎干細胞)并在白血病抑制因子(LIF)缺乏下培養(yǎng)多能細胞。在一些實施方案中,從MEF飼養(yǎng)層取下后將多能細胞以單層鋪板在明膠-包覆的板上。在一些實施方案中,多能細胞在LIF缺乏下用15% FBS培養(yǎng)。
      [0072]另外,或替代地,在一些實施方案中,用于多能細胞向人造顆粒細胞分化的合適條件包括,但不限于,將多能細胞與中胚層-指定劑(specifying agents)例如糖原合成酶激酶-3 (GSK3)抑制劑、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4; 1-1,000 ng/ml)、視黃酸(RA; 0.001-10 μ
      Μ)或其組合接觸。
      [0073]舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,GSK_3抑制劑包括,但不限于,SB216763(1-20 μΜ)、ΒΙ0 (0.1-10 μΜ )、CHIR99021 (0.1-10 μΜ )、氯化鋰(LiCl)、馬來酰亞胺衍生物、星形孢菌素、吲哚衍生物、paul lone衍生物、嘧啶和氟嘧啶衍生物、噁二唑衍生物、噻唑衍生物和雜環(huán)衍生物。
      [0074]在一些實施方案中,使所述多能細胞與用于顆粒細胞特化的信號傳導通路的生長因子或激活劑接觸以定向多能細胞向人造顆粒細胞分化。用于顆粒細胞特化的信號傳導通路的生長因子或激活劑包括,但不限于bFGF或Notch信號傳導通路的激活劑,例如Jaggedl或Jagged2。
      [0075]在一些實施方案中,用于多能細胞向人造顆粒細胞定向分化的方法為分步方法,包括:
      步驟I)在MEFs和LIF缺乏以及至少一種GSK-3抑制劑存在下培養(yǎng)單層多能細胞;和步驟2)向培養(yǎng)基中添加BMP4和/或RA。
      [0076]在一些實施方案中,所述多能細胞在步驟I中培養(yǎng)約I小時-48小時、約4小時-44小時、約8小時-40小時、約12小時-36小時、約16小時-32小時、約20小時-28小時或約22小時-26小時。在一些實施方案中,所述多能細胞在步驟I中培養(yǎng)約24小時。
      [0077]在一些實施方案中,所述多能細胞在步驟2中用BMP4和/或RA孵育約I小時-48小時、約4小時-44小時、約8小時-40小時、約12小時-36小時、約16小時-32小時、約20小時-28小時或約22小時-26小時。在一些實施方案中所述多能細胞在步驟2中用BMP4和/或RA孵育約24小時。
      [0078]在一些實施方案中,所述多能細胞經工程改造以表達一個或多個指定顆粒細胞和/或顆粒細胞前體的基因。在一些實施方案中,所述一種基因或多種基因為可誘導的。在一些實施方案中,指定顆粒細胞和/或顆粒細胞前體的一種基因或多種基因的誘導定向多能細胞向人造顆粒細胞分化。
      [0079]舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,指定顆粒細胞和/或顆粒細胞前體(例如,為用于和/或引起向這些細胞分化的生物標志)的基因包括,但不限于,叉頭框L2(Foxl2)、無翅型MMTV整合位點家族成員4 (WNT4)、Nr5al、Dax_l、ATP_結合盒亞家族9(Abca9)、乙酰輔酶A?;D移酶2 (線粒體3_氧代?;?輔酶A硫解酶;Acaa2)、主動脈平滑肌肌動蛋白a2 (Acta2)、具有I型凝血酶基序的解聯(lián)蛋白-樣和金屬肽酶(reprolysin-樣)17 (Adamtsl7)、ADAMTS-樣 2 (Adamtsl2)、AF4/FMR2 家族成員 I (Affl)、表達序列 AI314831(AI314831)、醛-酮還原酶家族I成員C14 (Akrlcl4)、醛-酮還原酶家族I Notch2和成員C-樣(Akrlcl) ο
      [0080]可通過本領域已知的任何方法實現(xiàn)多能細胞的工程改造以包含一個或多個指定顆粒細胞和/或顆粒細胞前體的基因。舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,通過使用選自電穿孔、病毒轉導、陽離子脂質體轉染、基于多組分脂質的轉染、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖和直接遞送的技術將所述一個或多個指定顆粒細胞和/或顆粒細胞前體的基因插入多能細胞中。
      [0081]在一些實施方案中,多能細胞經工程改造以包含至少一個顆粒細胞特異性基因報道分子,其中顆粒細胞特異性基因報道分子的表達指示為顆粒細胞或顆粒細胞前體的細胞。
      [0082]在一些實施方案中,所述顆粒細胞特異性報道分子包括在顆粒細胞-特異性基因調節(jié)控制下的熒光報道分子。在一些實施方案中,控制顆粒細胞特異性報道的顆粒細胞-特異性基因為在多能細胞中可誘導表達的同一基因。
      [0083]卵巢顆粒細胞-特異性基因包括,但不限于,叉頭框L2(Foxl2)、無翅型MMTV整合位點家族成員4 (WNT4)、Nr5al、Dax-l、ATP-結合盒亞家族9 (Abca9)、乙酰輔酶A?;D移酶2 (線粒體3-氧代?;?輔酶A硫解酶;Acaa2)、主動脈平滑肌肌動蛋白a2 (Acta2)、具有I型凝血酶基序的解聯(lián)蛋白-樣和金屬肽酶(reprolysin-樣)17 (Adamts 17)、ADAMTS_樣2(Adamtsl2)、AF4/FMR2 家族成員 I (Affl)、表達序列 AI314831 (AI314831)、醛-酮還原酶家族I成員C14 (Akrlcl4)、醛-酮還原酶家族I 1'101:(3112和成員0樣(厶10'1(31)。
      [0084]熒光報道分子包括,但不限于,Discosoma sp.紅(DsRed)、綠色熒光蛋白(GFP)、黃色熒光蛋白(YFP)和橙色熒光蛋白(OFP)。
      [0085]在一些實施方案中,所述顆粒細胞特異性報道分子為在顆粒細胞-特異性基因調節(jié)控制下的非熒光報道分子。非-熒光報道分子包括,但不限于,熒光素酶和半乳糖苷酶。
      [0086]顆粒細胞特異性報道分子可通過本領域已知的任何方法工程改造。舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,通過鑒定顆粒細胞特異性基因啟動子、確定基因啟動子的保守區(qū)、使用PCR從基因組DNA分離保守區(qū)和將保守區(qū)克隆入包含熒光標志的載體來工程改造顆粒細胞特異性報道分子。
      [0087]可通過本領域已知的任何方法實現(xiàn)多能細胞的工程改造以包含顆粒細胞特異性基因報道分子。舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,通過使用選自電穿孔、病毒轉導、陽離子脂質體轉染、基于多組分脂質的轉染、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖和直接遞送的技術將所述顆粒細胞特異性基因報道分子插入多能細胞中。
      [0088]在一些實施方案中,用于多能細胞向人造顆粒細胞定向分化的方法包括上述適當培養(yǎng)條件的任一和上述經工程改造的多能細胞的組合。舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,用于多能細胞向人造顆粒細胞定向分化的方法包括在包括缺乏MEFs和LIF和存在GSK抑制劑的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)多能細胞,其中所述多能細胞經工程改造表達一個或多個指定顆粒細胞和/或顆粒細胞前體的基因,誘導所述一個或多個指定顆粒細胞和/或顆粒細胞前體的基因表達,從而導致人造顆粒細胞形成。
      [0089]在一些實施方案中,誘導多能細胞群分化后,鑒定和分離人造顆粒細胞。在一些實施方案中,通過在顆粒細胞-特異性基因控制下的熒光標志的表達鑒定人造顆粒細胞。在一些實施方案中,通過用FACS、基于抗體的免疫磁性分選(例如,磁輔助細胞分選(MACS))、差異性貼壁、克隆選擇和擴充或抗生素抗性形成富集的人造顆粒細胞前體群分離人造顆粒細胞。
      [0090]在一些實施方案中,使用顆粒細胞或顆粒細胞前體選擇性或特異性的細胞表面標志分離人造顆粒細胞。顆粒細胞或顆粒細胞前體選擇性或特異性的細胞表面標志的實例包括,但不限于抗-Mill Ierian激素受體和Notch受體(Notch2)。
      [0091]在一些實施方案中,多能細胞包括,但不限于,胚胎干細胞(ESCs)、多潛能干細胞、極小胚胎樣(VSEL)細胞、誘導多潛能干細胞(iPSCs)或以其它方式重新編程的體細胞、皮膚細胞、骨髓衍生細胞和外周血衍生細胞。
      [0092]所述多能細胞可為任何哺乳動物多能細胞。多能細胞可來源于的哺乳動物包括,例如,農場動物,例如綿羊、豬、奶牛和馬;寵物,例如狗和貓;實驗室動物,例如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些實施方案中,所述哺乳動物為人。
      [0093]用于卵巢組織中卵泡和未成熟卵母細胞的生長和成熟的方法
      在一些實施方案中,使用人造顆粒細胞(即,通過上述方法產生的顆粒細胞和/或顆粒細胞前體)促進卵巢組織中卵泡、卵泡樣結構和/或卵母細胞的生長和成熟。
      [0094]在一些實施方案中,使卵巢組織與人造顆粒細胞群接觸,其中人造顆粒細胞促進卵巢組織中卵泡、卵泡樣結構和/或未成熟卵母細胞的生長和成熟。在一些實施方案中,與卵巢組織接觸之后,人造顆粒細胞向卵巢組織中的卵泡、卵泡樣結構和/或未成熟卵母細胞或卵母細胞前體細胞迀移以產生誘導卵泡和/或卵母細胞成熟的卵巢體環(huán)境。
      [0095]在一些實施方案中,卵巢組織與人造顆粒細胞在體內接觸。在一些實施方案中,體內給予包括,但不限于,局部注射(例如,導管給予或直接卵巢內注射)、全身性注射、靜脈內注射、子宮內注射和胃腸外給予。在一些實施方案中,給予有需要的受試者所述人造顆粒。
      [0096]舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,有需要的受試者為受孕困難、處于不育治療中、處于體外受精中、治療過癌癥和經受過細胞毒治療(例如,化學治療或放射治療)或其組合的受試者。
      [0097]在一些實施方案中,卵巢組織與人造顆粒細胞離體接觸。在一些實施方案中,離體接觸包括,但不限于與完整的或離解的取出的卵巢組織聚集,和與卵巢組織共培養(yǎng)。在一些實施方案中,培養(yǎng)所述接觸的離體卵巢組織,然后移植或植入受試者的卵巢或周圍組織中。用于移植或植入的方法包括,但不限于,移入(engraftment)卵巢上、切開卵巢之后將組織注射或移入卵巢中和移入輸卵管中。
      [0098]在一些實施方案中,例如,在卵泡和/或卵母細胞生長和成熟后,將離體接觸人造顆粒細胞的卵巢組織冷凍并儲存。
      [0099]卵巢組織可為任何哺乳動物卵巢組織。卵巢組織可來源于的哺乳動物包括,例如,農場動物,例如綿羊、豬、奶牛和馬;寵物,例如狗和貓;實驗室動物,例如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些實施方案中,所述哺乳動物為人。
      [0100]在一些實施方案中,所述人造顆粒細胞和卵巢組織為自體的(來自同一個體)。在一些實施方案中,所述人造顆粒細胞和卵巢組織為異源的(同種異體的,來自不同個體)。
      [0101]在一些實施方案中,人造顆粒細胞對卵巢組織中卵泡、卵泡樣結構和/或未成熟卵母細胞或卵母細胞前體的生長和成熟的促進通過卵泡直徑的增加、顆粒細胞數(shù)目的增加、類固醇激素產生的增加、卵母細胞直徑的增加或其組合測量。
      [0102]成熟卵泡或卵母細胞的直徑因物種而異并且可由本領域技術人員鑒定,因為特定物種的成熟卵泡大小為本領域普遍知道的。舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,指示成熟或成熟中的卵泡的人卵泡的卵泡直徑為大于約30 μπι的直徑?;蛘?,或此外,指示成熟或成熟中的卵泡的人卵泡的卵泡直徑為約30 μπι-10,000 μπι、約50 μπι-5000 μπι、約100 μπι-2000 μπι、約200 μπι-1000 μπι、約300 μπι-900 μπι、約400 μπι-800 μπι或約500 μπι-700 μπι的直徑。
      [0103]舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,指示成熟或成熟中的卵母細胞的人卵母細胞的卵母細胞直徑為大于約10 μπι的直徑?;蛘撸虼送?,指示成熟或成熟中的卵母細胞的人卵泡中所包含的卵母細胞的直徑為約10 μπ?-200 μπκ或約20 μπ?-175 μπκ或約30 μ??-150 ym、或約40 μηι-125 ym、或約50 μπι-100 ym、或約60 μηι-75 μπι的直徑。
      [0104]在一些實施方案中,卵巢組織中顆粒細胞數(shù)目的增加通過比較與人造顆粒細胞接觸之前卵巢組織中的顆粒細胞數(shù)目和與人造顆粒細胞接觸之后卵巢組織中的顆粒細胞數(shù)目來測量。或者,或此外,卵巢組織中顆粒細胞數(shù)目的增加通過將與人造顆粒細胞接觸之后卵巢組織中的顆粒細胞數(shù)目和未與人造顆粒細胞接觸的年齡匹配的卵巢組織比較來測量。
      [0105]在一些實施方案中,與人造顆粒細胞接觸的卵巢組織中顆粒細胞數(shù)目的增加測量為與,例如,與人造顆粒細胞接觸之前的卵巢組織或未與人造顆粒細胞接觸的年齡匹配的卵巢組織相比約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的百分比增加或這些值中任意兩個之間的百分比增加。
      [0106]通過人造顆粒細胞與卵巢組織接觸產生的類固醇激素包括,但不限于,雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和孕酮。在一些實施方案中,與人造顆粒細胞接觸的卵巢組織中產生的類固醇激素的增加測量為與,例如,與人造顆粒細胞接觸之前的卵巢組織或未與人造顆粒細胞接觸的年齡匹配的卵巢組織相比約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的百分比增加或這些值中任意兩個之間的百分比增加。
      [0107]用于產生包含成熟卵母細胞的成熟卵泡的離體和體內系統(tǒng)和方法離體和體內系統(tǒng)
      在一些實施方案中,用于產生產生包含成熟卵母細胞的成熟卵泡的離體或體內人工卵巢環(huán)境的系統(tǒng)包括人造顆粒細胞(即,上述從多能細胞定向分化工程改造的顆粒細胞和/或顆粒前體細胞的任一)、卵母細胞前體細胞和卵巢組織。在一些實施方案中,所述人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織為自體的。在一些實施方案中,所述人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織為異源同種異體的。
      [0108]在一些實施方案中,所述卵母細胞前體細胞從多能細胞或產卵母細胞的生殖系細胞工程改造。在一些實施方案中,用于產生卵母細胞前體細胞或卵母細胞的多能細胞包括,但不限于,胚胎干細胞(ESCs)、多潛能干細胞、誘導多潛能干細胞(iPSCs)或以其它方式重新編程的體細胞、極小胚胎樣(VSEL)細胞、皮膚細胞、骨髓衍生細胞和外周血衍生細胞。在一些實施方案中,所述產卵母細胞的生殖系細胞包括,但不限于,原始生殖細胞、雌性生殖系干細胞(fGSCs)或卵原干細胞(OSCs)。從多能細胞或產卵母細胞的生殖系細胞工程改造卵母細胞前體可使用本領域普遍知道的任何方法進行。參見,例如,Hayashi等人,5fcie/3ce,338: 971-975 (2012) ;White等人,#aiure #ec/ici/3e 2012 18: 413-421(2012)。
      [0109]在一些實施方案中,所述卵母細胞前體細胞包含至少一種遺傳修飾。在一些實施方案中,所述遺傳修飾發(fā)生在多能細胞中。在另一個實施方案中,所述遺傳修飾發(fā)生在產卵母細胞的生殖系細胞中。不希望受理論束縛,多能細胞或產卵母細胞的生殖系細胞中的遺傳修飾在整個分化中維持,因此結果是為遺傳修飾的攜帶者的卵母細胞前體和/或最終地卵母細胞。在又一個實施方案中,所述遺傳修飾發(fā)生在卵母細胞-前體細胞中。
      [0110]多能細胞、產卵母細胞的生殖系細胞或卵母細胞-前體細胞的遺傳修飾可通過本領域普遍使用的一種或多種技術進行。舉例來說,而非限制,基因修飾技術包括,但不限于,電穿孔、直接注射編碼mRNA、基于脂質的轉染、逆轉錄病毒轉導、腺病毒轉導、慢病毒轉導、CRISPR/Cas9、TALENs、鋅指核酸酶(ZFNs)、經工程改造的大范圍核酸酶和定點突變。參見,例如,Shao等人,iure Pro1cols, 9(10): 2493-2512 (2014年9月25 日),Kato等人,Scientific Reports (2013年 11 月5日),和Yang等人,7Vait/_re Protocols, 9(8): 1956-1968 (2014年7月24日)。
      [0111]在一些實施方案中,所述遺傳修飾導致由于遺傳或表觀遺傳改變而減少或缺失的一個或多個丟失基因(或基因產物)恢復表達和/或校正現(xiàn)存基因突變或缺失。在一些實施方案中,丟失基因或減少或缺失的基因,或具有突變或缺失的基因,導致?lián)p傷或其它方面的負面影響生育結果相關的一個或多個事件,其包括,但不限于,受精、胚胎形成、胚胎發(fā)育、胚胎植入、胚胎妊娠至足月和/或無造成疾病或病癥發(fā)作或易感性的基因突變(例如,功能的喪失或獲得)的后代出生。在一些實施方案中,遺傳修飾導致期需基因表達。
      [0112]在一些實施方案中,人工卵巢環(huán)境系統(tǒng)離體形成和維持。在一些實施方案中,人工卵巢環(huán)境系統(tǒng)在體內形成和維持。
      [0113]用于在離體或體內系統(tǒng)中制造成熟卵泡和成熟卵母細胞的方法
      在一些實施方案中,通過在適合產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件下組合人造顆粒細胞(通過上述方法的任一制造)、卵母細胞前體細胞(通過上述方法的任一制造)和卵巢組織制造離體人工卵巢環(huán)境??墒褂萌魏斡糜谥圃祀x體人工卵巢環(huán)境或使未成熟卵泡和卵母細胞成熟為成熟卵泡和卵母細胞的已知的方法和合適條件。參見,例如,Shea和Woodruff,WO 2007/075796; Albertini^PAkkoyunlu, Methods in Enzymology 426: 107-121(2010); Jin等人,F(xiàn)ertiI Steril 93:2633-2639 (2010); White等}^,Nature Medicine18:413-421 (2012); Telfer和MacLaughlin, Int JDev B1l 56:901-907 (2012)。
      [0114]在一些實施方案中,適合產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件包括存在生長因子。可用于產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的生長因子包括,但不限于,抑制素、激活素、GDF9、BMP15、IGF-1、胰島素、亞砸酸鹽和轉鐵蛋白。
      [0115]或者,或此外,在一些實施方案中,適合產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件包括存在激素。可用于產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的激素包括,但不限于,卵泡刺激激素(FSH)和促黃體激素(LH)。
      [0116]在一些實施方案中,將離體人工卵巢環(huán)境中產生的成熟卵泡和/或成熟卵母細胞注射、轉移或以其它方式遞送回受試者。
      [0117]在一些實施方案中,離體人工卵巢環(huán)境中產生的成熟卵母細胞經受體外受精。在一些實施方案中,將在本技術的離體人工卵巢環(huán)境中所產生的體外受精的成熟卵母細胞注射、轉移或以其它方式遞送回受試者
      在一些實施方案中,將離體人工卵巢環(huán)境中產生的成熟卵泡和/或成熟卵母細胞冷凍以供將來使用。在一些實施方案中,將在本技術的離體人工卵巢環(huán)境中所產生的體外受精成熟卵母細胞冷凍以供將來使用。
      [0118]在一些實施方案中,通過將人造顆粒細胞(通過上述方法的任一制造)和卵母細胞前體細胞(通過上述方法的任一制造)注射入受試者的卵巢組織制造體內人工卵巢環(huán)境。
      [0119]在一些實施方案中,所述受試者為哺乳動物。哺乳動物受試者包括,但不限于,農場動物,例如綿羊、豬、奶牛和馬;寵物,例如狗和貓;實驗室動物,例如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些實施方案中,所述哺乳動物為人。
      [0120]在一些實施方案中,在上述離體或體內系統(tǒng)中發(fā)育的成熟卵泡和/或成熟卵母細胞的用途為可用于提高生育力。
      [0121]在一些實施方案中,在上述離體或體內系統(tǒng)中發(fā)育的成熟卵泡和/或成熟卵母細胞的用途為可用于減少遺傳疾病和/或病癥的遺傳和/或用于減少疾病或病癥的攜帶者流行。
      [0122]在一些實施方案中,在上述離體或體內系統(tǒng)中發(fā)育的成熟卵泡和/或成熟卵母細胞的用途為可用作經歷體外受精的雌性受試者的一個選擇。
      [0123]在一些實施方案中,在上述離體或體內系統(tǒng)中發(fā)育的成熟卵泡和/或成熟卵母細胞的用途為可用作治療過癌癥或經受過細胞毒治療,例如化學治療、放射治療或二者的雌性受試者提高體外受精的一個選擇。
      [0124]在一些實施方案中,遺傳修飾的卵母細胞前體細胞(如上文所述)僅與卵巢組織組合并在適合產生成熟卵泡和/或成熟卵母細胞的條件下離體培養(yǎng)。在一些實施方案中,將成熟卵母細胞冷凍以供后續(xù)使用,例如,IVF。在一些實施方案中,成熟卵母細胞不再攜帶遺傳缺陷或表達期需基因。
      [0125]用于增加受試者中卵巢衍生激素和生長因子的方法
      在一些實施方案中,給予受試者有效量的人造顆粒細胞(即,上述從多能細胞的定向分化工程改造的顆粒細胞和/或顆粒前體細胞的任一)以增加卵巢-衍生激素和生長因子。
      [0126]在一些實施方案中,人造顆粒細胞分泌卵巢-衍生激素和生長因子。或者,或此外,在一些實施方案中,人造顆粒細胞經一種或多種顆粒刺激劑刺激而分泌卵巢-衍生激素和生長因子。
      [0127]人造顆粒細胞分泌的卵巢-衍生激素包括,但不限于,雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和孕酮。人造顆粒細胞分泌的卵巢-衍生生長因子包括,但不限于,激活素和抑制素。
      [0128]在一些實施方案中,在給予受試者之前刺激人造顆粒細胞,S卩,離體刺激人造顆粒細胞以分泌卵巢衍生激素和生長因子。在一些實施方案中,在給予受試者之后刺激人造顆粒細胞,即,體內刺激人造顆粒細胞以分泌卵巢-衍生激素和生長因子。
      [0129]顆粒刺激劑包括,但不限于,卵泡-刺激激素(FSH)、8_溴腺苷3’,5 ’ -環(huán)單磷酸酯(8-br-cAMP)和促黃體激素(LH)。
      [0130]在一些實施方案中,人造顆粒細胞為受試者自體的(例如,衍生自受試者自身的多能細胞)。在一些實施方案中,人造顆粒細胞為受試者異源的(例如,衍生自另一個體的多能細胞)。
      [0131 ]在一些實施方案中,受試者患有卵巢-衍生激素和生長因子分泌減少或缺乏。在一些實施方案中,卵巢-衍生激素和生長因子分泌減少或缺乏因絕經、卵巢切除術、子宮切除術、卵巢早衰、原發(fā)性卵巢功能不全、化學治療-誘導的卵巢衰竭和/或特納綜合征所致。
      [0132]在一些實施方案中,有需要的受試者中卵巢-衍生激素和生長因子的增加基于給予人造顆粒細胞之前受試者中的卵巢-衍生激素和生長因子水平與給予人造顆粒細胞之后受試者中的卵巢-衍生激素和生長因子水平之間的比較。
      [0133]在一些實施方案中,受試者中卵巢-衍生激素和生長因子的增加基于同與受治療的受試者性別和年齡匹配的并且未給予顆粒細胞或顆粒細胞前體的受試者中的卵巢-衍生激素和生長因子水平相比的給予人造顆粒細胞之后受試者中的卵巢-衍生激素和生長因子水平。
      [0134]在一些實施方案中,給予顆粒細胞或顆粒細胞前體的受試者中產生的卵巢-衍生激素和生長因子的增加測量為與,例如,與人造顆粒細胞接觸之前的受試者或未給予人造顆粒細胞的性別和年齡匹配的受試者相比約1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的百分比增加或這些值中任意兩個之間的百分比增加。
      [0135]臨床前試驗和臨床試驗期間可通過醫(yī)師和臨床醫(yī)師熟悉的方法確定人造顆粒細胞的有效量。可通過許多用于給予細胞的周知方法中的任一種給予有需要的受試者可用在本方法中的有效量的人造顆粒細胞。劑量和/或用量方案將取決于正在治療的病況的特性,例如,受試者處于絕經期或是受試者做過子宮切除術,受試者,和受試者的歷史。
      [0136]可使用本領域技術人員已知的用于給予細胞作為療法的任何方法。在一些實施方案中,人造顆粒細胞通過,例如,局部注射(例如,導管給予或直接卵巢內注射)、全身性注射、靜脈內注射、子宮內注射和胃腸外給予來給予受試者。舉例來說,而非限制,在一些實施方案中,將人造顆粒細胞前體直接注射入卵巢組織或卵巢中。
      [0137]在一些實施方案中,受試者為哺乳動物。哺乳動物受試者包括,但不限于,農場動物,例如綿羊、豬、奶牛和馬;寵物,例如狗和貓;實驗室動物,例如大鼠、小鼠、猴和兔。在一些實施方案中,所述哺乳動物為人。
      實施例
      [0138]本實施例為本技術的使用的非限制性實現(xiàn)。
      [0139]實施例1.老齡小鼠的卵巢中余留卵原干細胞(OSCs)
      該實施例顯示老齡(即,10個月或更大)小鼠的卵巢中余留卵原干細胞,本發(fā)明卵母細胞前體細胞的一個源。
      [0140]材料與方法
      用于流式細胞術的卵巢離解和制備oods^l ,Nature Protocols 8:966-988(2013)。將C57B1/6小鼠安樂死,摘除卵巢(每個年齡組4個卵巢)并放置在玻璃解剖盤中2ml 800 U/ml的IV型膠原酶中。將卵巢在膠原酶溶液中細細地切碎并在37 °C放置15分鐘,溫和地連續(xù)攪拌以產生單細胞懸液。用Hank緩沖鹽水(HBSS)洗滌單細胞懸液,然后離心(300X g) 5分鐘。丟棄上清液并將細胞沉淀重懸在由補充有正常山羊血清和牛血清白蛋白的HBSS組成的封閉溶液中。細胞懸液在封閉溶液中孵育30分鐘。封閉后,向細胞懸液中加入兔抗-DDX4抗體(生殖細胞譜系特異性抗體),并將細胞與抗體一起孵育30分鐘。然后用HBSS洗滌細胞懸液,接著離心(300 X g) 5分鐘。然后用熒光-綴合的(例如別藻藍蛋白(APC)或異硫氰酸熒光素(FITC))山羊抗-兔二抗孵育細胞為流式細胞術做準備。用HBSS洗滌細胞懸液接著離心(300 X g) 5分鐘以去除過量熒光-綴合的二抗。將標記的細胞懸液裝載到流式細胞分析儀上,并通過熒光測定DDX4-陽性部分(OSCs)。記錄陽性事件,并表述為總的活細胞群的%產率。
      [0141]OSCs 游潛養(yǎng)殺烊。Woods 和 Ti I ly, Nature Protocols 8:966-988 (2013)。收集陽性DDX4-陽性細胞部分并放置在有利于卵原干細胞生長的培養(yǎng)條件中,所述培養(yǎng)條件包括小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養(yǎng)層和補充有10%胎牛血清(FBS)、I mM丙酮酸鈉、I mM非必須氨基酸、IX-濃縮的抗生素溶液、0.1 mM β-巰基乙醇、IX-濃縮的Ν-2補充劑、13單位/mlLIFao ng/ml表皮生長因子、I ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和40 ng/ml膠質細胞-衍生神經營養(yǎng)因子(GDNF)的生長培養(yǎng)基。通過收集培養(yǎng)上清和基于顯微術檢測卵母細胞監(jiān)測OSCs向未成熟卵母細胞的自發(fā)分化。Woods和Tilly,Nature Protocols 8:966-988(2013)。
      [0142]結果
      如圖1A中所示,卵原干細胞(OSCs)在老齡小鼠卵巢中存留,甚至在20個月大時包含卵母細胞的卵泡池完全衰竭后。圖1B顯示一旦從卵巢組織取出并離體培養(yǎng),來自老齡雌性的OSCs保留形成未成熟卵母細胞的能力(與來自年輕雌性的OSCs相似)。這些結果顯示卵原干細胞在高齡小鼠中存留并且來自老齡小鼠的細胞仍可形成未成熟卵母細胞。
      [0143]實施例2.高齡小鼠中卵原干細胞(OSCs)向卵母細胞的分化減少該實施例顯示高齡小鼠中的OSCs不再能促成新的卵母細胞和卵泡形成。
      [0144]材料與方法
      動物和處理表達由減數(shù)分裂定型基因的啟動子驅動的受視黃酸基因8 (StraS;)刺激的綠色焚光蛋白(GFP)的轉基因pStra8_Gfp小鼠如Imudia等人,F(xiàn)ertil Steril, 100:1451-1458 (2013)所描述而產生。具有受Stra8啟動子驅動的單純皰疹病毒胸苷激酶(HSVtk)表達的轉基因小鼠通過用編碼GFP-融合HSVtk的cDNA置換pStra8-Gfp構建體中的GFP-編碼序列,然后將構建體送至Genoway用于產生轉基因系而產生,如Imudia等人,F(xiàn)ertil Steril, 100: 1451-1458 (2013)所描述的。對于比較研究,平行使用來自繁殖群落的轉基因同胞和野生型以排除背景品種對結果的任何潛在作用。對于處理,將HSVtk前藥,更昔洛韋(GCV; Roche)以10 mg/ml溶解在無菌水中,然后在無菌IX-濃縮磷酸緩沖鹽水(PBS)中稀釋用于每日給劑(10 mg/kg持續(xù)21天,腹膜內注射)。對照動物平行注射溶媒(PBS)0
      [0145]妙母激PBS或GCV注射開始之前,用GCV每日給劑21天后和停止GCV處理21天后,從標明年齡的小鼠收集卵巢,固定,石蠟包埋,并連續(xù)切片用于基于組織形態(tài)測定法定量包含卵母細胞的原始卵泡的數(shù)目,如(Jones和Krohn, J Endocrinol, 21:469-495(1961); Johnson 等人,Nature,428: 145-150 (2004);以及 Wang 和Ti I Iy,CellCycle, 9:339-349 (2010))中所詳述的。以全盲的方式評估所有樣品,用第二個觀察者隨機選擇的載玻片獨立地確認重現(xiàn)性。在所有情況下,觀察者之間的計數(shù)變化小于7%。
      [0146]結果
      如圖2A-B和2D中所顯示的,年輕的成年小鼠,S卩,2-3個月大,和中年成年小鼠,S卩,5-6個月大,因GCV處理21天而暫時中斷OSC向新卵母細胞分化導致因卵母細胞輸入失敗所致的減少的原始卵泡存留。然而,停止GCV處理的21天中原始卵泡池恢復回對照(PBS,溶媒)水平。GCV暴露和移除可逆地中斷卵子發(fā)生的能力隨雌性年齡而逐漸喪失(參見圖2A-D)。高齡小鼠,即,I O-11個月大,變得對GCV處理完全不起反應(ref rac tory )(圖2C,2D),表明到了這一年齡OSCs不再能為卵泡的卵巢池貢獻新的卵母細胞。
      [0147]在小鼠中,不遲于10-11個月大,OSCs支持新卵母細胞和卵泡產生的能力完全喪失。然而,如實施例1中所顯示的,在這一(以及遠遠超出的)年齡卵巢中仍然存在OSCs,表明老齡小鼠卵巢,在約實足生命期的一半時(about halfway through chronologicallifespan),不能為OSCs提供新卵母細胞和卵泡形成所需的所有“因子”。
      [0148]實施例3幼年小鼠卵巢組織-衍生細胞的移植拯救老齡小鼠中的卵母細胞和卵泡形成
      該實施例顯示來自幼年小鼠的高度富集顆粒細胞或其前體的分散的卵巢組織,可支持卵泡重新形成并增加老齡動物中存在的原始卵泡的數(shù)目。
      [0149]材料與方法
      用于注射的組織的制備。hk劫年CblRl/& (野生型)供體小鼠收集卵巢組織,使用IV型膠原酶以溫和攪拌裂解為單細胞懸液。用HBSS洗滌分散的卵巢組織,接著離心(300 X g) 5分鐘以去除膠原酶。然后重懸細胞沉淀并裝載到微量移液器中準備卵巢內注射。
      [0150]//y桌片注與含有由其中刪除近側增強子的經修飾的Pou5fl (也稱為0ct4)啟動子驅動的生殖系-特異性綠色熒光蛋白轉基因(APE-0ct4-GFP)的10個月大的雌性小鼠麻醉并手術暴露卵巢,包括暫時移除卵巢囊。將包含野生型供體細胞懸液的微量移液器放置到暴露的卵巢中,注射包含卵巢體細胞的細胞懸液。然后復位卵巢囊,并讓卵巢安放入體腔。釘上(s tap I ed)或縫合手術部位,并讓受體小鼠恢復I周。
      [0151]卵母細胞計數(shù)卵巢內移植I周后,將小鼠安樂死,收集卵巢并固定在4%的多聚甲醛中。將卵巢石蠟包埋,連續(xù)切片,安裝在載玻片上并在二甲苯中脫蠟,接著分級的乙醇系列中水合。通過讓載玻片在檸檬酸鈉(pH 6.0)中煮沸5 min進行抗原恢復,接著在TNK緩沖液(0.1 M Tris, 0.55 M NaCl, 0.1 mM KCl, 1% 山羊血清,0.5% 牛血清白蛋白和0.1%Triton-X/PBS)中封閉,并然后用抗-GFP抗體接著二抗和用于信號檢測的色原孵育。視覺檢查每一切片的卵泡中所包含的GFP-陽性卵母細胞的存在并通過計數(shù)定量非-閉鎖靜止(原始)、早期生長(小,竇前)和竇卵泡。卵泡數(shù)目的比較在接受供體卵巢組織的動物和接受模擬注射的對照動物之間進行。
      [0152]結果
      如圖3中所示,接受包含大量體顆粒細胞的來自年輕供體的離解的卵巢組織-衍生細胞卵巢內移植的生育上老齡的(reproductively aged)雌性小鼠(每對柱中的右側柱),在移植I周內與非移植對照(每對柱中的左側柱)相比受體原始卵泡池增加將近2倍。
      [0153]這些結果表明從富含卵泡體顆粒細胞的源移植的卵巢體細胞與內源OSCs—起工作使老齡卵巢中能夠重新形成卵泡。這些數(shù)據(jù),與表明在老齡卵巢中存留OSCs,而沒有顆粒細胞的證據(jù)組合,表明卵巢顆粒細胞或其前體的可用性代表OSC形成新卵母細胞和卵泡的關鍵限速步驟。因此,本技術的人造顆粒細胞可用于拯救或誘導卵泡形成。
      [0154]實施例4卵原干細胞(OSCs)在近絕經期和絕經后的人卵巢中存留
      該實施例顯示近絕經期和絕經后婦女的卵巢中存在OSCs并且來自絕經后人卵巢的OSCs保留離體形成卵母細胞的能力。
      [0155]材料與方法
      屑f薇式激溆木游鹿鬆游歡備。將來自去-識別的年齡在22-58歲的女性患者的卵巢皮質放置在400 U/ml IV型膠原酶中用于在機械組織離解器(實例包括GentleMACS或其它用于一致機械分散的裝置)中使用以產生單細胞懸液。用Hank緩沖鹽水溶液(HBSS)洗滌單細胞懸液,接著離心(300 X g) 5分鐘。丟棄上清液并將細胞沉淀重懸在由補充有正常山羊血清和牛血清白蛋白的HBSS組成的封閉溶液中。細胞懸液在封閉溶液中孵育30分鐘。封閉后,向細胞懸液中加入兔抗-DDX4抗體(生殖細胞譜系特異性抗體),并將細胞與抗體一起孵育30分鐘。然后用HBSS洗滌細胞懸液,接著離心(300 X g) 5分鐘。然后用熒光-綴合的(例如別藻藍蛋白(APC)或異硫氰酸熒光素(FITC))山羊抗-兔二抗孵育細胞為流式細胞術做準備。用HBSS洗滌細胞懸液接著離心(300 X g) 5分鐘以去除過量熒光-綴合的二抗。將標記的細胞懸液裝載到流式細胞分析儀上,并通過熒光測定DDX4-陽性部分(OSCs)。記錄陽性事件,并表述為總的活細胞群的%產率。Woods和Tilly,Nature Protocols 8:966-988(2013)。
      [0156]0?&游潛養(yǎng)殺烊。收集流式細胞術之后獲得的DDX4-陽性細胞部分并放置在有利于卵原干細胞生長的培養(yǎng)條件中,所述培養(yǎng)條件包括小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養(yǎng)層和補充有10%胎牛血清(FBS )、I mM丙酮酸鈉、I mM非必需氨基酸、IX-濃縮的抗生素溶液、0.1mM β_巰基乙醇、IX-濃縮的N-2補充劑、13單位/ml LIFUO ng/ml表皮生長因子、I ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和40 ng/ml膠質細胞-衍生神經營養(yǎng)因子(GDNF)的生長培養(yǎng)基。通過收集培養(yǎng)上清液和基于顯微術檢測卵母細胞監(jiān)測人OSCs向未成熟卵母細胞的自發(fā)分化。Woods和Tilly,Nature Protocols 8:966-988 (2013)。
      [0157]結果
      如圖4A-B所顯示的,OSCs在高齡婦女的卵巢中存留,甚至在絕經后的生命中包含卵母細胞的卵泡池完全衰竭后(參見圖4A)。從絕經后人卵巢取出并在體外培養(yǎng)的OSCs仍可分化成未成熟卵母細胞(參見圖4B)。
      [0158]這些結果顯示來自老年人卵巢的OSCs仍可在體外制造卵母細胞,但老年婦女的卵巢內環(huán)境不能支持新的卵母細胞和卵泡從這些細胞形成。因此,向已經不能支持新卵母細胞和卵泡產生的人卵巢組織中引入純化的OSCs將不能產生新的未成熟卵母細胞或卵泡。這些結果顯示本技術的人造顆粒將可用于在人類中支持和形成新的卵母細胞和卵泡。
      [0159]實施例5從多能細胞衍生的顆粒細胞產生卵巢類固醇激素
      該實施例顯示從多能細胞分化的顆粒細胞產生形成成熟卵泡和支持未成熟卵母細胞成熟所需的卵巢類固醇激素。
      [0160]材料與方法
      為了鑒定和跟蹤分化ESC培養(yǎng)物中的卵巢體細胞,繪制了早期顆粒細胞標志,F(xiàn)oxl2,在分化ESC培養(yǎng)物中的表達。繪圖顯示FoWJ?基因在第5天激活。使用Genome Vista鑒定了FOX12S因啟動子的739 bp區(qū)域。從小鼠基因組DNA分離該區(qū)域并克隆入pDsRed2-1載體(Clontech, Mountain View, CA,)或包含DsRed的完整開放閱讀框的pLenti6慢病毒構建體(Gateway Lentiviral System; Invitrogen),因此創(chuàng)建在基因啟動子控制下的DsRed表達載體。
      [0161 ] 使用小鼠顆粒細胞作為陽性對照和293細胞(Invitrogen)作為陰性對照驗證啟動子活性和特異性。為了驗證FoWJ?基因啟動子-驅動的DsRed表達,將未分化的Tg0G2 ESCs用Fo;^2-pDsRed2-l構建體經由電穿孔穩(wěn)定轉染,接著克隆選擇和擴大?;蛘?,ESCs在分化開始之后使用轉染/7OZ以-DsRed慢病毒構建體(pLenti6-Fo;r以-DsRed)的293細胞所產生的病毒上清液病毒轉導。通過熒光顯微術分析細胞的DsRed表達并通過熒光激活細胞分選(FACS)分咼。
      [0162]對于FACS,通過0.25%胰蛋白酶-EDTA (分化第1天之前)或手動刮除從板上移除分化的ESCs。細胞然后在溫和分散下用800 U/ml IV型膠原酶(Worthington,Lakewood,NJ)孵育15分鐘,接著用0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育10分鐘以獲得單細胞懸液(分化第10天之后)。用于FACS的細胞通過重懸在Ix-濃縮的包含0.1%FBS的磷酸緩沖鹽水(PBS)中并過濾(35-μπι孔徑)而制備。使用FACS Aria流式細胞分析儀(BD B1sciences, San Jose, CA)分析和分選細胞。
      [0163]測量來自已經再鋪板并在PBS (溶媒)、100 ng/ml卵泡刺激激素(FSH; NIDDK,NIH, Bethesda, MD)或I mM 8_溴腺苷_3’,5’_環(huán)單磷酸酯(8_br_ cAMP; Sigma-Aldrich)存在下培養(yǎng)24、48或72小時的FACS-純化的Foj^tDsRed-陽性細胞的培養(yǎng)基中的雌二醇和孕酮濃度。芳構化至雌激素所必需的雄激素底物通過所有培養(yǎng)物中熱滅活的15% FBS的存在提供,其包含0.92 pg/ml雄激素((檢驗的56批FBS的平均值)。雌二醇ELISA來自Alpco(Salem, NH),孕酮ELISA來自DRG國際(Mountainside,NJ)。所有的測定均按照制造商的指南進行。
      [0164]結果
      ESC分化第12天分離的DsRed-陽性細胞次培養(yǎng)之后對類固醇產生的評估顯示在培養(yǎng)基中存在雌二醇和孕酮二者(圖5A-5B)。另外,用FSH或8-br- cAMP處理導致雌二醇產生的顯著增加,證實了這些細胞中與類固醇產生偶聯(lián)的cAMP-介導的信號傳導和功能性FSH受體的存在。然而,僅8-br- cAMP能夠顯著提高孕酮產生(圖5B)。
      [0?05]這些結果顯示允許多能干細胞培養(yǎng)物自發(fā)分化導致小量表達細胞自發(fā)出現(xiàn)。這些細胞表現(xiàn)出內源顆粒細胞在發(fā)育卵巢卵泡中的兩個主要功能屬性:FSH-響應性和類固醇產生能力。這些結果表明本技術的人造顆粒細胞包含發(fā)育卵巢卵泡的功能屬性。因此,本技術的人造顆??捎糜陔x體或體內形成卵泡,其幫助產生成熟卵泡和卵母細胞。
      [0166]實施例6顆粒細胞的卵巢內移植
      該實施例顯示從多能細胞衍生的顆粒細胞向新生(neo-natal)卵巢中的未成熟卵母細胞和發(fā)育中的卵泡迀移。
      [0167]材料與方法
      下列實驗中使用野生型C57BL/6雌性小鼠(Char I e s River Laboratories,Wilmington, MA, USA)。
      [0168]F0JrM-DsRed-表達ESCs分化12天之后,使用FACS分離DsRed-陽性細胞(對于形成FojrM-DsRed-表達ESCs的描述參見實施例5)。對于每個實驗,使用Pneumatic PicoPump(World Precis1n Instruments, Sarasota, FL)將200-500 DsRed-陽性細胞微注射入單個新生(產后2-4天)野生型小鼠卵巢中(圖6A-6B)。然后將注射的卵巢移植至6周大的卵巢切除的野生型雌性小鼠的腎囊下。移植8天和2周后,取出移入的卵巢并在4%多聚甲醛(PFA)中固定用于分析。
      [0169]將固定的卵巢石蠟包埋,連續(xù)切片,安裝在載玻片上并在二甲苯中脫蠟,接著在分級的乙醇系列中水合。通過讓載玻片在檸檬酸鈉(pH 6.0)中煮沸5 min進行抗原恢復,接著在TNK緩沖液(0.1 M Tris, 0.55 M NaCl, 0.1 mM KCl, 1%山羊血清,0.5%牛血清白蛋白和0.1 % Triton-X/PBS)中封閉,用期需的一抗(1: 100稀釋)4 °C孵育過夜,熒光-綴合的二抗(1:250稀釋,Alexa Fluor-488或-568 ; Invitrogen) 20°C孵育I小時。使用的一抗為來自Serotec的小鼠抗-Dazl抗體(MCA2336 ; Raleigh, NC)和來自Abcam的用于檢測DsRed的兔抗-RFP抗體(ab62341; Cambridge, MA)。熒光圖像分析使用Nikon Eclipse TE2000-S倒置焚光顯微鏡和SPOT成像軟件(Diagnostic Instruments)進行。
      [0170]結果
      在注射從分化12天后的ESC培養(yǎng)物分離的/^dZ-DsRed-表達細胞之前野生型新生卵巢顯示無DsRed (圖6A)。在注射從分化12天后的ESC培養(yǎng)物分離的F0WJ?-DSRed-表達細胞后,野生型新生卵巢顯示DsRed (圖6B)。
      [0171 ]移植8天時,發(fā)現(xiàn)DsRed-表達細胞遍布于注射卵巢的間質。許多這些細胞被觀察到與未成熟卵母細胞緊緊相鄰,如對DsRed和卵母細胞標志Dazl (在無精癥-樣中缺失)雙重免疫熒光染色所指示的(圖6C)。移植14天時,DsRed-表達細胞在間質中不再觀察到而是僅在生長卵泡的顆粒層中專有地檢測到(圖6D)。
      [0172]這些結果顯示顆粒細胞和顆粒細胞前體自然向發(fā)育中的卵泡或未成熟卵母細胞迀移。因此,本技術的人造顆粒可用于促進卵泡、卵泡樣結構和未成熟卵母細胞的生長和成熟。
      [0173]實施例7離體人卵巢皮質條支持卵泡發(fā)育
      該實施例顯示微薄(microthin)卵巢皮質條在體外可維持卵泡形成、生長和成熟。
      [0174]材料與方法
      皮廣"條潛養(yǎng)。將年輕成年人卵巢組織切成微薄條(2 mm X 2 mm X I mm)并在無血清培養(yǎng)基中37°C孵育多達21天以觀察原始卵泡形成和隨后激活至第一生長(初級)階段,接著生長和成熟至多層(次級)階段。
      [0175]妙/—分#。收集皮質條并在4%多聚甲醛中固定。將固定的條石蠟包埋,連續(xù)切片,安裝在載玻片上并在二甲苯中脫蠟,接著在分級的乙醇系列中水合。通過讓載玻片在檸檬酸鈉(pH 6.0)中煮沸5 min進行抗原恢復,接著在TNK緩沖液(0.1 M Tris, 0.55 MNaCl, 0.1mMKCl,1%山羊血清,0.5%牛血清白蛋白和0.1% Triton-X/PBS)中封閉,然后用卵母細胞特異性抗體(對于本實施例,我們使用抗-DDX4)接著熒光-綴合(例如異硫氰酸熒光素(FITC)) 二抗孵育以允許鑒定卵母細胞。
      [0176]結果
      如圖7A中所示,可通過光學顯微術在離體培養(yǎng)兩周的人卵巢皮質條中可視化生長中的卵泡。如圖7B中所示,離體培養(yǎng)14天后通過DDX4免疫熒光對卵巢皮質組織中卵母細胞的評估顯示許多原始和初級卵泡。右側面板,培養(yǎng)的人卵巢皮質組織中檢測到若干多層(通過圍繞位于中央的卵母細胞的多層顆粒細胞指示)或次級卵泡。
      [0177]結果顯示,未成熟卵母細胞和卵泡的發(fā)育,如圍繞生長中的卵母細胞的積極擴展的顆粒細胞層所指示,受離體年輕成年卵巢環(huán)境支持。
      [0178]實施例8未成熟卵母細胞在體外向有能力受精階段的成熟
      該實施例顯示從成年牛卵巢皮質條中所包含的竇前和早期竇階段卵泡收集的顆粒/卵丘細胞復合體中包含的未成熟卵母細胞離體可成熟至發(fā)育的中期II (MII)階段。
      [0179]材料與方法
      從直徑小于2 mm (未成熟,竇前階段)或直徑大于3 mm (更成熟,早期竇階段)的卵泡收集牛顆粒細胞/卵丘細胞-卵母細胞復合體并放置入成熟培養(yǎng)基中38.5°C持續(xù)21-24小時以誘導體外成熟(IVM)。通過視覺檢查第一極體伸出評估向中期II (MII)階段(完全成熟的卵)的成熟。
      [0180]結果
      如圖8A中所顯示的,卵母細胞能夠成熟至中期II,如通過第一極體的伸出(極體伸出用箭頭突出顯示)所測定的。發(fā)現(xiàn)卵母細胞分別以77.8%和68.8%的比率從〈2 mm和>3 mm的卵泡直徑組成熟至發(fā)育的MII期(卵階段)(圖SB)。
      [0181]這些結果顯示通過從卵巢皮質條中存在的非常小的竇前階段卵泡分離的顆粒-卵母細胞復合體的體外成熟可以以非常高的成功程度獲得完全成熟的MII卵。
      [0182]等價物
      本技術不限制于此申請中所描述的具體實施方案,所述實施方案意在作為本技術個別方面的單個的說明。可對本技術作出許多修飾和變更而不脫離其精神和范圍,如對本領域技術人員將顯而易見的。除了本文列舉的那些之外,本技術范圍內的功能上等價的方法和裝置對于本領域技術人員而言將從前述說明顯而易見。這樣的修飾和變更意在落入所附權利要求的范圍內。本技術僅受所附權利要求的條款,連同這些權利要求所具有的權利的等價物的全部范圍限制。應理解的是本技術不限于具體的方法、試劑、化合物、組合物或生物系統(tǒng),這些毫無疑問可以不同。還應理解的是本文所使用的術語僅為了說明具體實施方案的目的,并且不意在限制。
      【主權項】
      1.用于多能細胞向顆粒細胞和/或顆粒前體細胞定向分化的方法,包括:在將所述多能細胞定向至分化為顆粒細胞和/或顆粒前體細胞的培養(yǎng)條件中培養(yǎng)多能細胞,其中所述培養(yǎng)條件包括缺乏MEFs和LIF,不存在或存在GSK抑制劑。2.權利要求1的方法,其中所述培養(yǎng)條件進一步包括存在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4)和/或視黃酸(RA)。3.權利要求1的方法,其中所述多能細胞包含顆粒細胞特異性受體,其中所述顆粒細胞特異性受體的表達指示為顆粒細胞或顆粒細胞前體的細胞。4.權利要求1的方法,其中所述GSK-3抑制劑選自SB216763、B10、CHIR99021、氯化鋰(LiCl)、馬來酰亞胺衍生物、星形孢菌素、吲哚衍生物、paullone衍生物、嘧啶和氟嘧啶衍生物、噁二唑衍生物、噻唑衍生物、雜環(huán)衍生物及其組合。5.權利要求1的方法,進一步包括使所述多能細胞與用于顆粒細胞特化的信號傳導通路的激活劑或生長因子接觸。6.權利要求5的方法,其中所述用于顆粒細胞特化的信號傳導通路的激活劑或生長因子為bFGF、Jaggedl或Jagged2的一種或多種。7.用于多能細胞向顆粒細胞和/或顆粒前體細胞定向分化的方法,包括: 在將所述多能細胞定向為顆粒細胞和/或顆粒前體細胞的培養(yǎng)條件中培養(yǎng)多能細胞,其中所述條件包括缺乏MEFs和LIF,不存在或存在GSK抑制劑,其中所述多能細胞經工程改造以包含一個或多個可誘導的顆粒細胞-特異性基因; 誘導所述一個或多個卵巢顆粒細胞-特異性基因表達;和 形成人造顆粒細胞。8.權利要求7的方法,進一步包括在骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4)和/或視黃酸(RA)存在下培養(yǎng)所述多能細胞。9.權利要求7的方法,其中所述多能細胞包含顆粒細胞特異性受體,其中所述顆粒細胞特異性受體的表達指示為顆粒細胞或顆粒細胞前體的細胞。10.權利要求7的方法,其中所述一個或多個可誘導的顆粒細胞-特異性基因選自叉頭框L2 (Foxl2)、無翅型MMTV整合位點家族成員4 (WNT4)、Nr5al、Dax_l、ATP_結合盒亞家族9(Abca9)、乙酰輔酶A?;D移酶2 (線粒體3_氧代酰基-輔酶A硫解酶;Acaa2)、主動脈平滑肌肌動蛋白a2 (Acta2)、具有I型凝血酶基序的解聯(lián)蛋白-樣和金屬肽酶(reprolysin-樣)17 (Adamtsl7)、ADAMTS-樣 2 (Adamtsl2)、AF4/FMR2 家族成員 I (Affl)、表達序列 AI314831(AI314831)、醛-酮還原酶家族I成員C14 (Akrlcl4)、醛-酮還原酶家族I Notch2和成員C-樣(Akrlcl) ο11.一種離體人工卵巢環(huán)境,包括: 人造顆粒細胞,其中所述人造顆粒細胞使用權利要求1-10中任一項的方法產生; 卵母細胞前體細胞;和 卵巢組織。12.權利要求11的離體人工卵巢環(huán)境,其中所述人造顆粒細胞、所述卵母細胞前體細胞和卵巢組織為自體的。13.制造成熟卵泡和成熟卵母細胞的方法,包括: 使用權利要求1-10中任一項的方法使多能細胞定向分化為顆粒細胞和/或顆粒前體細胞(人造顆粒細胞); 使所述人造顆粒細胞與卵母細胞前體細胞和卵巢組織組合;和 在適合形成所述成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件下培養(yǎng)人造顆粒細胞與卵母細胞前體細胞和卵巢組織的組合。14.權利要求13的方法,其中所述適合形成成熟卵泡和成熟卵母細胞的培養(yǎng)條件包括存在卵泡刺激激素(FSH)和/或促黃體激素(LH)。15.用于在有需要的受試者中生長和成熟卵巢組織中的卵泡和未成熟卵母細胞的方法,包括使卵巢組織與人造顆粒細胞接觸,其中所述人造顆粒細胞由權利要求1-10中任一項的方法制備。16.權利要求15的方法,其中所述人造顆粒細胞與所述卵巢組織在體內接觸。17.權利要求16的方法,其中將所述人造顆粒細胞直接注射入所述受試者的卵巢組織中。18.權利要求15的方法,其中所述有需要的受試者患有一種或多種以下問題,所述問題選自受孕困難、處于不育治療中、處于體外受精中、治療過癌癥和經受過細胞毒治療。19.用于增加有需要的受試者中的一種或多種卵巢衍生的激素和生長因子的水平的方法,所述方法包括: 使用權利要求1-10中任一項的方法使多能細胞定向分化為顆粒細胞和/或顆粒前體細胞(人造顆粒細胞); 基于顆粒細胞特異性受體的表達分離富集的人造顆粒細胞群;和 給予所述受試者有效量的富集的人造顆粒細胞群,其中所述顆粒細胞或顆粒細胞前體分泌一種或多種卵巢衍生的激素和生長因子,并且其中與給予富集的人造顆粒細胞群之前的受試者相比給予所述人造顆粒細胞之后所述受試者顯示提高的一種或多種卵巢衍生的激素和生長因子的水平。20.權利要求19的方法,進一步包括刺激所述人造顆粒細胞以分泌卵巢衍生的激素和生長因子。21.權利要求19-21的任何方法,其中所述卵巢衍生的激素選自:雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和孕酮。22.權利要求21的方法,其中所述顆粒細胞或顆粒細胞前體用卵泡-刺激激素(FSH)、8_溴腺苷3’,5’_環(huán)單磷酸酯(8-br-cAMP)和促黃體激素(LH)刺激以分泌卵巢衍生的激素和生長因子。23.權利要求22的方法,其中所述人造顆粒細胞群為所述受試者自體的。24.權利要求23的方法,其中所述受試者為人類。25.用于產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的離體方法,包括: 組合人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織;和 在足以產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件下培養(yǎng)人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織的組合,其中所述人造顆粒細胞由權利要求1-10中任一項的方法制備并且其中所述人造顆粒細胞、所述卵母細胞前體細胞和所述卵巢組織為自體的。26.權利要求25的方法,其中所述卵母細胞前體細胞衍生自多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞(OSCs)。27.權利要求25的方法,其中所述卵母細胞前體細胞為原始生殖細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞。28.權利要求26的方法,其中所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞經遺傳修飾以校正基因缺陷或表達期需基因。29.權利要求28的方法,其中所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞使用選自電穿孔、直接注射編碼mRNA、基于脂質的轉染、逆轉錄病毒轉導、腺病毒轉導、慢病毒轉導、CRISPR/Cas9、TALENs、鋅指核酸酶(ZFNs)、經工程改造的大范圍核酸酶和定點突變的一種或多種技術遺傳修飾。30.用于為診斷有遺傳疾病的受試者開發(fā)遺傳修飾的成熟卵母細胞的方法,包括: 遺傳修飾來自受試者的多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞以校正基因缺陷; 在足以產生卵母細胞前體細胞的條件下培養(yǎng)所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞; 組合所述卵母細胞前體細胞與人造顆粒細胞和卵巢組織,其中所述人造顆粒細胞由權利要求1-10中任一項的方法制備并且其中所述人造顆粒細胞和卵巢組織為所述受試者自體的;和 在足以產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件下培養(yǎng)人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織的組合,其中所述成熟卵母細胞不攜帶所述遺傳疾病。31.權利要求30的方法,其中所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞使用選自電穿孔、直接注射編碼mRNA、基于脂質的轉染、逆轉錄病毒轉導、腺病毒轉導、慢病毒轉導、CRISPR/Cas9、TALENs、鋅指核酸酶(ZFNs)、經工程改造的大范圍核酸酶和定點突變的一種或多種技術遺傳修飾。32.用于離體產生成熟卵母細胞的方法,包括: 組合人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織;和 在足以產生成熟卵泡和成熟卵母細胞的條件下培養(yǎng)人造顆粒細胞、卵母細胞前體細胞和卵巢組織的組合,其中所述人造顆粒細胞由權利要求1-10中任一項的方法制備并且其中所述人造顆粒細胞、所述卵母細胞前體細胞和所述卵巢組織為自體的。33.權利要求32的方法,其中所述卵母細胞前體細胞衍生自多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞。34.權利要求32的方法,其中所述卵母細胞前體細胞為原始生殖細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞。35.權利要求33的方法,其中所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞經遺傳修飾以校正基因缺陷或表達期需基因。36.權利要求35的方法,其中所述多能細胞、雌性生殖系干細胞或卵原干細胞使用選自電穿孔、直接注射編碼mRNA、基于脂質的轉染、逆轉錄病毒轉導、腺病毒轉導、慢病毒轉導、CRISPR/Cas9、TALENs、鋅指核酸酶(ZFNs)、經工程改造的大范圍核酸酶和定點突變的一種或多種技術遺傳修飾。37.權利要求32的方法,進一步包括冷凍所述成熟卵母細胞。
      【文檔編號】C12N5/02GK105916977SQ201480066902
      【公開日】2016年8月31日
      【申請日】2014年10月7日
      【發(fā)明人】J.L.蒂利, D.C.伍茲
      【申請人】東北大學
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