具有重金屬鈍化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽孢桿菌及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種具有重金屬鈍化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽孢桿菌及應(yīng)用，屬于微生物菌種技術(shù)領(lǐng)域。該蠟樣芽孢桿菌的名稱為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)B19，于2016年04月27日保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.12405。該菌株具有重金屬鈍化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能，適合用于分解難溶性磷，用于產(chǎn)生長(zhǎng)素，用于耐鹽，用于耐受重金屬，用于促進(jìn)植物種子發(fā)芽，用于增加土壤有效磷、微生物碳氮，以及用于降低土壤有效態(tài)重金屬。CGMCC NO.1240520160427
【專利說(shuō)明】
具有重金屬鐘化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽抱桿菌及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物菌種技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種具有重金屬純化和促進(jìn)植物生長(zhǎng) 功能的蠟樣芽抱桿菌及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 憐是植物生長(zhǎng)所必需的礦質(zhì)元素之一，W多種方式參與植物體內(nèi)的各種生理生化 過(guò)程，如能量代謝、光合作用、呼吸作用W及氮固定。一般農(nóng)田±壤中全憐含量很高，但是有 效憐含量很低。我國(guó)±壤中95% W上的憐為無(wú)效憐，植物無(wú)法吸收利用，因此只能通過(guò)外源 添加憐素W供植物吸收利用；而且通過(guò)人工施入的水溶性憐肥極易被±壤中的化、Fe、Al結(jié) 合形成難溶態(tài)的化-P、Fe-P、Al-P沉淀。因此，憐已經(jīng)被視為耕作±壤中的一個(gè)營(yíng)養(yǎng)限制因 子。解憐微生物（陸os曲ate-solubilizingmic;rooganisms，PSMs)的研究已有100余年的歷 史，隨著研究手段的不斷提高，人們對(duì)解憐微生物的了解更加的深入，發(fā)現(xiàn)±壤中解憐微生 物分布有明顯的根際效應(yīng)，具有活化難溶性憐的作用W及促進(jìn)作物生長(zhǎng)的效果，能夠改善 ±壤環(huán)境，使±壤中有效憐含量提高。多年來(lái)的實(shí)踐證明了解憐微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的作 用，但是部分解憐微生物在試驗(yàn)室條件下表現(xiàn)出極強(qiáng)的溶憐能力，但是運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)過(guò) 程中效果并不理想，究其原因可能是多方面的，但是菌株在自然條件下缺乏競(jìng)爭(zhēng)力，難W生 存定殖可能是主要原因之一。尋找到能夠在惡劣環(huán)境中生存能力強(qiáng)、易于定殖到植株根部 的解憐菌微生物尤為重要。芽抱桿菌具有產(chǎn)芽抱的功能，具有較強(qiáng)的抵抗外界環(huán)境脅迫的 能力，能夠抵抗所生存的環(huán)境中由于干燥、熱和紫外線福射所造成的傷害，從而易于定殖± 壤而發(fā)揮田間肥效。因此，具有溶憐作用的芽抱桿菌在生物肥產(chǎn)業(yè)中具有巨大的應(yīng)用前景。
[0003] 目前所報(bào)道的溶憐芽抱桿菌，主要為巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、解淀 粉芽抱桿菌(Baci Ilus amyIoIiquefaciens)、蠟樣芽抱桿菌（Baci Ilus cereus)、枯草芽抱 桿菌(Bacillus subtilis)、蘇云金芽抱桿菌（Bacillus thuringiensis)等菌株研究。譬 如，張維娜等（2012)報(bào)道巨大芽抱桿菌(8曰。;[11118 111日旨曰1日1'；[加1)扣-2同時(shí)具解憐酸巧和卵 憐脂的能力，其溶憐能力分別是對(duì)照組的22倍和25倍。吳小芹等(CN200910032681.9)報(bào)道 蠟樣芽抱桿菌(BaciIlus cereus)JYZ-SDl在卵憐脂液體培養(yǎng)基中可溶性憐含量為1.94mg/ L，是對(duì)照(0.37mg/L)的5.17倍，接種JYZ-SDl菌株150天后楊樹(shù)桿插苗苗高和莖粗比CK分別 增長(zhǎng)了38.1 %和15.9%，鮮重和干重比CK分別增加了83.89%和72.22%。何月秋等 (CN201510956941.7)報(bào)道解淀粉芽抱桿菌（Bacillusamyloliquefaciens)YN2010-KC CGMCC No. 5722在憐酸巧培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d后，培養(yǎng)液中可溶性憐含量為63.82mg/L，是對(duì)照 培養(yǎng)液的64.46倍。運(yùn)些成果顯示了芽抱桿菌在±壤溶憐方面的潛力。但是，解憐微生物篩 選多局限于單一功能菌株。
[0004] 目前，±壤中的重金屬污染較為嚴(yán)重，特別是重金屬儒。同時(shí)具有高效解憐和產(chǎn)生 長(zhǎng)素W及純化重金屬儒的多種功能蠟樣芽抱桿菌在±壤中進(jìn)行應(yīng)用，不僅有利于促進(jìn)植物 生長(zhǎng)，也有利于±壤修改。同時(shí)具有重金屬純化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽抱桿菌未見(jiàn) 報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種具有重金屬純化和 促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽抱桿菌。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述具有重金屬純化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽 抱桿菌的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種具有重金屬純化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能 的蠟樣芽抱桿菌，名稱為蠟樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)B19,于2016年04月27日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 12405，保 藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[000引所述具有重金屬純化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽抱桿菌的16S rDNA核巧酸序 列如沈Q ID NO: 1所示。
[0009] 所述的具有重金屬純化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽抱桿菌的形態(tài)特征如下:為 革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體細(xì)胞桿狀，末端方，呈短或長(zhǎng)鏈，菌落大，表面粗糖，扁平，不規(guī)則;在牛 肉膏蛋白腺培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后形成的菌落為圓形或近似圓形、質(zhì)地軟、無(wú)色素、稍有光澤 的白色菌落。
[0010] 所述的具有重金屬純化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽抱桿菌的生理生化特征如 下:纖維素分解陽(yáng)性、淀粉酶陽(yáng)性、過(guò)氧化氨酶陽(yáng)性、嗎I噪陰性、產(chǎn)生物膜陰性、甲基紅 試驗(yàn)陰性、鐵載體弱陽(yáng)性。
[0011] 所述具有重金屬純化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽抱桿菌的應(yīng)用，包括用于分解 難溶性憐，用于產(chǎn)生長(zhǎng)素，用于耐鹽，用于耐受重金屬，用于促進(jìn)植物種子發(fā)芽，用于增加± 壤有效憐、微生物碳氮，W及用于降低±壤有效態(tài)重金屬。
[0012] 所述的難溶性憐指的是難溶性憐酸巧、憐酸鐵和憐酸侶中的至少一種。
[0013] 所述的重金屬為儒。
[0014] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0015] 本發(fā)明發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，從廣東韶關(guān)市曲江區(qū)馬巧鎮(zhèn)石堡種植甘薦地± 壤中篩選出一株蠟樣芽抱桿菌(Bacillus cereus)B19。此菌株兼具高效分解難溶性憐酸 巧、憐酸鐵、憐酸侶、產(chǎn)生長(zhǎng)素方面、耐鹽、耐受重金屬方面W及促進(jìn)植物種子發(fā)芽和增加± 壤有效憐、微生物碳氮W及降低±壤有效態(tài)儒的功能。
[0016] 應(yīng)用該菌株后，小白菜種子發(fā)芽、第=天根長(zhǎng)W及第屯天莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)與對(duì)照相比分 別增加了 8%、39%、28%、33%。實(shí)驗(yàn)室模擬實(shí)驗(yàn)顯示:施用菌劑后顯著的增加了±壤有效 憐含量，在不同儒濃度±壤施用菌劑后有效憐比不施用菌劑分別增加了30%、22% W及 22%。施用菌劑后顯著的增加了微生物碳含量，在不同儒濃度±壤施用菌劑后有效憐比不 施用菌劑分別增加了24%、21% W及22%;微生物氮比不施用菌劑分別增加了32%、24% W 及29%。施用菌劑后顯著的降低了 ±壤有效態(tài)儒含量，在不同儒濃度±壤施用菌劑后有效 憐比不施用菌劑分別減少了2%、27% W及19%。上述結(jié)果表明該菌株在提高±壤中難溶憐 的有效性和憐肥利用率的同時(shí)，還可顯著促進(jìn)小白菜種子發(fā)芽、提高微生物碳氮W及降低 ±壤有效態(tài)儒含量。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1是B19菌的革蘭氏染色顯微照片圖。
[0018] 圖2是B19菌的芽抱染色顯微照片圖。
[0019] 圖3是B19菌在難溶無(wú)機(jī)憐培養(yǎng)基下產(chǎn)水溶性憐濃度的對(duì)比圖。
[0020] 圖4是B19菌產(chǎn)生長(zhǎng)素定性實(shí)驗(yàn)對(duì)比圖；其中，從左到右，第1和2列為陽(yáng)性對(duì)照，濃 度分別為0、10、20、50、50^旨加^;第3列為陰性對(duì)照，第4列為819，分別設(shè)3個(gè)平行孔。
[0021] 圖5是B19菌耐受不同鹽濃度實(shí)驗(yàn)對(duì)比圖；其中，從左到右，再?gòu)纳系较?，氯化鋼?度分別為 0.5%、1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%。
[0022] 圖6是B19菌耐受不同儒濃度實(shí)驗(yàn)對(duì)比圖。
[0023] 圖7是B19菌耐受重金屬儒平板照片圖；其中，圖A為儒濃度為25mg/L，圖B為儒濃度 為50mg/L。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0025] 本發(fā)明所用的培養(yǎng)基如下：
[0026] ①難溶無(wú)機(jī)憐培養(yǎng)基:葡萄糖lOg，憐酸S巧5g，硫酸錠0.5g，氯化鋼0.2g，硫酸儀 0.1 g，氯化鐘0.2g，酵母浸膏0.5g，硫酸儘0.002g，硫酸亞鐵0.002g，0.4% (w/v)漠酪藍(lán)(pH 6.7)6mL，蒸饋水定容至I OOOmL，抑7.0,固體培養(yǎng)基另加瓊脂18.0g。
[0027] ②無(wú)機(jī)憐篩選培養(yǎng)基A由下述組分構(gòu)成:葡萄糖lOg，憐酸巧5g，氯化儀5g，硫酸儀 0.25g，氯化鐘0.2g，硫酸錠O.lg，蒸饋水定容至1 OOOmL,抑7.0。
[0028] ③無(wú)機(jī)憐篩選培養(yǎng)基B與無(wú)機(jī)憐篩選培養(yǎng)基A的區(qū)別僅在于用憐酸鐵代替憐酸巧 作為唯一憐源。
[0029] ④無(wú)機(jī)憐篩選培養(yǎng)基C與無(wú)機(jī)憐篩選培養(yǎng)基A的區(qū)別僅在于用憐酸侶代替憐酸巧 作為唯一憐源。
[0030] ⑤液體培養(yǎng)基:酵母粉5g、蛋白腺1 Og、氯化鋼1 Og，水定容至1L，pH7.0。
[0031 ]⑥LB液體培養(yǎng)基:酵母提取物5. Og，膜蛋白腺10.0 g，氯化鋼10.0 g，蒸饋水定容至1 OOOmL,抑 7.0。
[0032] ⑦LB固體培養(yǎng)基:酵母提取物5. Og，膜蛋白腺10.0 g，氯化鋼10 . Og，瓊脂粉18. Og， 蒸饋水定容至1 OOOmL,抑7.0-7.2。
[0033] ⑧牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基：牛肉膏3 . Og，蛋白腺5. Og，氯化鋼5. Og，瓊脂18. Og，蒸饋 水定容至 1000 mL, pH 值 7.0-7.2。
[0034] ⑨含重金屬培養(yǎng)基:在LB培養(yǎng)基里加入氯化儒使之達(dá)到所設(shè)計(jì)的濃度，配制液體 培養(yǎng)基時(shí)，不需要加入瓊脂。W上培養(yǎng)基均需要121°C滅菌15min。
[0035] 實(shí)施例1菌株的分離、純化
[0036] (1)分離
[0037] ①初篩
[0038] 稱取廣東韶關(guān)市曲江區(qū)馬巧鎮(zhèn)石堡種植甘薦地±壤10.Og,放入裝有90mL無(wú)菌水 的250mLS角瓶中（加玻璃珠），25°C，200r/min搖床振蕩30min，靜置20~30s，取10血上清液 置于50血滅菌S角瓶中，于90°C水浴lOmin，取1血水浴后上清液加入到難溶無(wú)機(jī)憐培養(yǎng)基， (150mLS角瓶中含有30mL培養(yǎng)液），每個(gè)±樣設(shè)置兩個(gè)重復(fù)。置于搖床進(jìn)行富集培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速 15化/min,溫度30°C。富集培養(yǎng)周期為5~7d，第一次富集培養(yǎng)結(jié)束后取ImL培養(yǎng)液各自加入 到新的培養(yǎng)基中進(jìn)行第二次富集培養(yǎng)，同樣的操作進(jìn)行第=次富集培養(yǎng)，每次富集結(jié)束后 在超凈工作臺(tái)中用移液槍取上清液適量，置于離屯、管中，離屯、，取上清液，采用鋼錬抗比色 法測(cè)定上清液中水溶性憐含量。其中，命名為Bl9菌的水溶性憐含量為255.3化g/mL
[0039] ②復(fù)篩
[0040] 選擇解憐效果較好的菌株，分別接種到無(wú)機(jī)憐篩選培養(yǎng)基B和無(wú)機(jī)憐篩選培養(yǎng)基C 中，30°C搖床15化/min，培養(yǎng)3d后測(cè)定培養(yǎng)液中有效憐的濃度。其中，Bl 9菌憐酸鐵培養(yǎng)基中 水溶性憐含量為48.2化g/mL，憐酸侶培養(yǎng)基中水溶性憐含量為24.2化g/mL，采用甘油管保 存法保存該菌株。
[OOW (2)純化
[0042] 將篩選出的B19菌利用平板劃線法純化后，保存于牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基所制的斜 面，置于4°C冰箱備用。
[0043] 實(shí)施例2特性鑒定
[0044] 將實(shí)施例1篩選得到的B19菌進(jìn)行生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定。
[0045] (1)菌體形態(tài)特性
[0046] B19菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體細(xì)胞桿狀，末端方，呈短或長(zhǎng)鏈，菌落大，表面粗糖，扁 平，不規(guī)則。菌體革蘭氏染色顯微照片如圖1所示，菌體呈現(xiàn)紫色。芽抱孔雀綠染液染色，顯 微照片如圖2所示，芽抱呈現(xiàn)綠色。
[0047] B19菌在牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后形成的菌落為圓形或近似圓形、質(zhì)地 軟、無(wú)色素、稍有光澤的白色菌落。
[004引 （2)生長(zhǎng)特性
[0049] 在液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速18化pm，溫度37 °C，起始pH值為7.0的條件下，培養(yǎng)18小時(shí)， 測(cè)得活菌數(shù)為 3. OO ± 0.08 X 1 〇8cf u/mL。
[0050] (3)生理、生化特性的測(cè)定方法參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠），鑒定結(jié)果 見(jiàn)表1。
[0化1] 表1 B19菌生理生化特性
[0化2]
[0053] 注:+表示為陽(yáng)性；一表示為陰性;W表示為弱陽(yáng)性；
[0054] (4)分子生物學(xué)特性
[0055] 采用試劑盒法(購(gòu)自上海生工生物工程有限公司）提取B19菌總DNA。采用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F(AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)和 1492R(TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T)，PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA，50化的PCR反應(yīng)體系為:DNA模板化L，引物27F(1 mM)l化， 引物 1492R(1 HiMHiiUrhq酶25化，dd 出0 2化L。
[0056] PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 r預(yù)變性3min，進(jìn)入熱循環(huán);95 r變性30s，52 r退火30s，72 。(:延伸30s，共35個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin。
[0057] 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和濃度，在1000 bp附近出現(xiàn)明顯的條 帶，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，測(cè)序由廣州艾基生物生物技術(shù)有限公司完成，將獲得的DNA序列 (如SEQ ID NO. 1所示)輸入美國(guó)國(guó)立生物信息中屯、NCBI網(wǎng)頁(yè)上進(jìn)行BLAST比對(duì)，WBlast程 序?qū)?shù)據(jù)庫(kù)中的所有序列進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所述菌株的16S rDNA序列和與 GenBank中蠟樣芽抱桿菌具有較高的同源性，其相似度為99%。結(jié)合上述的菌體形態(tài)特性、 平板菌落特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析的結(jié)果，初步鑒定該菌株為蠟樣芽抱桿菌 (Bacillus cereus)，命名為蠟樣芽抱桿菌（Bacillus cereus)B19,于2016年04月27日保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 12405， 保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[005引實(shí)施例3 B19菌在難溶性無(wú)機(jī)憐培養(yǎng)基培養(yǎng)下產(chǎn)水溶性憐的效果實(shí)驗(yàn)
[0059] (1)待測(cè)液的制備
[0060] 挑取保存于牛肉膏蛋白腺斜面培養(yǎng)基上B19菌體劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，30 °C下培養(yǎng)24h。將平板上B19菌體接入含有20mL LB液體培養(yǎng)基的ISOmLS角瓶中，30°C， 15化/min,搖床培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)液eOOOr/min離屯、5min，用無(wú)菌水重懸菌體，在滿旋混合儀 上擴(kuò)散均勻，用移液槍將菌懸液等量接入含有30mL無(wú)機(jī)憐篩選培養(yǎng)基的150mLS角瓶，30 °C、150r/min，搖床培養(yǎng)7d。
[0061 ] (2)水溶性憐含量測(cè)定
[00創(chuàng)將培養(yǎng)液在10000g，25°C離屯、15min，取上清液，采用鋼錬抗比色法測(cè)定水溶性憐 含量。設(shè)不接B19菌，接入等量無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。水溶性憐含量變化(單位為 yg/mL，即表示每毫升樣品中所含水溶性憐的微克數(shù))的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0063] 圖3的結(jié)果表明：B19菌解憐酸巧的水溶性憐含量高達(dá)255.34iig/mL，憐酸鐵的水溶 性憐含量為48.2化g/mL，憐酸侶的水溶性憐含量為24.2化g/mL。
[0064] 實(shí)施例4 B19菌產(chǎn)生長(zhǎng)素效果試驗(yàn)
[0065] (1)生長(zhǎng)素定性測(cè)定：將B19菌接種于含有k色氨酸（lOOiig/mL)的20mL LB液體培 養(yǎng)基的ISOmLS角瓶中，30°C、150r/min搖床培養(yǎng)2地。取50化培養(yǎng)液滴于白色陶瓷板上，同 時(shí)加50化Sa化OWSki比色液(35%肥l〇4+lmL 0.5mol/LFeCl3)，設(shè)50化的滅菌LB培養(yǎng)基作為 陰性對(duì)照，10、20、50(yg/mL)生長(zhǎng)素的比色液作為陽(yáng)性對(duì)照。將白色陶瓷板于室溫、避光條 件下放置30min后觀察，顏色變紅者表示能夠產(chǎn)生長(zhǎng)素，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4,可見(jiàn)，B19的顏色顯 示為淡粉色，顏色介于對(duì)照和lOyg/mL之間。
[0066] (2)生長(zhǎng)素定量測(cè)定:將B19菌接種于含有k色氨酸(iig/mL)的50mL LB液體培養(yǎng)基 中，S個(gè)重復(fù)，30°C、150r/min搖床培養(yǎng)2地。將培養(yǎng)液分別在6000Xg下離屯、10min，取4mL上 清液加入4mL Salkowski比色液，混勻，室溫、黑暗中靜置30min，使用紫外分光光度計(jì)，在 530nm下測(cè)吸光度，同時(shí)用無(wú)菌培養(yǎng)基做相同處理作為對(duì)照，采用0、10、20、30、50(蛇/血)的 生長(zhǎng)素作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。819菌產(chǎn)生長(zhǎng)素量達(dá)到8.72iig/mL。
[0067] 表2 B19菌產(chǎn)生長(zhǎng)素效果試驗(yàn)結(jié)果 「nOAQl
[0069] 實(shí)施例5 B19菌耐鹽試驗(yàn)
[0070] 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基:牛肉膏3.Og,蛋白腺10.Og,化Cl 5.Og,瓊脂18.Og,蒸饋水1000 mL,pH 7.0-7.2。依據(jù)不同的氯化鋼濃度，添加氯化鋼。
[0071 ] 將Bl 9菌劃線到氯化鋼濃度分別為0.5%、1.5%、3.5%、5.5%、7.5%、9.5%、 11.5%、13.5%的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)2地，觀察菌株的生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5,隨著氯 化鋼的含量越高，菌體的生長(zhǎng)量越少，至9%，菌體的菌落已經(jīng)很稀疏，至13%，觀察不到菌 落。結(jié)果表明：B19菌耐受9%的NaCl。
[0072] 實(shí)施例6 B19菌耐受重金屬儒試驗(yàn)
[0073] 取30化的B19菌液接種于3mL的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C、180rpm培養(yǎng)8-lOh，進(jìn)行 活化。將活化后的B19菌液按照1 %的接種量加入含0、1、5、10、25、30mg/L Cd2+的3血LB液體 培養(yǎng)基中，37 °C，ISOrpm搖床培養(yǎng)，每隔30min測(cè)定培養(yǎng)基的吸光值A(chǔ)600，繪制重金屬耐受曲 線。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6及圖7。結(jié)果表明：B19菌耐受30mg/L的Cd2+。
[0074] 實(shí)施例7 B19菌促進(jìn)植物種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)室效果試驗(yàn)
[0075] (1)菌懸液制備：
[0076] ①將菌種活化后點(diǎn)接入LB液體培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)24h振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速 為150r/min;
[0077] ②將菌液滴入血球計(jì)數(shù)板，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，得出菌液中菌體細(xì)胞濃度；
[0078] ③將菌液于高速離屯、機(jī)中離屯、，轉(zhuǎn)速GOOOr/min，離屯、5min;
[0079] ④將菌體用無(wú)菌水重懸；
[0080] ⑤用于浸泡小白菜種子的菌株濃度為2.OX IO7C化/ml的菌懸液。
[0081] (2)種子表面滅菌處理：種子用75%乙醇浸泡Imin,再用2%次氯酸鋼溶液浸泡 2min，置于滅菌濾紙上自然驚干。
[0082] (3)采用B19菌和空白對(duì)照進(jìn)行效果對(duì)比試驗(yàn)，共分2個(gè)處理組（第1組采用25mL B19菌菌重懸液），用B19表示，第2組采用25mL無(wú)菌水水處理作為空白對(duì)照，用CK表示）。各處 理組設(shè)四個(gè)重復(fù)，各重復(fù)含10顆小白菜種子（隨機(jī)選取表面滅菌后大小均一的種子）。處理 組B19采用菌懸液浸泡30min，CK采用無(wú)菌水作同樣處理。取滅菌培養(yǎng)皿，加入兩層無(wú)菌濾 紙，倒去浸泡液后，用無(wú)菌綴子夾取種子放入培養(yǎng)皿中，每皿10顆，再加蓋一層無(wú)菌濾紙，W 浸潤(rùn)保存水分，置于25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，每天誘水適量，每皿的水量要相同，均勻，定期測(cè) 定發(fā)芽率，莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)等指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可W看出本發(fā)明分離的蠟樣芽抱桿菌 (Bacillus cereus)B19菌能夠顯著增加白菜種子發(fā)芽，促進(jìn)小白菜種子根莖的生長(zhǎng)，第S 天根長(zhǎng)W及第屯天莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)與對(duì)照相比分別增加了39%、28%、33%。
[0083] 表3 B19菌對(duì)小白菜種子發(fā)芽促進(jìn)效果試驗(yàn)結(jié)果
[0084]
[0085] 注:數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，表中同列*表示在0.05水平差異顯著(獨(dú)立 樣本t檢驗(yàn)）。
[0086] 實(shí)施例8 B19菌對(duì)±壤養(yǎng)分W及重金屬影響試驗(yàn)
[0087] (1)菌懸液制備：
[008引①將菌種活化后點(diǎn)接入LB液體培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)2地振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速 為15化/min;所述液體培養(yǎng)基成分為:酵母提取物5. Og/L，膜蛋白腺10.0 g/L，氯化鋼10.0 g/ L，pH 7.0;
[0089] ②將菌液滴入血球計(jì)數(shù)板，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，得出菌液中菌體細(xì)胞濃度；
[0090] ③將菌液于高速離屯、機(jī)中離屯、，轉(zhuǎn)速6000r/min，離屯、5min;
[0091 ]④將菌體用無(wú)菌水重懸；
[0092] ⑤用于接種±壤的菌株濃度為3. OX 107 c化/mL的菌懸液。
[0093] (2)試驗(yàn)設(shè)計(jì)：
[0094] 從大寶山金屬礦區(qū)采集水稻±，測(cè)定±壤的理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表4。向±壤分別加 入 Img/kg 和 3mg/kg 的 Cd2+,并老化 14d。
[00M]用B19菌和不加菌進(jìn)行效果對(duì)比試驗(yàn)，共分6個(gè)處理組：第1組原±加無(wú)菌水，用Tl 表示;第2組原±加入B19菌3 X IO6C化八±壤，用T2表示;第3組外源添加Img/kg Cd2+±壤加 入無(wú)菌水，用T3表示;第4組外源添加Img/kg Cd2+±壤加入B19菌3 X IO6C化八±壤，用T4表 示;第5組外源添加3mg/kg Cd2+±壤加入無(wú)菌水，用T5表示;第6組外源添加3mg/kg Cd2+± 壤加入B19菌3 X IO6C化八±壤，用T6表示。每個(gè)處理組重復(fù)3次。每天誘水適量，維持40 %± 壤含水量。
[0096] 施用菌劑5天后取鮮±做微生物碳氮，并將剩余±壤自然風(fēng)干，做±壤有效憐、有 效態(tài)儒實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)下表5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，施用B19菌劑后有效憐、微生物碳、微生 物氮均顯著的增加，有效儒含量顯著降低。
[0097] 表4實(shí)驗(yàn)室模擬實(shí)驗(yàn)±壤理化性質(zhì) [009引
[
[
[0101] 注：Tl表示原±，T2表示原±加菌B19，T3表示加Img/kg Cd老化后±，T4表示加 Img/kg Cd老化后±再加菌B19，T5表示加3mg/kg Cd老化后±，T6表示加3mg/kg Cd老化后 ±再加菌B19。數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，表中同列*表示在0.05水平差異顯著(獨(dú) 立樣本t檢驗(yàn)）。
[0102]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有重金屬鈍化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽孢桿菌，其特征在于：名稱為蠟 樣芽孢桿菌(Bacillus cereUS)B19,于2016年04月27日保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保 藏編號(hào)為CGMCC NO. 12405。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有重金屬鈍化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽孢桿菌，其特征 在于:所述的蠟樣芽孢桿菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有重金屬鈍化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽孢桿菌，其特征 在于:所述的蠟樣芽孢桿菌的形態(tài)特征如下:為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體細(xì)胞桿狀，末端方，呈短 或長(zhǎng)鏈，菌落大，表面粗糙，扁平，不規(guī)則;在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后形成的菌落 為圓形或近似圓形、質(zhì)地軟、無(wú)色素、稍有光澤的白色菌落。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述具有重金屬鈍化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽孢桿菌，其特征 在于:所述的蠟樣芽孢桿菌的生理生化特征如下:纖維素分解陽(yáng)性、淀粉酶陽(yáng)性、過(guò)氧化氫 酶陽(yáng)性J引噪陰性、產(chǎn)生物膜陰性、甲基紅試驗(yàn)陰性、鐵載體弱陽(yáng)性。5. 權(quán)利要求1~4任一項(xiàng)所述具有重金屬鈍化和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能的蠟樣芽孢桿菌的 應(yīng)用，其特征在于:所述的蠟樣芽孢桿菌在如下任一方面中的應(yīng)用：用于分解難溶性磷，用 于產(chǎn)生長(zhǎng)素，用于耐鹽，用于耐受重金屬，用于促進(jìn)植物種子發(fā)芽，用于增加土壤有效磷、微 生物碳氮，以及用于降低土壤有效態(tài)重金屬。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的難溶性磷指的是難溶性磷酸鈣、磷 酸鐵和磷酸鋁中的至少一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述的重金屬為鎘。
【文檔編號(hào)】A01P21/00GK105925507SQ201610391094
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月2日
【發(fā)明人】李永濤, 徐會(huì)娟, 蒲強(qiáng), 彭桂香, 蔡燕飛, 張玉龍
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)