高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高轉(zhuǎn)移胰腺癌細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。胰腺癌細(xì)胞株，命名為人胰腺癌細(xì)胞系BxPC?3M8，保藏號為：CCTCC NO：C2016119。本發(fā)明通過將胰腺癌細(xì)胞株BxPC?3反復(fù)8次進(jìn)行Transwell穿膜實(shí)驗(yàn)，篩選得到了BxPC?3M8細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有高轉(zhuǎn)移性和侵襲性，能夠被用于制備哺乳動(dòng)物胰腺癌模型，研究胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制，提取胰腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的標(biāo)志物，篩選和評估治療胰腺癌藥物，開發(fā)胰腺癌復(fù)發(fā)檢測試劑盒等用途，具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用的價(jià)值，預(yù)期能產(chǎn)生良好的科研、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。CCTCC NO：C201611920160603
【專利說明】
高轉(zhuǎn)移膜腺癌細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種高轉(zhuǎn)移膜腺癌細(xì)胞株及其構(gòu)建 方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是嚴(yán)重威脅我國人民生命健康的第一大"殺手"，已成為亟待解決的公共健康 問題!最新研究提示我國癌癥新發(fā)病例和死亡病例逐年增加，其中2015年約有429.2萬新發(fā) 浸潤性癌癥病例，平均每天新發(fā)約12000例;有281.4萬癌癥死亡病例，平均每天約7500人死 于癌癥。膜腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。膜腺癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨 勢，年輕化、病程短、進(jìn)展快、預(yù)后差、死亡率高是膜腺癌的臨床及生物學(xué)特征。我國膜腺癌 的年發(fā)病率為5.1/10萬，較20年前大幅升高。由于缺乏早期診斷和有效的治療方法，中晚期 膜腺癌的中位生存期僅有3~4個(gè)月，膜腺癌患者5年生存率低于5%，又被成為"癌癥之王"。
[0003] 研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤轉(zhuǎn)移是膜腺癌患者的主要死因。對膜腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移機(jī)制的研 究一直都是熱點(diǎn)問題，而建立良好的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪茄芯磕は侔┣忠u轉(zhuǎn)移機(jī)制的重要方 法。但目前缺少理想的體外研究細(xì)胞模型，制約科研工作者進(jìn)一步深入研究膜腺癌轉(zhuǎn)移，亟 需建立和鑒定合適的高轉(zhuǎn)移膜腺癌細(xì)胞模型。
[0004] 腫瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性。由生物學(xué)特性和侵襲轉(zhuǎn)移力不完全相同的腫瘤細(xì)胞亞群組 成。而腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力取決于異質(zhì)性的母系群體中少數(shù)高轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞，通過多次 篩選，某些高轉(zhuǎn)移亞系細(xì)胞可W穩(wěn)定下來。同時(shí)，不適應(yīng)和不穩(wěn)定亞系被去除，獲得的是較 穩(wěn)定的具有較強(qiáng)侵襲轉(zhuǎn)移能力的亞系。運(yùn)為研究腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了理想的細(xì)胞模 型。W往大部分研究者都是通過動(dòng)物體內(nèi)篩選的方法篩選出腫瘤細(xì)胞亞系。但運(yùn)種方法耗 時(shí)長，操作難度大，重復(fù)性差，成功率較低。
[0005] 但目前缺少理想的體外研究細(xì)胞模型，制約科研工作者進(jìn)一步深入研究膜腺癌轉(zhuǎn) 移。建立和鑒定合適的高轉(zhuǎn)移膜腺癌細(xì)胞模型，有助于篩選膜腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵祀點(diǎn)，為 成功開發(fā)抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的臨床治療手段提供新策略，有著重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值！

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種具有高轉(zhuǎn)移性和侵襲性的膜腺癌細(xì)胞株。
[0007] 一種膜腺癌細(xì)胞株，命名為人膜腺癌細(xì)胞系BXPC-3M8,保藏于位于中國武漢武漢 大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏日期為2016年6月3日，保藏號為：CCTCC NO: C2016119。
[000引本發(fā)明又提供了所述膜腺癌細(xì)胞株的子代細(xì)胞。所述子代細(xì)胞基本或全部保留了 親代膜腺癌細(xì)胞系BXPC-3M8的特性，也是具有高轉(zhuǎn)移性和侵襲性的。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種所述膜腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法為Transwell 遷移試驗(yàn)法，起始細(xì)胞株為膜腺癌細(xì)胞BxPC-3，試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為8次。
[0010] 將化answel 1小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上室內(nèi)盛裝上 層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液W聚碳酸醋膜相隔，將細(xì)胞種在上室內(nèi)， 由于聚碳酸醋膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可W影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可W研究 下層培養(yǎng)液中的成分對細(xì)胞生長、運(yùn)動(dòng)等的影響。通過將親代膜腺癌細(xì)胞多次重復(fù) Transwe 11遷移試驗(yàn)，能夠篩選馴化得到高轉(zhuǎn)移的膜腺癌細(xì)胞。
[0011] BxPC-3細(xì)胞源自一個(gè)日本女性膜腺癌活檢標(biāo)本，由化n MH等人在1982年建立的人 膜腺癌細(xì)胞系，是目前膜腺癌研究中常用的細(xì)胞模型。STR(短串聯(lián)重復(fù)序列)是廣泛分布在 真核生物基因組中的簡單重復(fù)序列，通常采用PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳分析并根據(jù)大小 分離等位基因進(jìn)行檢測。通過STR檢測分析發(fā)現(xiàn)，BXPC-3M8與親代BxPC-3完全同源，不存在 其他細(xì)胞的交叉污染，細(xì)胞形態(tài)和增殖速度沒有顯著區(qū)別。但是BXPC-3M8的遷移和侵襲能 力顯著強(qiáng)于BxPC-3細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述的膜腺癌細(xì)胞株在制備哺乳動(dòng)物膜腺癌模型中的應(yīng)用。所述 的哺乳動(dòng)物為裸小鼠或裸大鼠。通過將一定細(xì)胞數(shù)量的所述膜腺癌細(xì)胞BXPC-3M8接種于裸 小鼠或裸大鼠的皮下、腹腔或者尾靜脈等部位，獲得高轉(zhuǎn)移性膜腺癌的動(dòng)物模型。
[0013] 本發(fā)明還提供了所述的膜腺癌細(xì)胞株在提取膜腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的標(biāo)志物中的應(yīng) 用。通過與低轉(zhuǎn)移性膜腺癌細(xì)胞進(jìn)行比較研究，可W發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移膜腺癌的分子標(biāo)記，針對該 分子標(biāo)記可W進(jìn)行后續(xù)的藥物開發(fā)等應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供了所述的膜腺癌細(xì)胞株在篩選和評估治療膜腺癌藥物中的應(yīng)用。首 先，通過向所述膜腺癌細(xì)胞化PC-3M8培養(yǎng)基中添加不同藥物，觀察細(xì)胞狀態(tài)變化，獲得初步 有效的候選藥物。然后，將候選藥物施藥于上述高轉(zhuǎn)移性膜腺癌動(dòng)物模型，觀察與未施藥組 動(dòng)物的存活期、腫瘤大小、轉(zhuǎn)移情況等，篩選獲得潛在治療膜腺癌的藥物。
[0015] 本發(fā)明還提供了所述的膜腺癌細(xì)胞株在開發(fā)膜腺癌復(fù)發(fā)檢測試劑盒中的應(yīng)用?？?W采用蛋白組學(xué)技術(shù)，分析比較親代BxPC-3細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移膜腺癌細(xì)胞系BXPC-3M8分泌蛋白 質(zhì)的差異表達(dá)，篩選出與膜腺癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的分泌蛋白質(zhì)，開發(fā)出檢測高轉(zhuǎn)移膜腺癌特定 分泌蛋白表達(dá)情況的檢測試劑盒，該試劑盒可用于檢測膜腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況。
[0016] 本發(fā)明通過將膜腺癌細(xì)胞株BxPC-3反復(fù)8次進(jìn)行化answe 11穿膜實(shí)驗(yàn)，篩選得到了 BXPC-3M8細(xì)胞系，該細(xì)胞系具有高轉(zhuǎn)移性和侵襲性，能夠被用于制備哺乳動(dòng)物膜腺癌模型， 研究膜腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制，提取膜腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的標(biāo)志物，篩選和評估治療膜腺癌藥物， 開發(fā)膜腺癌復(fù)發(fā)檢測試劑盒等用途，具有較高的科研和生產(chǎn)應(yīng)用的價(jià)值，預(yù)期能產(chǎn)生良好 的科研、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
【附圖說明】
[0017] 圖1為實(shí)施例2中BxPC-3和BXPC-3M8細(xì)胞形態(tài)檢測圖；
[001引圖2為實(shí)施例4中BxPC-3和BXPC-3M8細(xì)胞的生長曲線檢測結(jié)果圖；
[0019] 圖3為實(shí)施例5中BxPC-3和BXPC-3M8細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較圖；
[0020] 圖4為實(shí)施例6中BxPC-3和BXPC-3M8細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較圖；
[0021] 圖5為實(shí)施例7中BxPC-3和BXPC-3M8細(xì)胞的侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)驗(yàn)材料；
[0023] 細(xì)胞株:膜腺癌細(xì)胞株BxPC-3，膜腺癌細(xì)胞BxPC-3M8。
[0024] 試劑耗材:1640培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）、0.25%膜酶(杭州吉諾 生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司）、胎牛血清(G化CO公司KGiemsa染色試劑盒(南京建成生物科技有 限公司）、60mm和1 OOmm培養(yǎng)皿(Corning公司）、6孔和24孔Transwe 11小室(孔徑祉m，corning 公司）、基質(zhì)膠(Matrigel)。
[00巧]基礎(chǔ)培養(yǎng)液:含10 %胎牛血清的1640培養(yǎng)液。
[00%]無血清培養(yǎng)液：1640培養(yǎng)液。
[0027]儀器:正置顯微鏡、倒置顯微鏡、細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器。
[002引實(shí)施例1 BXPC-3M8細(xì)胞系建立
[0029] 將膜腺癌細(xì)胞株BxPC-3用1640培養(yǎng)液（無血清培養(yǎng)基）制備1 X lOVmL單細(xì)胞懸 液，然后在孔徑為祉m的6孔板Transwell小室的上室加 ImL所述單細(xì)胞懸液，下室加 2血基礎(chǔ) 培養(yǎng)液，培養(yǎng)4她后，收集穿過化answell小室隔膜的細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)。重復(fù)上述操作8次后， 獲得BXPC-3M8細(xì)胞。
[0030] 實(shí)施例2細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測
[0031] 將10萬個(gè)BxPC-3和BXPC-3M8細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng) 72小時(shí)，至60 %~70 %貼壁率，去培養(yǎng)液，PBS洗涂2次，Gi emsa染色(完全按照試劑盒操作說 明），正置顯微鏡下觀察，拍照。
[0032] 如圖1所示，與親代細(xì)胞BxPC-3比較，BXPC-3M8的細(xì)胞大小、細(xì)胞輪廓等差異不大， 但是細(xì)胞克隆相對松散，細(xì)胞間隙較大。
[0033] 實(shí)施例3 BXPC-3M8細(xì)胞STR檢測分析
[0034] 委托中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、對BXPC-3M8細(xì)胞進(jìn)行STR檢測分析，檢測方法如下： 提取待檢細(xì)胞的DNA，采用Golden巧e? 20A STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，在ABI 3100型遺 傳分析儀上連續(xù)對20個(gè)已知的STR位點(diǎn)和性別基因 Amelogenin進(jìn)行檢測分析，W確定待檢 測細(xì)胞的種屬來源，判斷其細(xì)胞是否存在交叉污染，檢測結(jié)果如表1所示。
[0035] 表 1 「nnoi： 1

[0037] 檢測報(bào)告的結(jié)論為：
[0038] l、BxPC-3M8細(xì)胞系在各基因座均未出現(xiàn)S等位基因現(xiàn)象，細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)人類細(xì) 胞交叉污染。
[0039] 2、BXPC-3M8細(xì)胞系STR數(shù)據(jù)與美國ATCC、德國和日本JCRB的STR數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)相對 比，在JCRB、DSMZ細(xì)胞庫中均找到與其細(xì)胞分型100%相匹配的細(xì)胞，細(xì)胞名稱為BxPC-3。
[0040] 實(shí)施例4細(xì)胞生長曲線檢測
[0041 ] 分別將5萬個(gè)BxPC-3和BXPC-3M8細(xì)胞接種于IOOmm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液， 培養(yǎng)72~96小時(shí)，至70 %~90 %貼壁率，更換新鮮培養(yǎng)液，0.25 %膜酶消化，收集細(xì)胞，細(xì)胞 計(jì)數(shù)，配制10000個(gè)ZmL濃度的單細(xì)胞懸液，分別每孔接種SmL單細(xì)胞懸液至30個(gè)60mm培養(yǎng) 皿，每總細(xì)胞數(shù)為50000個(gè)。依據(jù)情況更換培養(yǎng)液，保證充足的營養(yǎng)成分，分別在24、48、72、 96、120、144、168、196小時(shí)，消化3皿細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值，繪制生長曲線。
[0042] 結(jié)果如圖2所示，BXPC-3M8與BxPC-3生長曲線大致重合，BXPC-3M8與BxPC-3體外增 殖速度沒有顯著性區(qū)別。
[0043] 實(shí)施例5劃痕實(shí)驗(yàn)
[0044] 在6孔板中接種50萬個(gè)BxPC-3和BXPC-3M8細(xì)胞，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，長至100% 融合度時(shí)，換無血清培養(yǎng)液，用無菌的20化L槍頭劃痕，洗涂2遍，去除懸浮細(xì)胞，換無血清培 養(yǎng)液培養(yǎng)，選取劃痕寬度合適，邊界規(guī)整的區(qū)域標(biāo)記，每隔24小時(shí)顯微鏡下觀察拍照，比較 兩種細(xì)胞水平移動(dòng)能力的差異。
[0045] 結(jié)果如圖3所示，無血清培養(yǎng)24小時(shí)后，BXPC-3M8細(xì)胞的劃痕間隙寬度明顯小于 BxPC-3細(xì)胞，說明BXPC-3M8細(xì)胞的水平方向的運(yùn)動(dòng)能力顯著強(qiáng)于BxPC-3細(xì)胞。
[0046] 實(shí)施例6細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
[0047] 消化BxPC-3和BXPC-3M8細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液制取5 X lOVmL單細(xì)胞懸液，在24孔 板Transwell (孔徑為祉m)上室加 2(K)化單細(xì)胞懸液，下室加 60化L基礎(chǔ)培養(yǎng)液。24小時(shí)去除 Transwell上室細(xì)胞，Gimsa染色，割取Transwell隔膜，封片后正置顯微鏡下觀察，并拍照。 [004引結(jié)果如圖4所示，同樣條件下，BXPC-3M8細(xì)胞穿過化answell隔膜的細(xì)胞顯著多于 BxPC-3細(xì)胞，說明BXPC-3M8細(xì)胞的遷移能力顯著強(qiáng)于BxPC-3細(xì)胞。
[0049]實(shí)施例7細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)
[0化0]用基質(zhì)膠(matrigel)和無血清培養(yǎng)液按1:5混合，每個(gè)化answell小室（24孔板，孔 徑為祉m)加3化L混合液，均勻覆蓋隔膜，37 °C解化包被4小時(shí)，備用。消化BxPC-3和化PC-3M8 細(xì)胞，用1640培養(yǎng)液制取5 XioVmL單細(xì)胞懸液，在已經(jīng)用基質(zhì)膠（matrigel)包被好的 Transwel I上室加2(K)化單細(xì)胞懸液，下室加6(K)化基礎(chǔ)培養(yǎng)液。48小時(shí)后，去除Transwel I上 室細(xì)胞，Gimsa染色，割取化answell隔膜，封片后正置顯微鏡下觀察，并拍照。
[0化1] 結(jié)果如圖5所示，同樣條件下，BxPC-3M8細(xì)胞穿過Tr an swell隔膜（基質(zhì)膠 (matrigel)包被）的數(shù)目顯著多于BxPC-3細(xì)胞。說明BXPC-3M8細(xì)胞的侵襲能力顯著強(qiáng)于 BxPC-3 細(xì)胞。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 胰腺癌細(xì)胞株，其特征在于，命名為人胰腺癌細(xì)胞系BXPC-3M8，保藏號為:CCTCC NO: C2016119。2. 如權(quán)利要求1所述的胰腺癌細(xì)胞株的子代細(xì)胞。3. 如權(quán)利要求1所述胰腺癌細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法為 Transwel 1迀移試驗(yàn)法，起始細(xì)胞株為胰腺癌細(xì)胞BxPC-3，試驗(yàn)重復(fù)次數(shù)為8次。4. 如權(quán)利要求1所述的胰腺癌細(xì)胞株在建立哺乳動(dòng)物胰腺癌模型中的應(yīng)用。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的哺乳動(dòng)物為裸小鼠或裸大鼠。6. 如權(quán)利要求1所述的胰腺癌細(xì)胞株在提取胰腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的標(biāo)志物中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求1所述的胰腺癌細(xì)胞株在篩選或評估治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求1所述的胰腺癌細(xì)胞株在開發(fā)胰腺癌復(fù)發(fā)檢測試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925530SQ201610435135
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】蔣東海, 陳炳潔, 謝海洋, 周琳, 鄭樹森
【申請人】浙江大學(xué)