穩(wěn)定的二氧化氯和過氧化合物的協(xié)同性組合和使用方法
【專利摘要】使用(a)穩(wěn)定的二氧化氯(SCD)和(b)過氧化合物(PC)控制發(fā)酵工藝中污染性微生物生長的方法。所述方法包括將SCD和PC加入發(fā)酵工藝的一個(gè)或多個(gè)步驟中。在該方法中，可將SCD和PC加入發(fā)酵液體培養(yǎng)基的一種或多種組分中，所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基包括接種物、可發(fā)酵糖和工藝用水。
【專利說明】
穩(wěn)定的二氧化氯和過氧化合物的協(xié)同性組合和使用方法
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2011年12月20日，申請(qǐng)?zhí)枮?01180061146.1，發(fā)明名稱為"使用 包含穩(wěn)定的二氧化氯和過氧化物的協(xié)同性制劑減少乙醇發(fā)酵中污染性微生物的長"的發(fā)明 專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及穩(wěn)定的二氧化氯和過氧化合物的協(xié)同性組合和使用方法，尤其是在發(fā) 酵工藝中。
【背景技術(shù)】
[0003] 在過去十年中，乙醇作為運(yùn)輸燃料的用途已顯著提高。美國的乙醇生產(chǎn)從2000年 的約64億升提高至2009年的超過370億升。乙醇工廠的數(shù)量從2000年的54個(gè)提高至2009年 的170個(gè)。在拉下美洲和歐洲已出現(xiàn)類似的生產(chǎn)和工廠建設(shè)的增多。在2007年，美國國會(huì)頒 布了能源獨(dú)立和安全法案化nergy Ind邱endence and Security ActKH.R.6)，其設(shè)定了 到2022年1360億升乙醇的可再生燃料標(biāo)準(zhǔn)。如果要達(dá)到該標(biāo)準(zhǔn)，則乙醇工業(yè)將繼續(xù)成長。
[0004] 目前工業(yè)乙醇（例如燃料)和食用乙醇均通過發(fā)酵工藝從農(nóng)業(yè)(天然）原料中大規(guī) 模生產(chǎn)，其中通過接種酵母將糖轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳。許多原料可用于提供發(fā)酵糖，包括 潛在的任何淀粉或纖維素材料，它們包括幾乎所有植物，因?yàn)槿魏蔚矸刍蚶w維素可為糖前 體。一些尤其適于生產(chǎn)燃料乙醇的常用原料包括玉米、蜀泰、高梁、甘薦、糖用甜菜和糖蜜。
[0005] 用于乙醇生產(chǎn)的原料是天然產(chǎn)品，因此，在所述原料中可能在天然情況下存在多 種多樣的微生物，諸如細(xì)菌、真菌和酵母。商業(yè)發(fā)酵工藝條件并非完全無菌，因此運(yùn)些"污染 性微生物"將在工藝中存在。在商業(yè)乙醇生產(chǎn)中，最成問題的微生物是產(chǎn)乳酸細(xì)菌和產(chǎn)乙酸 細(xì)菌。此類細(xì)菌從多種來源進(jìn)入該工藝，所述來源包括原材料、設(shè)備、工藝用水、空氣和接種 酵母等。通過隨進(jìn)料物質(zhì)（原材料、水、空氣、酵母）引入或由于利于細(xì)菌生長的條件導(dǎo)致的 天然擴(kuò)增，此類細(xì)菌的濃度可在加工環(huán)境中提高。用于酵母生產(chǎn)的最佳空氣環(huán)境也極度有 利于運(yùn)些細(xì)菌的生長。由細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī)酸抑制了酵母的生長并因此降低了乙醇生產(chǎn)率。 細(xì)菌還可消耗糖和其它營養(yǎng)物質(zhì)，其旨在用于由酵母利用來產(chǎn)生所期望的產(chǎn)物，運(yùn)導(dǎo)致了 整個(gè)過程經(jīng)濟(jì)效益更低。
[0006] 大量的發(fā)酵工藝使用抗生素作為抗微生物組合物。運(yùn)類用途已經(jīng)變得不受歡迎， 運(yùn)是因?yàn)榭股啬退幖?xì)菌的可疑發(fā)展W及抗生素殘余物在發(fā)酵副產(chǎn)物中的積累所致。抗生 素耐藥細(xì)菌是人類健康的重大問題。
[0007] 乙醇生產(chǎn)的副產(chǎn)物包括在對(duì)乙醇產(chǎn)物蒸饋后所收集的固體。此類固體包括含可溶 物的干酒糟(DDGS)和含可溶物的濕酒糟(DWGS)。很多國家和地區(qū)正在考慮能限制或消除抗 生素對(duì)乙醇生產(chǎn)的使用的管理措施。孤GS和DWGS作為動(dòng)物飼料產(chǎn)品進(jìn)行銷售。
[000引對(duì)抗微生物處理的需求不斷增長，運(yùn)不僅是由于乙醇產(chǎn)量的增長，還由于乙醇生 產(chǎn)設(shè)施尺度的擴(kuò)張。雖然數(shù)年之前生產(chǎn)150-200百萬升/年(MMly)的工廠被認(rèn)為是大型設(shè) 施，但是現(xiàn)在380MMly(或更高）的設(shè)施是工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。在分批補(bǔ)料加工中，單個(gè)發(fā)酵批次的體 積已顯著提高。為容納該增加的容積，在最大的乙醇生產(chǎn)設(shè)施中進(jìn)入發(fā)酵系統(tǒng)的原料(一旦 其制備用于進(jìn)入發(fā)酵，通常稱為"膠(mash)")的流速已從約2000-3000升/分鐘提高至4500- 6000升/分鐘。
[0009] WO 2007/149450描述了使用穩(wěn)定的二氧化氯（SCD)來防止乙醇生產(chǎn)中的細(xì)菌污 染。SCD在乙醇生產(chǎn)中顯著的細(xì)菌生長發(fā)生前加入，其作為預(yù)防性而非補(bǔ)救性措施。污染性 細(xì)菌在糖向酒精的發(fā)酵之前或其間的生長由此而基本被阻止，生產(chǎn)了增強(qiáng)接種酵母生長并 且使接種酵母能夠生產(chǎn)乙醇而不受由細(xì)菌產(chǎn)生的有機(jī)酸的抑制的條件。
[0010] 盡管一些方法是已知的，但是對(duì)用于解決發(fā)酵工業(yè)中含碳水化合物的原料和發(fā)酵 工藝中污染性微生物的改善方法存在著需求。改善的方法應(yīng)優(yōu)選地是無抗生素并且并不生 產(chǎn)在發(fā)酵副產(chǎn)物中積累的殘余物或不產(chǎn)生抗生素耐藥細(xì)菌。所述方法應(yīng)在發(fā)酵工業(yè)中遇到 的多種多樣的pH范圍和條件下有效。所述方法還應(yīng)使用在使用前具有合理儲(chǔ)存壽命的處 理。對(duì)于改善當(dāng)今較大體積發(fā)酵工藝的經(jīng)濟(jì)性也存在著需求。本發(fā)明滿足運(yùn)些需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明提供了使用(a)穩(wěn)定的二氧化氯(SCD)和(b)過氧化合物(PC)的組合控制發(fā) 酵工藝中污染性微生物生長的方法。所述方法包括將SCD和PC(諸如過氧化氨)加入發(fā)酵工 藝的一個(gè)或多個(gè)步驟中，其中所述發(fā)酵工藝包括（i)提供接種物、可發(fā)酵糖和工藝用水；
[11] 將接種物、可發(fā)酵糖和工藝用水單獨(dú)或W任何組合引入發(fā)酵容器W提供發(fā)酵液體培養(yǎng) 基；（iii)在接種物將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成乙醇的溫度下，在發(fā)酵容器中使所述接種物與所述可 發(fā)酵糖接觸。任選地，將營養(yǎng)物質(zhì)加入接種物、可發(fā)酵糖和工藝用水的一種或多種中。還可 將營養(yǎng)物質(zhì)直接加入發(fā)酵容器中。在將接種物、可發(fā)酵糖或工藝用水中的每一種引入發(fā)酵 容器之前可將SCD和PC加入運(yùn)些物質(zhì)中。作為另外一種選擇，可直接將SCD和PC加入發(fā)酵容 器中。
[0012] 可向該過程中單獨(dú)加入穩(wěn)定的二氧化氯和過氧化合物。當(dāng)單獨(dú)加入組分時(shí)，該組 分可同時(shí)加入或W任何順序按順序加入。即，可在相同時(shí)間加入組分（同時(shí)），或者可在加入 其它組分之前加入一種組分（按順序）。作為另外一種選擇，所述方法可包括將組分(a)和 (b)在加入發(fā)酵工藝之前進(jìn)行接觸。
[0013] 本發(fā)明提供了用于控制發(fā)酵液體培養(yǎng)基中反應(yīng)物(本文下文進(jìn)行定義)和發(fā)酵工 藝的產(chǎn)物中污染性微生物生長的方法。所述方法還控制了發(fā)酵系統(tǒng)的組件表面上的污染性 微生物的生長。所述方法由W下步驟組成，基本上由W下步驟組成或包括W下步驟:將二氧 化氯和過氧化合物加入反應(yīng)物或發(fā)酵液體培養(yǎng)基中或加入發(fā)酵系統(tǒng)的表面上或容器中。
[0014] 本發(fā)明還提供了組分的組合，其可用于原位清潔(CIP)應(yīng)用W處理發(fā)酵工藝中使 用的設(shè)備表面。乂 IP"在本文是指可清潔表面而無需拆解所述設(shè)備。
[0015] 所述方法包括加入有效量的包含SCD和PC的組分的組合，W控制污染性微生物的 生長，而對(duì)于發(fā)酵工藝所用的接種物無有害影響。有效量根據(jù)組分的組合使用的方式而變 化，但是可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本文的公開內(nèi)容確定。W發(fā)酵液體培養(yǎng)基的總體積計(jì)， SCD通常W在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中提供0.0002重量％至5重量％的SCD濃度的量加入。W發(fā)酵 液體培養(yǎng)基的總體積計(jì)，PC通常還W在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中提供0.0002重量％至5重量％的 PC濃度的量加入。
[0016] 本發(fā)明的方法還提供了在碳水化合物原料中控制至少一種污染性微生物生長的 方法，其中所述提供可發(fā)酵糖的步驟包括提供碳水化合物原料并使所述原料與SCD和PC接 觸，其中W總原料重量計(jì)，所述原料的碳水化合物含量是至少1重量％并且優(yōu)選1重量％至 70重量％，并且其中SCD和PC W有效量加入。通常，W原料的總重量計(jì)，SCD W IOppm至 100化pm的SCD的量加入，并且W原料的總重量計(jì)，PC通常W IOppm至1000 ppm的過氧化合物 的量加入。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明提供了用于控制污染性微生物生長的方法，所述方法包括W下步驟、基本 上由W下步驟組成、或由W下步驟組成:將包含穩(wěn)定的二氧化氯(SCD)和過氧化合物(PC)的 組分的組合加入發(fā)酵工藝的一個(gè)或多個(gè)步驟中。W有效控制污染性微生物的生長而不抑制 接種酵母將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳的能力的量將SCD和PC的協(xié)同性組合加入所述 方法中。通常加入SCD和PCW在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中提供0.0002重量％至5重量％的5〔0濃度 并在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中提供0.0002重量％至5重量％的？(：濃度，其各自W發(fā)酵液體培養(yǎng)基 的總體積計(jì)。
[0018] 本發(fā)明在提供可發(fā)酵糖的步驟中還提供了在碳水化合物原料中控制至少一種污 染性微生物生長的方法，所述方法包括W下步驟、基本上由W下步驟組成、或由W下步驟組 成:提供碳水化合物原料W及將穩(wěn)定的二氧化氯和過氧化合物加入所述原料中。
[0019]
[0020] W下術(shù)語具有如下所提供的定義W用于本文。
[0021 ]含水介質(zhì)是指基本上是水的介質(zhì)，例如大于80%，優(yōu)選大于90%，更優(yōu)選大于95% 的含水量。含水介質(zhì)可為大于99%的水。工藝用水是含水介質(zhì)的一個(gè)例子。
[0022] 碳水化合物原料是指用于制備可發(fā)酵糖或直接作為可發(fā)酵糖的原料。即，碳水化 合物原料是可發(fā)酵糖或包含可發(fā)酵糖的組合物或可轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的組合物。
[0023] 碳水化合物原料可包含至多100重量％的碳水化合物。W原料的總重量計(jì)，碳水化 合物原料一般包含在1 %和70%之間，優(yōu)選在2%和40%之間的碳水化合物，其作為含水介 質(zhì)中的溶液或懸浮液。原料中的碳水化合物的量和組成可根據(jù)期望的最終用途而變化。例 如玉米漿，它是獲自濕磨方法的碳水化合物溶液，其可包含16.5 %的碳水化合物。在濕磨方 法中，將玉米浸潰或浸泡，然后分成多種組分。玉米漿是已將玉米長期浸泡后獲得的含水液 體，在此期間從玉米固體中提取可易于發(fā)酵的可溶性組分，其溶于浸泡水中。來自濕磨方法 的淀粉組分可包含至多40重量％的碳水化合物。
[0024] 碳水化合物原料可包含其它組分，它們一般起到溶液和/或懸浮液助劑的作用。例 如碳水化合物原料可包含酶、表面活性劑、分散劑、消泡組合物、礦物質(zhì)、痕量元素、W及它 們中兩種或更多種的組合。運(yùn)些組分W及作為助劑的其它組分是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知 的。
[0025] 應(yīng)用于本文微生物生長的控制是指降低和/或防止祀向的非期望的污染性微生物 生長。如本文所用的控制微生物的生長還包括將微生物群體維持于所期望的水平、將微生 物群體降低至所期望的水平(部分地降低或甚至降低至不可檢出的限度，例如零群體)和/ 或抑制微生物的生長。
[0026] 有效量在本文是指SCD和PC各自的量，在加入發(fā)酵工藝中時(shí)其W組合形式對(duì)于在 對(duì)發(fā)酵工藝所用的接種物無有害影響的情況下控制污染性微生物的生長是有效的。
[0027] 可發(fā)酵糖是反應(yīng)物和用于乙醇發(fā)酵工藝中的接種物的常用營養(yǎng)物質(zhì)。可發(fā)酵糖是 糖(例如葡萄糖)或淀粉，其通過酵母的作用轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳。公式(1)示出了葡萄糖 (C巧12〇6)的工藝。
[002引 C 巧 1206 一 2C2 也 0H+2C02 (1)
[0029] 如本文所用的可發(fā)酵糖是碳水化合物，所述碳水化合物來源于基本上包括糖、淀 粉和/或纖維素的任何植物來源，其通常W糖、淀粉和/或纖維素的水溶液或水懸浮液的形 式提供。淀粉和/或纖維素可通過本領(lǐng)域中已知的方法(例如使用酶)轉(zhuǎn)化成用于本發(fā)明方 法的可發(fā)酵糖?？砂l(fā)酵糖可來源于淀粉源或一種或多種纖維素材料源，諸如玉米、高梁、小 麥、木屑、蜀泰、大麥、粟、甘薦、糖用甜菜、糖蜜、乳清、馬鈴馨、小麥賴桿、玉米賴桿、柳枝稷、 藻類、海藻和/或其它生物源?？砂l(fā)酵糖還可來源于果汁(例如葡萄、蘋果）。作為另外一種選 擇，可發(fā)酵糖可來源于非傳統(tǒng)的原料，諸如木材廢料、薦渣、紙材廢料和市政固體垃圾。將運(yùn) 些來源轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。參見J.Y. Zhu等人， Bioresource Technology(2010)，第101卷（13)，第4992-5002頁；W及A.L.Demain, J. Ind.Microbiol.Biotechnol. ,(2009)，第36卷（3)，第319-332頁W供參考。
[0030] 可發(fā)酵糖使用干磨或濕磨方法方便地獲自玉米。在干磨方法中，將玉米研磨成粗 粉并且在不分離的情況下加工成其組成性組分，所述組成性組分基本上包含纖維、淀粉、油 和蛋白質(zhì)。在濕磨方法中，將玉米浸泡或浸沒入水中，然后W機(jī)械方式分離成其組成性組 分。將來自濕磨方法的玉米淀粉組分或來自干磨方法的粗粉(玉米面)與水和酶混合進(jìn)行烹 制W使淀粉增溶。
[0031] 玉米淀粉是多糖，即，由單個(gè)葡萄糖單元制成的聚合物。通過酶(a-淀粉酶)將玉米 淀粉轉(zhuǎn)化成較小(較短）的多糖，即糊精。使用酶(葡糖淀粉酶)將較小的多糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖 (單糖），從而形成可發(fā)酵糖。
[0032] 作為玉米的替代品，可發(fā)酵糖可來源于糖蜜。糖蜜可獲自包括甘薦或糖用甜菜在 內(nèi)的多種來源，例如作為制造結(jié)晶糖工藝的副產(chǎn)物。糖蜜通常W糖漿而獲得，在準(zhǔn)備進(jìn)行發(fā) 酵中可向其中加入其它成分。運(yùn)些其它成分包括甘薦汁、甜菜汁、水和維生素或其它營養(yǎng)物 質(zhì)。是否加入其它成分中的一種或多種W及所加入的量應(yīng)在糖蜜來源的可發(fā)酵糖中有所變 化。
[0033] 作為玉米的替代品，可發(fā)酵糖可來源于甘薦汁。甘薦汁是用水從甘薦中提取的汁。 從甘薦中提取汁還通過物理壓碎、水中擴(kuò)散或本領(lǐng)域的技術(shù)人員一般熟知的其它方法完 成。參見例如H.V.Amorim等人在叮he Alcohol Textbook" (2009) ,Nottin曲am University Press , Nottinghamfltl^S9-46^EPA Food and Agricultural Industries 化n化ook，第9.10.1. 1章(甘薦)和第0.10.1.2章(糖用甜菜），其購自]11:化://\￥麗.邱日.邑〇￥/ ttnchiel/ap42/ch09/(訪問于2011年12月18日)。甘薦汁可無需進(jìn)一步加工而使用，并作為 可發(fā)酵糖直接加入發(fā)酵容器中。
[0034] 出于本文的目的，用于生產(chǎn)碳水化合物原料和可發(fā)酵糖的步驟是發(fā)酵工藝的步 驟。即，所述發(fā)酵工藝包括生產(chǎn)碳水化合物原料的步驟，W及將淀粉和/或纖維素轉(zhuǎn)化成可 發(fā)酵糖的步驟。
[0035] 在發(fā)酵工藝中，包括糖和淀粉在內(nèi)的碳水化合物通常W發(fā)酵液體培養(yǎng)基的總體積 計(jì)W約5至約40% (重量/體積），優(yōu)選在約10至35% (重量/體積）的范圍內(nèi)的濃度存在于發(fā) 酵液體培養(yǎng)基中。
[0036] 如本文所用的發(fā)酵液體培養(yǎng)基是指在發(fā)酵工藝期間在已加入所有反應(yīng)物后發(fā)酵 容器的內(nèi)容物，并且其通常包含可發(fā)酵糖、接種物、任選的營養(yǎng)物質(zhì)和工藝用水。
[0037] 如本文所用的發(fā)酵工藝是指包括使接種物(諸如酵母)在工藝用水中與可發(fā)酵糖 和任選的營養(yǎng)物質(zhì)接觸W生產(chǎn)乙醇的方法。發(fā)酵工藝可為分批的或連續(xù)的。此外，出于本文 的目的，發(fā)酵還包括用于制備或預(yù)處理反應(yīng)物中的一種或多種的步驟，諸如由天然來源制 備可發(fā)酵糖的工藝和酵母增殖。
[0038] 所述接觸步驟在使接種物將糖轉(zhuǎn)化成乙醇和二氧化碳的溫度下進(jìn)行。
[0039] 當(dāng)通過干磨方法使用玉米作為原料產(chǎn)生乙醇時(shí)，發(fā)酵工藝可包括W下步驟中的一 個(gè)或多個(gè):對(duì)玉米制漿、液化、糖化、制備接種酵母(增殖）、發(fā)酵膠(接種物作用于糖上W生 產(chǎn)乙醇的實(shí)際步驟）、分離并回收所得乙醇W及任選地再循環(huán)利用接種酵母廢料。發(fā)酵工藝 可包括W下步驟中的一個(gè)或多個(gè):制備接種酵母、通過稀釋、己氏消毒或其它此類方法制備 汁、發(fā)酵、分離并回收乙醇W及任選地再循環(huán)利用酵母。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，運(yùn)些 加工步驟可根據(jù)原料有效性和工廠設(shè)計(jì)與工廠位置而變化。
[0040] 如本文所用的發(fā)酵系統(tǒng)包括組件(設(shè)備），諸如容器和管道，發(fā)酵工藝的一種或多 種反應(yīng)物和產(chǎn)物在其內(nèi)和通過其存留或流通。此類設(shè)備具有可存在細(xì)菌和其它污染性(非 期望的）微生物的表面。發(fā)酵系統(tǒng)的一部分是發(fā)酵容器一-在其中進(jìn)行使可發(fā)酵糖與接種 物反應(yīng)W生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵步驟的容器。
[0041] 當(dāng)通過干磨方法生產(chǎn)乙醇時(shí)，發(fā)酵系統(tǒng)可包括一種或多種容器，諸如漿液槽、液化 槽、糖化槽、酵母增殖槽和發(fā)酵容器。此類容器及其用途對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。 參見例如R.J.Bothast和M.A.Schlicher,Applied Microbiology and Biotechnology (2005)，第67卷（I)，第19-25頁。當(dāng)通過濕磨方法生產(chǎn)乙醇時(shí)，發(fā)酵系統(tǒng)可包括一種或多種 容器，諸如浸槽(steep tank)、分離槽、酵母增殖槽和發(fā)酵容器。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了 解，運(yùn)些加工步驟可根據(jù)原料有效性和工廠設(shè)計(jì)與工廠位置而變化。
[0042] 接種物是有目的地加入工藝來將原料(輸入)轉(zhuǎn)化成所期望的產(chǎn)物(輸出）的任何 微生物。出于本文的目的，接種物為能夠?qū)⒖砂l(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成乙醇的微生物。酵母是用于乙醇 發(fā)酵的常用接種物。酵母是能夠在有氧(具有氧氣)或無氧(缺乏氧氣)環(huán)境中生存并且生長 的微生物。接種物還可選自能夠?qū)⒖砂l(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成乙醇的真菌和藻類。例如，可使用產(chǎn)乙醇 細(xì)菌作為接種物通過纖維素生產(chǎn)乙醇。當(dāng)根據(jù)本文所述方法而使用時(shí)，接種物細(xì)菌并非如 產(chǎn)乳酸和產(chǎn)乙酸細(xì)菌那樣受到穩(wěn)定的二氧化氯和過氧化合物的不利影響。
[0043 ] W下的討論針對(duì)接種物是酵母的工藝。
[0044]出于本文的目的，接種酵母是針對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)中的特定轉(zhuǎn)化而特意選擇的酵母。例 如，可針對(duì)在酵母增殖中產(chǎn)生附加酵母(諸如用作面包酵母)而選擇接種酵母;可針對(duì)用于 產(chǎn)生酶的特定營養(yǎng)物質(zhì)的代謝而選擇接種酵母。在該具體的應(yīng)用中，針對(duì)發(fā)酵可發(fā)酵糖來 產(chǎn)生所期望質(zhì)量和提高量的乙醇而選擇接種酵母。接種酵母一般是由于它們完全發(fā)酵有效 糖的能力、對(duì)高水平滲透脅迫、高溫和高濃度乙醇的耐受而被選擇的。酵母常用于乙醇發(fā) 酵。酵母是能夠在有氧(具有氧氣)或無氧(缺乏氧氣)環(huán)境中生存并且生長的微生物。用于 本發(fā)明的方法的合適接種酵母包括但不限于啤酒糖酵母（Saccharomyces cereviSiae (S . cereviSiae))、葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarunKS . uvarum))、粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe(S.pombe))和克魯維酉奉母屬(Kluyveromyces sp)。
[0045] 可將接種酵母作為酵母種菌引入發(fā)酵容器，所述接種物為接種酵母的活化形式。 即，在將接種酵母引入發(fā)酵容器之前通過在增殖槽中將酵母起始培養(yǎng)物接觸營養(yǎng)組合物來 增殖酵母(增加其量）W產(chǎn)生酵母種菌。營養(yǎng)組合物包含一種或多種可發(fā)酵糖、酶、附加的營 養(yǎng)物質(zhì)和水W生長或活化酵母。增殖槽是與發(fā)酵容器分離的容器并且在合適的溫度條件下 運(yùn)行(例如68-104了，20-40°C )。各接種物將具有增殖的優(yōu)選溫度。例如，30-32°C (86-90了） 的溫度可能特別適于增殖。雖然據(jù)了解酵母增殖可在發(fā)酵工藝中于發(fā)酵容器內(nèi)進(jìn)行，但是 酵母在增殖槽中的活化提供了高度活性的接種酵母。因此，將高度活性的酵母引入發(fā)酵容 器。此類酵母增殖技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。參見例如E. Bellissimi等人， Process BiochemiStry (2005)，第40卷（6)，第2205-2213頁；和M.Knauf 等人，Sugar Industry(2006)，第 131 卷，第753-758頁。
[0046] 對(duì)于連續(xù)發(fā)酵工藝，通常沒有單獨(dú)的酵母增殖槽。在連續(xù)方法中酵母可再循環(huán)利 用或不可再循環(huán)利用。當(dāng)無可用的再循環(huán)利用時(shí)，酵母在稱為主發(fā)酵的階段連續(xù)生長并生 產(chǎn)乙醇。當(dāng)有可用的再循環(huán)利用時(shí)，諸如在使用糖蜜或甘薦汁作為可發(fā)酵糖的原料時(shí)的常 見情況，通過與其它發(fā)酵組分分離來再循環(huán)利用酵母(通常使用離屯、)并且其通常在分離的 槽(一般稱為酵母再循環(huán)利用槽）內(nèi)使用酸來調(diào)理酵母細(xì)胞W用于新的發(fā)酵循環(huán)。作為另外 一種選擇，可從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分離酵母，隨后進(jìn)行干燥并且固化為副產(chǎn)物。此類步驟是 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。參見例如，E.A.N.Fernandes等人，Journal of Radioanalytical and Nuclear 畑emistry(1998)第234卷（1-2)，第113-119頁；和 L.C.Basso等人，F(xiàn)EMS Yeast Res. (2008)vol.，第1155-1163頁。
[0047] 相對(duì)于細(xì)菌，酵母可具有中等至緩慢的發(fā)酵速度。為補(bǔ)償其代謝率，在大規(guī)模工業(yè) 乙醇生產(chǎn)中可能需要大量的酵母一般W通常約1 X IO5至1 X IO7細(xì)胞/克發(fā)酵液體培養(yǎng)基的 量將接種酵母加入發(fā)酵工藝。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，該量可根據(jù)所使用的發(fā)酵工藝 而變化。
[0048] 歷在本文用于指包含可發(fā)酵糖的組合物。膠包括在水中的混合谷物或其它可發(fā)酵 碳水化合物的混合物，其在從可發(fā)酵糖與水的混合至任何調(diào)至和糖化之前直至完成發(fā)酵的 任何階段W用于乙醇生產(chǎn)，如^JacquesJiA.，Lyons，T.P.，Kelsall，D.R, "The Alcohol 了6又憂〇〇4"，2003,423-424，齡1:1:;[]1曲日1]11]]1；[￥6'3；[17?的33,服中所定義。
[0049] 在本發(fā)明的上下文中，微生物分兩種，即期望的和污染性(非期望的)微生物。期望 的微生物具有消耗營養(yǎng)物質(zhì)^將可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成乙醇的能力。期望的微生物包括接種物， 諸如酵母、啤酒糖酵母，其用于葡萄糖發(fā)酵成乙醇和二氧化碳。其它期望的微生物在其它生 物精制方法中使用。期望的微生物通常不存在于碳水化合物原料中。當(dāng)期望的微生物存在 于碳水化合物原料中時(shí)，所存在的存活細(xì)胞的數(shù)量通常過低而不能有利地與還存在于所述 原料中的其它微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。
[0050] 污染性微生物是與接種物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)并且消耗可發(fā)酵糖和營養(yǎng)物質(zhì)的微生物。污染 性微生物生產(chǎn)非期望的產(chǎn)物并且/或者W遠(yuǎn)低于接種物所生產(chǎn)的速度來生產(chǎn)乙醇。
[0051] 污染性微生物包括細(xì)菌、真菌、野生的或污染的酵母W及能夠代謝碳水化合物原 料組分W維持微生物生存能力的其它微生物。污染性微生物污染碳水化合物原料、消耗原 料W作為支持其生長食物來源、進(jìn)行增殖并且因此耗盡了所述原料。
[0化2] 污染性微生物如污染性酵母常存在于工業(yè)和食用乙醇生產(chǎn)中，并且可引起嚴(yán)重的 污染事件，導(dǎo)致發(fā)酵工藝中的乙醇產(chǎn)量降低。運(yùn)些不良微生物可通過可發(fā)酵糖(原料）、工藝 用水、空氣、操作人員和大量的其它來源而引入所述工藝。
[0053] 污染性微生物如細(xì)菌(包括乳酸菌(乳桿菌屬的菌種））利用葡萄糖原料生成產(chǎn)物 如乙酸和乳酸，它們不僅消耗原料并因此阻止原料轉(zhuǎn)化成期望的產(chǎn)物，而且不利地影響生 物精制過程中期望的微生物。例如，乙酸和乳酸不利地影響啤酒糖酵母將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙 醇的速率。其它污染性細(xì)菌包括片球菌屬(Pediococcus )、腸球菌屬化nterococcus)、醋桿 菌屬(Acetobacter)、葡糖桿菌屬(Gluconobacter)和梭菌屬(Clostridium)。
[0054] 營養(yǎng)物質(zhì)是指支持接種酵母或其它接種物微生物的生長和/或存活的元素，例如 營養(yǎng)物質(zhì)可為碳、氮、氧、硫、憐、儀和多種微量元素(諸如金屬)的來源。碳源可為醇，諸如甲 醇，或是控，諸如辛燒。碳源還可為可發(fā)酵糖。氮源可為尿素、氨、錠鹽或硝酸鹽。鹽諸如硫酸 儀可提供儀和硫。憐可W鋼鹽或鐘鹽來供應(yīng)，而氧可通過將空氣引入所述工藝來供應(yīng)?？墒?用其它形式的氣態(tài)氧，諸如純氧或氧/氮混合物。其它元素可直接加入或可天然存在于工藝 組分中。
[0055] 如本文所使用，過氧化合物是指包含至少一個(gè)氧氧單鍵的化合物。優(yōu)選的過氧化 物選自氨過氧化物、有機(jī)過氧化物、無機(jī)過氧化物和釋放過氧的化合物。
[0056] 氨過氧化物是通式R-O-O-H的化合物，其中R是氨或具有1至20個(gè)碳原子的直鏈燒 基、支化烷基或環(huán)狀烷基自由基，并且可任選地W-個(gè)或多個(gè)氧和/或幾基間隔。氨過氧化 物的例子包括但不限于過氧化氨、過氧乙酸、叔下基氨過氧化物、氨過氧化枯締和乙酸氨過 氧化物。
[0057] 有機(jī)過氧化物是具有通式Ri-O-O-R2的化合物，其中Ri和R2獨(dú)立地為具有1至20個(gè) 碳原子的直鏈烷基、支化烷基和/或環(huán)狀烷基自由基，并且可任選地W-個(gè)或多個(gè)氧和/或 幾基間隔。有機(jī)過氧化物的例子包括但不限于過氧化苯甲酯和過氧化二叔下燒。
[0化引無機(jī)過氧化物是包含022-陰離子并且具有通式M2化或Mi化的化合物，其中M是堿性 金屬并且Mi是堿±金屬。無機(jī)過氧化物的例子包括但不限于過氧化鋼、過氧化巧和過氧化 領(lǐng)。
[0059] 釋放過氧的化合物也用于本發(fā)明。更具體地，釋放過氧的無氮化合物在本文定義 為能夠在加入水體系后釋放過氧化氨或其它含氧自由基的任何無氮物質(zhì)。釋放過氧的化合 物的例子包括過碳酸鹽、過棚酸鹽和過氧化物的堿金屬、堿±金屬和過渡金屬化合物，W及 它們的合適混合物。優(yōu)選的釋放過氧的化合物包括但不限于過碳酸鋼、過棚酸鋼、過氧化 鋼、過氧化巧、過氧化酶和過氧化鋒。
[0060] 優(yōu)選地，用于本發(fā)明的過氧化物是過氧化氨，本文稱為巧P"。冊(cè)可在水中W33重 量％至37重量％的濃度商購獲得。商購獲得的HP還可包含添加劑。添加劑包括穩(wěn)定劑，諸如 憐酸或其它礦物酸，W及抑制劑，諸如焦憐酸鹽和錫酸鹽化合物。
[0061] 防腐和保存是指處理碳水化合物原料^防止污染性微生物(諸如細(xì)菌)對(duì)碳水化 合物的反應(yīng)或消耗。保存在至少一個(gè)月的時(shí)長上提供穩(wěn)定的碳水化合物原料，其不發(fā)生實(shí) 質(zhì)的改變，諸如由于微生物代謝導(dǎo)致的碳水化合物的反應(yīng)或消耗。改變的一個(gè)量度是所保 存原料的微生物群體。當(dāng)適當(dāng)保存時(shí)，碳水化合物原料不發(fā)生大于llogioCFU/ml或 llogioCFU/g的原料中的微生物群體的增加。通常微生物群體用IogioC即/ml(用于液體原 料)和Iogi日C即/g (用于固體/半固體原料)表示。Iogi日C即/g的表達(dá)方式也可用于液體原料。
[0062] 對(duì)于保存，變化的第二種度量為基于所述原料中特定酸類的濃度。酸是產(chǎn)生自污 染性細(xì)菌對(duì)碳水化合物的反應(yīng)和/或消耗的產(chǎn)物。例如，已知污染碳水化合物原料的某些細(xì) 菌通過消耗碳水化合物而產(chǎn)生乳酸和乙酸。碳水化合物原料中提高濃度的乳酸和乙酸可用 于顯示所述原料是否適當(dāng)?shù)乇４?。?dāng)適當(dāng)保存時(shí)，碳水化合物原料中的乳酸濃度低于 0.60 % (重量/體積），并且碳水化合物原料中的乙酸濃度低于0.30 % (重量/體積）。
[0063] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)理解，可使用其它的改變量度。例如，檢測(cè)到非期望化合物 (例如來自碳水化合物原料代謝的產(chǎn)物)的存在可指示改變。檢測(cè)方法可包括分光光度測(cè)定 法、色譜法W及本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方法。其它量度可包括碳水化合物原料的物 理變化如比重或粘度的改變。
[0064] 反應(yīng)物是指接種物、可發(fā)酵糖、任選的營養(yǎng)物質(zhì)^及發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的其它任 選組分。出于本文的目的，反應(yīng)物還包括工藝用水。
[0065] 穩(wěn)定的二氧化氯本文也稱為"SCD"，是指一種或多種含二氧化氯的氧-氯絡(luò)合物、 一種或多種含亞氯酸根的化合物、當(dāng)暴露于酸時(shí)能夠形成二氧化氯的一種或多種其它物質(zhì) W及它們的組合。因此，穩(wěn)定的二氧化氯包含至少一種含二氧化氯的氧-氯絡(luò)合物、含亞氯 酸根的化合物或當(dāng)暴露于酸時(shí)能夠在液體基質(zhì)中形成二氧化氯的物質(zhì)。本文所定義的SCD 是可商購獲得的產(chǎn)品。
[0066] 優(yōu)選的含二氧化氯的氧-氯絡(luò)合物選自二氧化氯與碳酸鹽的絡(luò)合物、二氧化氯與 碳酸氨鹽的絡(luò)合物W及它們的混合物。含亞氯酸根的化合物的例子包括金屬亞氯酸鹽，具 體地包括堿金屬亞氯酸鹽和堿±金屬亞氯酸鹽。用作SCD(二氧化氯前體）的含亞氯酸根的 化合物的具體例子是亞氯酸鋼，其可用作工業(yè)級(jí)亞氯酸鋼。
[0067] SCD優(yōu)選地W水溶液的形式使用，諸如堿金屬或堿±金屬亞氯酸鹽，通常為亞氯酸 鋼(NaCl化）。溶液中的亞氯酸鋼在高于7的抑下一般是穩(wěn)定的，但是當(dāng)抑低于中性(pH 7)時(shí) 釋放活性二氧化氯(C1〇2)dSCD活化速率（即，活性Cl化從穩(wěn)定形式釋放的速率)隨著P啡華低 而提局。
[0068] 多種SCD組合物，具體地包含二氧化氯的氧-氯絡(luò)合物的確切化學(xué)組成尚未被完全 理解。某些二氧化氯前體的制造或制備描述于Gordon的美國專利3,585,147和Lovely的美 國專利3,591，515中?？缮藤彨@得的并且有用的穩(wěn)定的二氧化氯的具體例子包括例如購自 E.I.du Pont de Nemours and Company,Wilmington DE的ANTHIUM DI0XCIDE和 陽RMASURE ;購自 Bio-Cide International，Inc.，Norman，OK的OXI肥和PUROGE肥。
[0069] 可通過W下物質(zhì)的溶液的形式提供SCD:-種或多種包含二氧化氯的氧-氯絡(luò)合 物、一種或多種含亞氯酸根的化合物或當(dāng)暴露于酸時(shí)能夠形成二氧化氯的一種或多種其它 物質(zhì)、W及它們的組合。溶液在液體培養(yǎng)基中W預(yù)定濃度的"有效二氧化氯"提供SCD。"有效 二氧化氯"的濃度為基于二氧化氯從一種或多種包含二氧化氯的氧-氯絡(luò)合物的完全 (100%)釋放和/或一種或多種含亞氯酸根的化合物向二氧化氯的完全（100%)轉(zhuǎn)化和/或 二氧化氯通過能夠形成二氧化氯的一種或多種其它物質(zhì)的完全（100%)形成。優(yōu)選地，SCD 溶液具有足量的SCDW具有WSCD溶液的總重量計(jì)在約0.002重量％至約40重量％范圍內(nèi)， 優(yōu)選在約2重量％至約25重量％范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約5重量％至約15重量％范圍內(nèi)的有效二 氧化氯濃度。
[0070] SCD可W固體材料來提供，例如包含堿或堿±金屬亞氯酸鹽固體、惰性成分W及任 選的干燥激活因子如干酸的組合物。
[0071] SCD也可W混合物(或漿液)形式提供，所述混合物包含堿或堿±金屬亞氯酸鹽和 附加的固體堿或堿±金屬亞氯酸鹽的飽和溶液。此類漿液提供液體SCD，其具有比溶液形式 中的活性成分更高的活性成分含量。
[0072] 本發(fā)明在下文中將術(shù)語SCD描述為穩(wěn)定的堿金屬亞氯酸鹽，更具體地為亞氯酸鋼 (化Cl化）。通常，W溶液重量計(jì)，亞氯酸鋼W包含5重量％至22重量％的水溶液使用。在下文 中將SCD濃度描述為當(dāng)將亞氯酸化學(xué)當(dāng)量地轉(zhuǎn)化成二氧化氯時(shí)的有效二氧化氯的濃度，"有 效的Cl化"。在Ig亞氯酸鋼中的潛在的二氧化氯含量為0.597g。包含5重量％至22重量％的 亞氯酸鋼的亞氯酸鋼溶液因此含有2.98重量％至13.13重量％的有效二氧化氯。Cl〇2的生 成通過W下公式(2)示出：
[0073] 5NaCl〇2+4H+一 4Cl〇2(g)+2出0+C1-巧 Na+ (2)
[0074] 其中一摩爾的化Cl化提供0.8摩爾的Cl化（5:4比率）。（參見例如Ul Ilmann ' S Encyclopedia of Industrial Chemistry,Wiley Online Library , http :// onl inel ibrary wi ley com/doi/10 1002/14356007 a06_483 pub2/p壯，訪問于2010年9月 30 日）。
[0075] 提供由其它含亞氯酸根的化合物或由一種或多種包含二氧化氯的氧-氯絡(luò)合物或 由當(dāng)暴露于酸時(shí)能夠形成二氧化氯的一種或多種其它物質(zhì)而產(chǎn)生Cl化的化學(xué)計(jì)量的公式 對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。
[007引生長控制方法
[0077]本發(fā)明用于控制一種或多種污染性微生物的生長的方法，所述方法包括W下步 驟、基本上由W下步驟組成或由W下步驟組成:將組分(a)穩(wěn)定的二氧化氯(SCD)和(b)過氧 化合物(PC)的組合加入發(fā)酵工藝的一個(gè)或多個(gè)步驟中。
[007引可將組分SCD和PC單獨(dú)加入發(fā)酵工藝。當(dāng)單獨(dú)加入時(shí)，SCD和PC可同時(shí)（在相同時(shí) 間)或W任何順序按順序(在不同時(shí)間）加入一個(gè)或多個(gè)不同的加工步驟中。
[0079] 在將反應(yīng)物和組分引入發(fā)酵容器之前可將組分SCD和PC單獨(dú)或W組合加入反應(yīng)物 (諸如接種物、可發(fā)酵糖或工藝用水)中的任一種中。
[0080] 作為另外一種選擇，所述方法還可包括使組分SCD和PC在加入發(fā)酵工藝之前進(jìn)行 接觸。優(yōu)選地，使組分SCD和PC在加入之前進(jìn)行接觸并且因此作為單一組合物加入發(fā)酵工 乙。
[0081] 發(fā)酵工藝可為分批的或連續(xù)的。在分批發(fā)酵中，優(yōu)選在加入可發(fā)酵糖之前更優(yōu)選 在加入任何反應(yīng)物之前將組分SCD和PC作為單一組合物(在加入前進(jìn)行接觸)加入或單獨(dú)加 入發(fā)酵容器中。在連續(xù)發(fā)酵工藝中，可在酵母增殖步驟或接觸步驟中將組分SCD和PC作為單 一組合物加入發(fā)酵容器中。如果成系列地使用超過一個(gè)發(fā)酵容器，優(yōu)選地將所述組分加入 系列中的第一發(fā)酵容器或主發(fā)酵容器中。
[0082] 優(yōu)選地在生產(chǎn)顯著量的乙醇之前或生產(chǎn)與污染性細(xì)菌的生長相關(guān)聯(lián)的顯著量的 有機(jī)酸之前將SCD和PC加入所述工藝中。所謂"顯著量的乙醇"是指W發(fā)酵液體培養(yǎng)基的總 體積計(jì)，發(fā)酵液體培養(yǎng)基中乙醇的量不超過10重量％。所謂"顯著量的有機(jī)酸"是指W發(fā)酵 液體培養(yǎng)基的總體積計(jì)，發(fā)酵液體培養(yǎng)基中有機(jī)酸的量不超過0.3重量％。優(yōu)選地在發(fā)酵工 藝中，諸如在接種酵母增殖期間，已將接種酵母引入發(fā)酵容器之前或緊隨其后，早期加入 SCD和PC。
[0083] 在另一個(gè)實(shí)施例中，在將接種物引入發(fā)酵容器之前將SCD和PC加入發(fā)酵工藝中。在 該實(shí)施例中，在將運(yùn)些反應(yīng)物中的任一種引入發(fā)酵容器之前可將SCD和PC加入可發(fā)酵糖或 工藝用水或兩者中，并且在將接種物引入發(fā)酵容器之前將混合的SCD/PC/可發(fā)酵糖和/或 SCD/PC/工藝用水引入該發(fā)酵容器。例如，可將SCD和PC加入提供可發(fā)酵糖的一個(gè)或多個(gè)步 驟中，諸如濕磨或干磨方法的一個(gè)或多個(gè)步驟。
[0084] 當(dāng)發(fā)酵工藝包含基于甘薦或基于糖用甜菜或基于糖蜜的糖時(shí)，其通常具有成系列 的發(fā)酵容器，其具有第一、第二或甚至第=或更多的發(fā)酵容器作為系列容器，其中將發(fā)酵液 體培養(yǎng)基連續(xù)地轉(zhuǎn)移到各發(fā)酵容器中作為發(fā)酵循環(huán)一部分。在該實(shí)施例中，將SCD和PC優(yōu)選 加入第一發(fā)酵容器中。
[0085] 作為另外一種選擇，在使用甘薦或糖用甜菜或糖蜜作為可發(fā)酵糖的發(fā)酵工藝中， 在使可發(fā)酵糖與接種物接觸之前將SCD和PC加入可發(fā)酵糖中。在可發(fā)酵糖的儲(chǔ)存期間可加 入SCD和PC。本文將在儲(chǔ)存期間加入SCD和PC的此類步驟設(shè)想為在將可發(fā)酵糖引入發(fā)酵容器 之前提供可發(fā)酵糖的加工步驟。
[0086] 在加入反應(yīng)物之前還可將SCD和PC加入空發(fā)酵容器中。
[0087] 在另一個(gè)替代方案中，對(duì)于甘薦或糖蜜為可發(fā)酵糖并且在完成各發(fā)酵循環(huán)后對(duì)接 種物再循環(huán)利用的分批方法中，可在開始發(fā)酵工藝的隨后批次之前將SCD和PC加入酵母處 理階段(酵母增殖）。即，SCD和PC單獨(dú)、同時(shí)地或作為混合的組合物加入酵母再循環(huán)物流，其 通常稱為酵母膏。
[0088] 在一個(gè)實(shí)施例中，將SCD和PC加入工藝用水中。本文將向工藝用水中加入SCD和PC 的此類步驟設(shè)想為在將工藝用水引入發(fā)酵容器之前提供工藝用水的加工步驟。工藝用水包 括任何水，所述水由外部來源或從發(fā)酵工藝的其它部分再循環(huán)而引入發(fā)酵工藝。
[0089] 在基于糖蜜的發(fā)酵工藝中，工藝用水包括用于在發(fā)酵前稀釋引入的糖蜜的水、作 為酵母制備方法的一部分而加入的水或從此前的發(fā)酵步驟再循環(huán)利用的水(包括酵母再循 環(huán)物流）。
[0090] 在干磨發(fā)酵工藝中，工藝用水包括加入浸槽、漿液槽、酵母增殖或發(fā)酵容器中的 水。工藝用水還可為干磨分批發(fā)酵工藝中的再循環(huán)物流，其中所述再循環(huán)物流是在完成發(fā) 酵后產(chǎn)生的物流，并且常被稱為回流或加工冷凝物。干磨發(fā)酵工藝的運(yùn)些階段對(duì)于本領(lǐng)域 的技術(shù)人員是熟知的。參見例如R.J. Bothast和M.A. Schlicher ,Applied Microbiology and Biotechnology,如上文所引用。
[0091] 發(fā)酵工藝還可包括或作為另外一種選擇包括在接觸步驟后，將SCD和PC加入該接 觸步驟的產(chǎn)物(其產(chǎn)物包含乙醇）中，將乙醇從產(chǎn)物中分離。作為另外一種選擇，發(fā)酵工藝還 可包括在接觸步驟后，將乙醇從剩余產(chǎn)物中分離，其中將所述剩余產(chǎn)物進(jìn)料到例如發(fā)酵池 或酒糟水槽中，并且發(fā)酵工藝還可包括將SCD和PC加入發(fā)酵池或酒糟水槽。
[0092] 穩(wěn)定的二氧化氯(SCD)和過氧化合物(PC) W提供控制一種或多種污染性微生物生 長的有效量的量加入發(fā)酵工藝。通常，W發(fā)酵液體培養(yǎng)基的總體積計(jì)，SCDW提供0.0002重 量％至5重量％的穩(wěn)定的二氧化氯濃度的量加入。通常，W發(fā)酵液體培養(yǎng)基的總體積計(jì)，PC 還W提供0.0002重量％至5重量％的濃度的量加入發(fā)酵工藝中。優(yōu)選地向發(fā)酵工藝中加入 SCD和PCW提供W發(fā)酵液體培養(yǎng)基的總體積計(jì)0.0005重量％至1重量％，更優(yōu)選0.002重 量％至1重量％的SCD濃度和0.001重量％至1重量％，更優(yōu)選0.002重量％至1重量％的口〔濃 度。最優(yōu)選地加入SCD和PCW在發(fā)酵液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生W發(fā)酵液體培養(yǎng)基的總體積計(jì)0.005 重量％至〇. 5重量％的SCD濃度和0.005重量％至0.5重量％的?(：濃度。
[009引保存方法
[0094]作為本發(fā)明用于在發(fā)酵工藝中控制污染性微生物生長的一個(gè)實(shí)施例，可加入SCD 和PC W作為提供可發(fā)酵糖中的步驟。更具體地，如本文所定義，發(fā)酵工藝包括制備并儲(chǔ)存碳 水化合物原料的加工步驟，其中所述碳水化合物原料包括可發(fā)酵糖或其用于制備可發(fā)酵 糖。因此，提供可發(fā)酵糖的步驟可包括使碳水化合物原料與SCD和PC接觸。因此，本發(fā)明的方 法還用于在碳水化合物原料的儲(chǔ)存中防止降解。
[00M] W總原料重量計(jì)，原料中的碳水化合物含量為至少1重量％，并且優(yōu)選1重量％至 70重量％。穩(wěn)定的二氧化氯和過氧化合物W有效量加入。通常，W原料的總重量計(jì)，穩(wěn)定的 二氧化氯W IOppm至1000 ppm的穩(wěn)定的二氧化氯的量加入，并且W原料的總重量計(jì)，過氧化 合物通常W IOppm至1000 ppm的過氧化合物的量加入，其中本文的Wppm表示的所有量W重 量/重量計(jì)。優(yōu)選地，W原料的總重量計(jì)，穩(wěn)定的二氧化氯W SOppm至50化pm，更優(yōu)選10化pm 至50化pm，并且最優(yōu)選10化pm至20化pm的穩(wěn)定的二氧化氯的量加入。優(yōu)選地，W原料的總重 量計(jì)，過氧化合物W 50ppm至SOOppm，更優(yōu)選IOOppm至SOOppm，并且最優(yōu)選1 OOppm至200ppm 的過氧化合物的量加入。
[0096] 在該方法中，使SCD和PC與有效量的碳水化合物原料接觸W防止碳水化合物發(fā)生 非期望的微生物生長，并因此防止原料的劣化。原料劣化可通過存在的污染性微生物群體 或微生物代謝物濃度如有機(jī)酸進(jìn)行確定，所述微生物代謝物一般指示原料中非預(yù)期的或非 期望的微生物活性。因此在加入SCD和PC后基本上防止了儲(chǔ)存或運(yùn)輸原料中的微生物增殖。
[0097] 本發(fā)明還可用于在儲(chǔ)存和運(yùn)輸期間控制污染性微生物，從而保存碳水化合物原 料。
[0098] 令人驚訝地是，根據(jù)本發(fā)明處理的碳水化合物原料在至少一個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定。所 謂"穩(wěn)定"在本文是指加入SCD和PC保存碳水化合物原料，其中上文將"保存"定義為通過污 染性微生物防止碳水化合物的反應(yīng)或消耗。穩(wěn)定的碳水化合物原料不經(jīng)受大于IlogioCFU/ ml或llogioCFU/g的原料中微生物群體的增加。CFU，菌落形成單位的縮寫，它是原料中微生 物群體的量度。CFU用于確定每單位體積或每單位質(zhì)量的樣品中存活的微生物細(xì)胞的數(shù)量 或樣品中的微生物污染程度。改變的第二個(gè)量度是所保存原料的pH。適當(dāng)保存的原料的pH 不應(yīng)改變超過0.5個(gè)抑單位。然而，如上文所述，pH改變可能不足W在所有情況下監(jiān)視碳水 化合物原料的保存。
[0099] 所述碳水化合物原料如上文所定義。
[0100] 在本發(fā)明中，使用SCD和PC的組合作為防腐劑W用于碳水化合物原料，W阻止污染 性微生物活性W及碳水化合物原料的后續(xù)劣化W作為提供可發(fā)酵糖中的步驟。污染性微生 物包括如WO 2007/149450中所公開的細(xì)菌和如2009年5月18日提交的美國專利申請(qǐng)序列號(hào) 12/467,728中所公開的污染性酵母。所述組合抑制了某些細(xì)菌的生長，所述細(xì)菌引起碳水 化合物的非期望分解，例如單糖分解成有害的酸并且還選擇性地降低污染性酵母的活性。
[0101] 實(shí)例 [?！?shí)例1
[0103]在本實(shí)例中，穩(wěn)定的二氧化氯（S CD )和過氧化物（HP )用于棋盤式測(cè)定 (checkerboard assay)W確定其相互作用是否針對(duì)短乳桿菌(Xactobacillus brevis)(發(fā) 酵工藝中的常見污染物)具有協(xié)同性。使用棋盤式測(cè)定方法來分析W漸增的濃度將它們混 合的化合物之間的相互作用，W確定所述化合物是否協(xié)同地、疊加性或反協(xié)同地作用。（參 見,M.Najjar,D.Kashtanov,!.Chikindas,Letters in Applied Microbiology，第45卷， (2007) 13-18)。在32°C 下將短乳桿菌化.breviS)在MRS液體培養(yǎng)基（deMan Rogosa and Sha;rp broth,Difco Laboratories,Inc. ,Sparks,MD)中過夜培養(yǎng)。然后將培養(yǎng)物稀釋并且 重懸浮于調(diào)節(jié)至pH 4.8的新鮮MRS液體培養(yǎng)基中，然后加入（150iil)96孔平板的孔內(nèi) (Becton,Dickinson and Co.,Rranklin Lakes,NJ)。然后W下文"棋盤式"平板圖中示出的 濃度加入SCD(FennaSure"''發(fā)酵添加劑，E.I.du Pont de Nemours and Co.,Wilmington DE)和過氧化氨（30%，VWR International LLC,West化ester,PA)。將所述平板封蓋并且 在32°C下解育28小時(shí)。在解育后，移除平板并且使用酶標(biāo)儀在630nm下確定各孔的光密度。 根據(jù)光密度，對(duì)各孔計(jì)分W確定是否存在抑制(NI)、部分抑制(PI)或完全抑制(CI)。
[0…4] 表1:用于確定短乳桿菌對(duì)于用在pH4.8下的MRS液體培養(yǎng)基中的SCD和過氧化氨進(jìn) 行處理的反應(yīng)的棋盤式測(cè)定。
[0105]
[0106] 為確定在SCD和過氧化氨之間是否發(fā)生了任何協(xié)同活性，如上文使用W下公式確 定了抑制濃度比值(FIC):
[0107] FIC=[SCD]/MICscd+[HP]/MIChp。
[010引 其中
[0109] [ SCD]=提供部分抑制(PI)的SCD濃度
[0110] 陽門=提供部分抑制(PI)的HP濃度
[0111] MICscd =提供完全抑制的SCD濃度
[0112] MIChp =提供完全抑制的HP濃度
[0113] 對(duì)于上文的棋盤式測(cè)定，確定FIC為0.35，運(yùn)表明SCD和過氧化氨之間針對(duì)短乳桿 菌的相互作用的協(xié)同效應(yīng)。因此，實(shí)例1展示出過氧化氨和SCD的組合將能夠降低在發(fā)酵工 藝中使細(xì)菌失活所需的SCD劑量。
[0114] 實(shí)例2
[0115] 在本實(shí)例中，從商業(yè)乙醇工廠在液化步驟后立即獲得玉米膠。將所述膠冷卻至室 溫，然后如實(shí)例1中所述用短乳桿菌培養(yǎng)物對(duì)其接種。用SCD、HPW及兩者的組合對(duì)50ml份接 種玉米膠進(jìn)行如下處理：
[0116]
[0117] 在處理后，在振蕩培養(yǎng)箱中將所述樣品解育2小時(shí)。各樣品中存活的細(xì)菌通過各自 在MRS瓊脂平板(購自Difco Laboratories, Inc. ,Sparks,MD)上進(jìn)行的涂板系列稀釋來計(jì) 數(shù)并且在32 °C下將所述平板進(jìn)一步解育48小時(shí)。
[0118] 親2.田HP.SfDW巧HP巧sen的巧會(huì)講巧々h理的韋來臟由的到酸細(xì)菌的減少
[0119]
[0120] 各樣品中的存活的細(xì)菌數(shù)在表2中示出。用50ppm HP和5(K)ppm SCD的組合獲得了 存活的細(xì)菌數(shù)的最高減少。用I(K)PPm HP和1000 ppm SCD(其表示組合處理中各濃度的二倍） 進(jìn)行的單獨(dú)處理并不如組合處理有效。因此，實(shí)例2展示出HP和SCD的組合在減少發(fā)酵工藝 中污染性細(xì)菌數(shù)上比所述化合物中的任一個(gè)單獨(dú)更為有效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 控制發(fā)酵工藝中污染性微生物生長的方法，包括將組分(a)穩(wěn)定的二氧化氯和(b)過 氧化合物加入發(fā)酵工藝的一個(gè)或多個(gè)步驟中，其中所述發(fā)酵工藝包括（i)提供發(fā)酵容器； (ii)提供接種物、可發(fā)酵糖和工藝用水；（iii)將所述接種物、可發(fā)酵糖和工藝用水單獨(dú)或 以任何組合引入發(fā)酵容器以提供發(fā)酵液體培養(yǎng)基；以及(iv)在所述接種物將所述可發(fā)酵糖 轉(zhuǎn)化成乙醇的溫度下，在所述發(fā)酵容器中使所述接種物與所述可發(fā)酵糖接觸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括將營養(yǎng)物質(zhì)加入所述接種物、可發(fā)酵糖和工藝用 水的一種或多種中，或直接加入所述發(fā)酵容器中。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述接種物為酵母種菌，所述酵母種菌通過使酵母 起始培養(yǎng)物與營養(yǎng)物質(zhì)組合物在增殖槽中接觸而產(chǎn)生。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述穩(wěn)定的二氧化氯為含二氧化氯的氧-氯絡(luò) 合物，所述含二氧化氯的氧-氯絡(luò)合物選自二氧化氯與碳酸鹽的絡(luò)合物、二氧化氯與碳酸氫 鹽的絡(luò)合物以及它們的混合物。5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述過氧化合物選自氫過氧化物、有機(jī)過氧化 物、無機(jī)過氧化物或釋放過氧的化合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中以所述發(fā)酵液體培養(yǎng)基的總體積計(jì)，穩(wěn)定的二氧化 氯以提供0.0002%至5%的所述穩(wěn)定的二氧化氯濃度的量加入;并且以所述發(fā)酵液體培養(yǎng) 基的總體積計(jì)，所述過氧化合物以提供〇. 0002%至5%的濃度的量加入。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中提供所述可發(fā)酵糖的步驟包括制備并儲(chǔ)存碳水化 合物原料，其中將穩(wěn)定的二氧化氯和過氧化合物加入所述碳水化合物原料，并且其中所述 碳水化合物原料包含可發(fā)酵糖，并且進(jìn)一步地，其中以所述總原料重量計(jì)，所述原料的碳水 化合物含量為至少1重量％，并且以所述原料的總重量計(jì)，所述穩(wěn)定的二氧化氯以IOppm至 1000 ppm的穩(wěn)定的二氧化氯的量加入，并且以所述原料的總重量計(jì)，所述過氧化合物以 I Oppm至I OOOppm的過氧化合物的量加入。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中以所述原料的總重量計(jì)，穩(wěn)定的二氧化氯以50ppm 至500ppm的量加入，并且以所述原料的總重量計(jì)，所述過氧化合物以50ppm至500ppm的量加 入，并且其中以總原料重量計(jì)，所述原料的碳水化合物含量為1重量％至70重量％。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述發(fā)酵工藝還包括在步驟(iv)后，將穩(wěn)定的二氧 化氯和過氧化合物加入所述接觸步驟的產(chǎn)物中，所述接觸步驟的產(chǎn)物包含乙醇。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述發(fā)酵工藝還包括在步驟（iv)后，從所述接觸 步驟的產(chǎn)物中分離乙醇以提供剩余產(chǎn)物，所述接觸步驟的產(chǎn)物包含乙醇，其中將所述剩余 產(chǎn)物進(jìn)料到發(fā)酵池或酒糟水槽中，并且所述發(fā)酵工藝還包括將所述穩(wěn)定的二氧化氯和過氧 化合物加入所述發(fā)酵池或酒糟水槽。
【文檔編號(hào)】C12P7/06GK105925619SQ201610289172
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2011年12月20日
【發(fā)明人】E.B.索洛蒙, D.O.奧庫爾
【申請(qǐng)人】納幕爾杜邦公司