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      缺血性腦卒中的分子診斷標志物的制作方法

      文檔序號:10565506閱讀:458來源:國知局
      缺血性腦卒中的分子診斷標志物的制作方法
      【專利摘要】本發(fā)明公開了缺血性腦卒中的分子診斷標志物,具體地該診斷標志物為PPIE,PPIE在缺血性腦卒中患者中表達下調(diào),通過檢測PPIE在受試者體內(nèi)的表達水平,可以判斷受試者是否患有缺血性腦卒中或者患缺血性腦卒中的概率。本發(fā)明提供了一種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品,使用該產(chǎn)品可以實現(xiàn)缺血性腦卒中的早期診斷,從而降低因診斷不及時而導致的高死亡率。
      【專利說明】
      缺血性腦卒中的分子診斷標志物
      技術領域
      [0001 ]本發(fā)明屬于生物技術領域,設及缺血性腦卒中的分子診斷標志物,具體地該標志 物為PPIE。
      【背景技術】
      [0002] 腦血管病與屯、血管病及腫瘤一起是嚴重危害人類健康的=大疾病之一,其具有高 發(fā)病率、高致殘率與高死亡率的特點,同時也與屯、血管病及腫瘤一起是人類=大死亡原因 之一。腦血管病主要是由于腦組織血液循環(huán)障礙而導致局部神經(jīng)功能缺失的神經(jīng)系統(tǒng)疾 病,可分為急性腦血管病及慢性腦血管病。急性腦血管疾病又常被稱為腦卒中,在美國,每 年約80萬人患有腦卒中類疾病,且發(fā)病率隨著年齡的增加而增加,運給其不斷老年化的社 會帶來嚴重的問題。在中國,腦血管病發(fā)病率逐年上升,已占據(jù)人口致死和致殘原因的第一 位。近幾年流行病學調(diào)查結果顯示,我國每年新發(fā)腦卒中病例約有200萬。而隨著經(jīng)濟水平 的快速發(fā)展,我國人口老齡化問題的不斷加重,W及不健康的生活方式等眾多因素,使得缺 血性腦血管病發(fā)病率逐年增長。
      [0003] 腦卒中又可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中。缺血性腦卒中占全部腦卒中發(fā)病 率的80%左右,并且其發(fā)病率隨年齡的增長而增高。缺血性腦卒中的發(fā)生主要是由于腦栓 塞及局部血栓的形成,運可能是由動脈粥樣硬化引起的血管狹窄、血栓栓塞,或者是來源于 屯、臟的栓子隨血流至腦部引起腦栓塞;而各種原因造成的血管損傷、血管炎癥也是重要原 因之一。諸多原因引起腦部血液供應障礙,而造成受損腦組織的不可逆性損害,使得腦組織 缺血、缺氧導致最終壞死,給患者造成一系列的神經(jīng)功能缺損和障礙。目前按照國際上公認 的最常用分型標準的分類方法,缺血性腦卒中疾病TOAST分型系統(tǒng),可將缺血性腦卒中分為 5個亞型:大動脈粥樣硬化型、屯、源性栓塞型、小動脈閉塞型及不明原因型。
      [0004] 缺血性腦卒中是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用的復雜性疾病,隨著人類基因組計 劃的完成和分子遺傳學的發(fā)展,基因的研究受到廣泛重視,尋找疾病的基因標記物成為當 前研究的熱點。今年來,越來越多研究認為,基因在缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中起著重 要的調(diào)控作用,因此基因與缺血性腦卒中發(fā)病風險的關系也備受關注。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0005] 為了彌補現(xiàn)有技術的不足,本發(fā)明的目的之一,提供一種缺血性腦卒中的診斷標 志物;
      [0006] 本發(fā)明的目的之二,提供一種診斷產(chǎn)品,實現(xiàn)缺血性腦卒中的早期診斷。
      [0007] 為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用如下技術方案:
      [000引本發(fā)明提供了檢測PPIE基因的試劑在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的應用。
      [0009] 進一步,所述PPIE基因在缺血性腦卒中患者中表達下調(diào)。
      [0010] 進一步,所述診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:通過RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢 、原位雜交或微陣列忍片診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品。
      [0011] 進一步,所述用RT-PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PPIE基因 的引物;所述用實時定量PCR診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PPIE基因的 引物;所述用免疫檢測診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:與PPIE蛋白特異性結合的抗體;所述 用原位雜交診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:與PPIE基因的核酸序列雜交的探針;所述用微 陣列忍片診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:蛋白忍片和基因忍片;其中,蛋白忍片包括與PPIE 蛋白特異性結合的抗體,基因忍片包括與PPIE基因的核酸序列雜交的探針。
      [0012] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中,所述用實時定量PCR特異擴增PPIE基因的引物 序列如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
      [0013] 進一步,所述診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括忍片和/或試劑盒;其中所述忍片包括 基因忍片、蛋白質(zhì)忍片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒。
      [0014] 本發(fā)明提供了一種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品,所述的產(chǎn)品能夠通過檢測PPIE基因 的表達水平來診斷缺血性腦卒中。
      [0015] 進一步,上面所述的產(chǎn)品包括忍片、或試劑盒。其中,所述忍片包括基因忍片、蛋白 質(zhì)忍片;所述基因忍片包括固相載體W及固定在固相載體上的寡核巧酸探針,所述寡核巧 酸探針包括用于檢測PPIE基因轉錄水平的針對PPIE基因的寡核巧酸探針;所述蛋白質(zhì)忍片 包括固相載體W及固定在固相載體上的PPIE蛋白的特異性抗體;所述試劑盒包括基因檢測 試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒;所述基因檢測試劑盒包括用于檢測PPIE基因轉錄水平的試 劑;所述蛋白免疫檢測試劑盒包括PPIE蛋白的特異性抗體。其中,所述基因忍片可用于檢測 包括PPIE基因在內(nèi)的多個基因(例如,與缺血性腦卒中相關的多個基因)的表達水平。所述 蛋白質(zhì)忍片可用于檢測包括PPIE蛋白在內(nèi)的多個蛋白質(zhì)(例如與缺血性腦卒中相關的多個 蛋白質(zhì))的表達水平。通過將多個與缺血性腦卒中的標志物同時檢測,可大大提高缺血性腦 卒中診斷的準確率。
      [0016] 進一步,所述基因檢測試劑盒用于特異性擴增PPIE基因引物對。
      [0017] 進一步,所述用于擴增PPIE基因的引物對的序列如SEQ ID NO.3和沈Q ID NO.4所 /J、- O
      [0018] 在本發(fā)明中,"抗體"覆蓋單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性 抗體)、及抗體片段、組合抗體等,只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性即可。"單克隆抗體"指 從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體,即構成群體的各個抗體相同和/或結合相同表位,除 了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的可能變體外,此類變體一般W極小量存在。此類單 克隆抗體典型的包括包含結合祀物的多膚序列的抗體,其中祀物結合多膚序列是通過包括 從眾多多膚序列中選擇單一祀物結合多膚序列在內(nèi)的過程得到的。
      [0019] 單克隆抗體還包括"嵌合"抗體,其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種 或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源,而鏈的剩余部分與衍生自另 一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源,W及此類抗體的片 段,只要它們展現(xiàn)出期望的生物學活性即可。
      [0020] "抗體或抗體片段"指無論自天然生成抗體的任何物種衍生,還是通過重組DNA技 術創(chuàng)建;無論自血清、B細胞、雜交瘤、轉染瘤、酵母或細菌分離的抗體(例如IgG、IgM、IgA、 1神或1旨6)或片段(諸如化13少(曰13')2少¥、二硫化物連接的。¥、3。。¥、閉合構象多特異性抗 體、二硫化物連接的scFv、雙抗體)。
      [0021] 在本發(fā)明中,術語"探針"指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結合的 分子。除非另有指出,術語"探針"通常指能通過互補堿基配對與另一多核巧酸(往往稱為 "祀多核巧酸")結合的多核巧酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴謹性,探針能和與該探針缺乏完全 序列互補性的祀多核巧酸結合。探針可作直接或間接的標記,其范圍包括引物。雜交方式, 包括,但不限于:溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。
      [0022] 在本發(fā)明中,術語"微陣列"是雜交陣列原件有序排列在基質(zhì)上,所述雜交陣列原 件諸如聚核巧酸探針(例如寡核巧酸)或結合劑(例如抗體)。所述基質(zhì)可W是固體基質(zhì),例 如,玻璃或二氧化娃玻片、珠、纖維光學粘結劑或半固態(tài)基質(zhì),例如硝酸纖維素膜。核巧酸序 列可W是DNA、RNA或其中的任何排列。
      [0023] 各種探針陣列已經(jīng)描述在文獻中并且可W用于本發(fā)明上下文中檢測可能與本文 所述表型相關的標志物。例如,DNA探針陣列忍片或較大的DNA探針陣列晶片(否則,可W通 過打斷晶片而獲得各個體忍片)用于本發(fā)明的一個實施方案。DNA探針陣列晶片一般包含玻 璃晶片,其上放置了高密度DNA探針(短DNA片段)陣列。運些晶片各自可W保持例如約6000 萬個用于識別較長樣品DNA序列(例如,來自個體或群體,例如,包含所關注的標志物)的DNA 探針。用玻璃晶片上的DNA探針組識別樣品DNA通過DNA雜交進行。當DNA樣品與DNA探針陣列 雜交時,樣品結合于樣品DNA序列互補的那些探針。通過評價個體樣品DNA與那些探針更穩(wěn) 固地雜交,有可能確定已知的核酸序列是否存在于樣品中,由此確定核酸中發(fā)現(xiàn)的標志物 是否存在。還可W使用運一手段通過控制雜交條件W允許區(qū)別單一核巧酸,例如,用于SNP 鑒定和一種或多種SNP的樣品基因分型來進行ASH。陣列提供了一種同時(或串連)檢測多個 多態(tài)性標志物的便利性實施方案。
      [0024] 上述探針具有與祀點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。運里,所謂"互補", 只要是雜交即可,可W不是完全互補。運些多核巧酸通常相對于該特定的堿基序列具有 80 % W上、優(yōu)選90 % W上、更優(yōu)選95 % W上、特別優(yōu)選100 %的同源性。運些探針可W是DNA, 也可W是RNA,另外,可W為在其一部分或全部中核巧酸通過?魁、1魁、6魁、6魁^魁等人工 核酸置換得到的多核巧酸。
      [0025] 在本發(fā)明的上下文中,"PPIE基因"包括人PPIE基因W及人PPIE基因的任何功能等 同物的多核巧酸。PPffi基因包括與目前國際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫GeneBank中PPIE基因(NC_ 000001.11)DNA序列具有70% W上同源性,且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列;在本發(fā)明的 具體實施方案中,所述PPIE基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的DNA序列。
      [00%]本發(fā)明的PPIE基因可W是天然的或是人工合成的,或者使用可W表達PPIE的DNA 片段的載體轉染細胞獲得。所述載體所述載體包括病毒載體、真核表達載體。
      [0027]病毒載體可W是任何適當?shù)妮d體,包括但不限于逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關病毒載體、瘤疹病毒(例如單純瘤疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。 真核表達載體可W是任何適當?shù)谋磉_載體,包括但不限于pCMV-Myc表達載體、PCDNA3.0表 達載體、PCDNA3.1表達載體、祀GFP表達載體、pEF Bos表達載體、pTet表達載體、pTRE表達載 體、或者在公知表達載體的基礎上經(jīng)改造的載體,比如地in438、pCAMBIA1301等。
      [00%]在本發(fā)明的上下文中,PPffi基因表達產(chǎn)物包括人PPIE蛋白W及人PPIE蛋白的部分 膚。所述PPIE蛋白的部分膚含有與缺血性腦卒中相關的功能域。
      [0029]叩Pffi蛋白"包括PPIE蛋白W及PPIE蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 PPIE蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段,或其活性衍生物,等位變異體、天然突變體、誘 導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人PPIE的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明 的【具體實施方式】中,所述PPIE蛋白是由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋 白質(zhì)。
      [0030] 通常,已知的是,一個蛋白質(zhì)中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質(zhì)的功能。 本領域技術人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾,其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領域公知的。
      [0031] 在本發(fā)明的上下文中,"診斷缺血性腦卒中"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有缺血 性腦卒中、也包括判斷受試者是否存在患有缺血性腦卒中的風險。
      [0032] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:
      [0033] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 PPIE基因表達與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展相關,對于掲示缺血 性腦卒中的發(fā)病機理具有重要的意義
      [0034] 本發(fā)明提供了診斷產(chǎn)品,通過檢測血液中PPIE的表達水平,從而判斷受試者是否 患有缺血性腦卒中、或者判斷受試者是否存在患有缺血性腦卒中的風險,實現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早治 療,降低缺血性腦卒中的致殘率或死亡率。
      【附圖說明】
      [0035] 圖1顯示利用QPCR檢測PPIE基因在缺血性腦卒中患者中的表達情況.
      [0036] 具體的實施方式
      [0037] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。W下實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條 件,例如Sambrook等人,分子克?。簩嶒炇沂謨?New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
      [0038] 實施例1篩選與缺血性腦卒中相關的基因標志物
      [0039] 1、樣品收集
      [0040] 各收集10例正常人血液和缺血性腦卒中患者血液樣本,上述所有標本的取得均通 過倫理委員會的同意。
      [0041] 2、RNA樣品的制備及質(zhì)量分析
      [0042] 2.1 RNA樣品的制備
      [0043] 使用Promega公司的RNA提取試劑盒提取總RNA。具體步驟如下:
      [0044] 1)取Iml收集在肝素或邸TA處理過的試管中的全血,放進無菌離屯、管中;
      [0045] 2)收集血細胞:300化pm(400g)離屯、5min,小屯、地從樣品頂部吸走上清;
      [0046] 3)加Iml血細胞裂解液,小屯、吸放4-5次,重懸沉淀物;
      [0047] 4)3000巧 m 離屯、5min;
      [0048] 5)重復步驟3)和4)兩次(共=次);
      [0049] 6)避開細胞沉淀物,小屯、吸走幾乎所有上清,只保留10化1上清液;確認一下BME已 經(jīng)加到RNA裂解液中,然后加17化1 RNA裂解液到細胞中,吸放重懸并裂解細胞;
      [(K)加]7)加35化1 RNA稀釋液,顛倒混合3-4次;
      [0化1] 8)置于70。(:水浴中3111111;
      [0化2] 9)室溫下 13000g 離屯、IOmin;
      [0053] 10)將清亮裂解物轉移到一支無菌離屯、管中;
      [0054] 11)向澄清裂解液中加入20化1 95 %乙醇,用移液槍吸放3-4次W混合;將此混合 物轉移到離屯、柱裝配體中,13000g離屯、Imin;
      [0055] 12)從離屯、柱裝配體上拿下離屯、柱,棄去收集管中的液體,將離屯、柱裝回到收集管 上,確認一下RNA Wash Solution已用乙醇稀釋,加600]il RNA洗涂液于離屯、柱裝配體, 13000g 離屯、Imin;
      [0056] 13)棄去收集管中的液體,將離屯、柱裝回到收集管上,將50iil新鮮制備的D化Se解 育混合物直接加到離屯、柱內(nèi)的膜上;
      [0化7] 14)室溫下解育15min,向離屯、柱中加入20化1 DNA酶終止緩沖液(確認已加入乙 醇),13000g離屯、Imin;
      [0化引 15)加入60化1 RNA洗涂液(已加入乙醇),13000g,離屯、Imin;
      [0化9] 16)清空收集管,向離屯、柱內(nèi)加入25化1 RNA洗涂液(已加入乙醇),高速離屯、2min;
      [0060] 17)將離屯、柱從收集管上轉移到洗脫管上,向膜上加10化1無核酸酶水,將離屯、柱 裝配體放進離屯、機并使洗脫管的蓋子朝外,13000g離屯、Imin,丟棄離屯、柱,蓋好盛有RNA的 洗脫管,存于-70°C。
      [0061 ] 2.2 RNA樣品的質(zhì)量分析(Nano化OP1000分光光度計)
      [0062] NanoDroplOOO分光光度計檢測RNA樣品,RNA-seq測序的樣品要求:0D260/0D280為 1?8-2?2d
      [0063] 2.3 RNA樣品的質(zhì)量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
      [0064] 將上述提取的R N A進行瓊脂糖凝膠電泳,A g i I e n t T e C h n O I O g i e S 2100Bioanalyzer檢測RNA樣品質(zhì)量,觀察28S rRNA和18S rRNA主帶明顯、無降解、RNA完整 性指數(shù)合格、濃度達到要求的符合RNA-seq測序CDNA文庫構建的要求,可W用于文庫構建及 測序。
      [0(?日]3、高通量轉錄組測序
      [0066] 3.1 RNA-seq 讀段定位
      [0067] 首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段,然后利用Top化t Vl. 3.1將清潔片段與 UCSC H. sapiens參考基因組化gl9)進行匹配,H. sapiens UCSC hgl9版的預先構建的索引 從Top化t主頁下載,并作為參考基因組,利用Top化t與基因組匹配時,允許每個讀段(默認 到20)有多個匹配位點,最多2次錯配。Top化t根據(jù)外顯子區(qū)域和GT-AG剪切信號建立可能的 剪切位點庫,根據(jù)運些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用 Top化t方法的系統(tǒng)默認參數(shù)。
      [006引3.2轉錄豐度評估
      [0069]匹配上的讀段文件通過Cufflinks vl.0.3處理,Qifflinks vl.0.3將RNA-seq片 段數(shù)目進行標準化計算轉錄本的相對豐度。FPKM值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定 基因化b長的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過貝葉斯推理方法計算FPKM估計值的置信區(qū)間。 Cufflinks使用的參考的GTF注釋文件從Ensembl數(shù)據(jù)庫下載(Homo_ sapiens.GRQi37.63.gtf)。
      [0070] 3.3差異表達基因的檢測
      [0071 ] 將下載的Ensembl GTF文件和通過TopHat匹配的原始文件傳輸?shù)紺uffdiff, Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的轉錄本的表達豐度,檢測差異表 達。在化ffi壯巧俞出中只有q值<0.01,測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。
      [007^ 4、結果
      [0073] RNA-seq結果顯示,PPIE基因在缺血性腦卒中患者血液中的表達量顯著低于正常 人的表達量。
      [0074] 實施例2 QPCR測序驗證PPIE基因的差異表達
      [0075] 1、根據(jù)高通量測序的檢測結果選擇PPIE基因進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1 中的樣本收集方式選擇缺血性腦卒中患者血液和正常人血液各80例。
      [0076] 2、1?^4提取步驟同實施例1。
      [0077] 3、逆轉錄:使用TAKARA公司的反轉錄試劑盒進行操作。具體步驟如下:
      [0078] (1)取總RNA 2iig進行逆轉錄,加入Oligo(dT),充分混勻;70°C水浴;5min后立 即冰浴2-3min;
      [0079] (2)構建反應體系,其中包括5X逆轉錄緩沖液扣l,dNTP(2.5mM)扣l,RNasin 40UAU ,M-MLV 200UAU,補無核酶水至;
      [0080] (3) 42 °C 水浴 60min 后,95 °C 水浴 5min W 滅活 M-MLV;
      [0081 ] (4)-20°C 儲存?zhèn)溆谩?br>[0082] 4、QPCR 擴增
      [0083] (1)引物設計
      [0084] 根據(jù)Genebank中PPIE基因和GAPDH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物,由上海生 工生物工程技術服務有限公司合成。具體引物序列如下:
      [00化]PPIE基因:
      [0086] 正向引物為5'-TCACAGATATTCAGATTC-3'(沈Q ID N0.3);
      [0087] 反向引物為5'-CCTTCCTTAATTCTCATT-3'(沈Q ID N0.4)。
      [0088] GAPDH 基因:
      [0089] 正向引物為5'-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3'(SEQ ID N0.5);
      [0090] 反向引物為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'(沈Q ID N0.6)。
      [0091] (2)按照表1配制PCR反應體系:
      [0092] 其中,SYBR Green聚合酶鏈式反應體系購自Invitrogen公司。
      [0093] 表1 PCR反應體系
      [0094]
      [0095]
      [0096] (3)PCR反應條件:95°C IOmin,(95°C 15s,60°C60s) X 45個循環(huán)。WSY服 Green作為 巧光標記物,在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進行PCR反應,通過融解曲線分析和電泳確 定目的條帶,A A CT法進行相對定量。
      [0097] 5、統(tǒng)計學方法
      [0098] 實驗采用3次重復實驗,結果數(shù)據(jù)都是W平均值±標準差的方式來表示,使用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的,兩者之間的差異采用t檢驗,認為當P<0.05時具有統(tǒng) 計學意義。
      [0099] 6、結果
      [0100] 結果如圖1所示,與正常人血液相比,PPIE基因在缺血性腦卒中患者血液中的表達 下調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義(P<〇. 05),同RNA-S巧結果一致。
      [0101] 上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應當指出,對于本 領域的普通技術人員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可W對本發(fā)明進行若干改進 和修飾,運些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。
      【主權項】
      1. 檢測PPIE基因的試劑在制備診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于,所述PPIE基因在缺血性腦卒中患者中表達 下調(diào)。3. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于,所述診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括:通過 RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或微陣列芯片診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品。4. 根據(jù)權利要求3所述的應用,其特征在于,所述用實時定量PCR診斷缺血性腦卒中的 產(chǎn)品至少包括一對特異擴增PPIE基因的引物。5. 根據(jù)權利要求4所述的應用,其特征在于,所述特異擴增PPIE基因的引物序列如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。6. 根據(jù)權利要求3所述的應用,其特征在于,所述診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品包括芯片 和/或試劑盒,其中所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒 和蛋白免疫檢測試劑盒。7. -種診斷缺血性腦卒中的產(chǎn)品,其特征在于,所述的產(chǎn)品能夠通過檢測PPIE基因來 診斷缺血性腦卒中。8. 根據(jù)權利要求7所述的產(chǎn)品,其特征在于,所述產(chǎn)品包括芯片、或試劑盒;其中,所述 芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒。9. 根據(jù)權利要求8所述的產(chǎn)品,其特征在于,所述基因檢測試劑盒用于特異性擴增PPIE 基因引物對。10. 根據(jù)權利要求9所述的產(chǎn)品,其特征在于,所述用于擴增PPIE基因的引物對的序列 如SEQ ID NO .3和SEQ ID NO .4所示。
      【文檔編號】G01N33/68GK105925713SQ201610509640
      【公開日】2016年9月7日
      【申請日】2016年7月1日
      【發(fā)明人】楊承剛, 邊洋, 宋宏濤
      【申請人】北京泱深生物信息技術有限公司
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