一種噬菌體的保存方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種噬菌體的保存方法以及該噬菌體的保存方法，將噬菌體液和噬菌體保存保護劑混合均勻得噬菌體原液，再將噬菌體原液分裝于安瓿中密封，于室溫或者2?7℃進行凍存。本發(fā)明所述的噬菌體的保存方法，方法合理，應(yīng)用方便，噬菌體可以在室溫保存或者冷藏，對保存環(huán)境要求低，適應(yīng)性好，并且可以長期保存。
【專利說明】
一種噬菌體的保存方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和微生物制品領(lǐng)域，具體地，涉及一種噬菌體的保存方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 噬菌體是一類能感染細菌、放線菌、螺旋體等微生物的病毒的總稱，對一些細菌具 有高度的專一性，當(dāng)噬菌體侵染這些細菌時，可在細菌中繁殖并殺死細菌，而它對動植物沒 有毒性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，噬菌體已經(jīng)廣泛用于疾病診斷、水處理等多個領(lǐng)域。 由于噬菌體可以將基因插入宿主DNA內(nèi)的特性，使得它還成為了重要的分子和遺傳學(xué)研究 工具。利用噬菌體，可以設(shè)計很多精巧的實驗。
[0003] 然而在上述過程中，都需要對噬菌體進行保存，現(xiàn)有技術(shù)的保存方案中噬菌體的 保存效果差，噬菌體的保存時間短，存活率低，噬菌體容易被污染，并且必須在低溫條件下 進行保存，嚴重制約了對噬菌體應(yīng)用的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：為了克服以上不足，本發(fā)明提供了一種噬菌體的保存方法。
[0005] 技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種噬菌體的保存方法，包括以下步驟：
[0006] 1)噬菌體溶液于2-7°C靜置4-8h，出現(xiàn)絮狀沉淀，經(jīng)過8000-12000r/min離心20-40min；
[0007] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液；
[0008] 3)噬菌體液體積1-2.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻得噬菌體原液，所述噬菌 體保存保護劑所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉5-12份、蛋白胨3-5份、蔗 糖0.5-1.2份、海藻糖0.8-1.5份、香菇多糖1 -1.6份、硫酸鎂0.2-0.5份、氯化鈣0.6-1.2份、 硫酸鈉0.6-0.8份、明膠0.05-0.2份、甘露醇0.8-1.2份、聚乙烯吡咯烷酮0.1 -0.3份、淀粉 0.5-0.8份、滑石粉0.3-0.5份、甲殼素0.08-0.2份、磷酸二氫鉀0.03-0.3份、磷酸氫二鈉 0 · 05-0 · 2份、甘油1-3份、吐溫-80 0 · 02-0 · 1份和水100份；
[0009] 4)將上述噬菌體原液分裝于安瓿中密封，于室溫或者2-7°C進行凍存。
[0010] 本發(fā)明所述的噬菌體的保存方法，方法合理，應(yīng)用方便，噬菌體原液中加入保存保 護劑，可以在室溫保存或者冷藏，對保存環(huán)境要求低，適應(yīng)性好，可以長期保存。其中噬菌體 保存保護劑的組分合理，其中脫脂奶粉、蛋白胨、明膠、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉等形成整個 保存保護劑的骨架，防止低分子物質(zhì)的碳化和氧化，同時保護活性物質(zhì)不受溫度影響，使保 護劑形成多孔性、疏松的海綿狀物且具有一定的含水量，在凍存過程中保持原有的構(gòu)架，從 而增加溶解度。此外，多種糖類和鹽噬菌體保持存活狀態(tài)以及對水分起緩解作用，并且保持 電解質(zhì)濃度。噬菌體保存保護劑可以使噬菌體免受溶液損傷和冰晶損傷等物理因素的損 傷，并且維持噬菌體極高的存活率和活性，使噬菌體的活動處于半靜止或靜止?fàn)顟B(tài)。此外， 多種糖類和鹽使噬菌體保持存活狀態(tài)以及對水分起緩解作用，并且保持電解質(zhì)濃度。噬菌 體保存保護劑可以使噬菌體低溫保存下免受溶液損傷和冰晶損傷等物理因素的損傷，并且 維持噬菌體極高的存活率和活性，使噬菌體的活動處于半靜止或靜止?fàn)顟B(tài)。此外，保護劑同 溶液中的水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶過程使溶液的粘性增加從而減少冰晶 的形成，同時冷凍保護劑可以通過在噬菌體內(nèi)外維持一定的摩爾濃度，降低內(nèi)外未結(jié)冰溶 液中電解質(zhì)的濃度，使細胞免受溶質(zhì)的損傷。此外，保護劑還可以在室溫條件下用于多種噬 菌體的保存，適應(yīng)性好。
[0011] 進一步的，上述的噬菌體的保存方法，所述噬菌體保存保護劑以重量組分計，還包 括0.3-0.8份的氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:聚谷氨酸1-4份、天門冬 氨酸3-5份、苯丙氨酸2-8份、絲氨酸2-5份、半胱氨酸0.5-2份、蛋氨酸3-5份、賴氨酸2-4份、 亮氨酸〇. 3-0.8份和異亮氨酸0.2-0.6份。通過增加營養(yǎng)液，使噬菌體保持存活狀態(tài)以及對 水分起緩解作用。
[0012] 進一步的，上述的噬菌體的保存方法，所述安瓿放入裝有無水氯化鈣或無水甲醇 或硅膠的密封容器中于室溫或2-7°C保存。在干燥的條件下保存效果更佳，保存時間更久。
[0013] 進一步的，上述的噬菌體的保存方法，所述步驟在4-6 %的濕度條件下完成。4-6 % 的濕度條件下溶菌活性最佳，保存效果最好。
[0014] 進一步的，上述的噬菌體的保存方法，所述噬菌體緩沖液以重量組分計，包括以下 組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8-15份、氯化鈉0.05-0.2份、氯化鉀1-5份、硫酸鎂5-20份、 磷酸氫二鉀1-3份、磷酸二氫鈉8-12份、明膠0.05-0.1份和水100份，并且調(diào)節(jié)pH到7-7.5。噬 菌體緩沖液組分合理，使用方便，可以用于噬菌體的溶解和重懸，并且不影響噬菌體的活 性。
[0015] 進一步的，上述的噬菌體的保存方法，所述淀粉為馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、玉米淀 粉、綠豆淀粉或羥乙基淀粉的一種。淀粉的原料來源廣，選擇性好，應(yīng)用成本低。
[0016] 進一步的，上述的噬菌體的保存方法，所述蛋白胨為植物蛋白胨。植物蛋白胨中植 物細胞的細胞壁中的纖維素含量多，可以形成較好的骨架結(jié)構(gòu)，并且植物來源的原料相比 動物來源的原料便宜，應(yīng)用成本低。
[0017]進一步的，上述的噬菌體的保存方法，所述甘油為20 % -40 %的甘油。20 % -40 %的 甘油流動性好，易于應(yīng)用。
[0018] 進一步的，上述的噬菌體的保存方法，所述的水為去離子水或純化水。去離子水或 純化水可以保證噬菌體保存過程中質(zhì)量穩(wěn)定、可控。
[0019] 進一步的，上述的噬菌體的保存方法的制備方法，使用稀鹽酸和/或氫氧化鈉調(diào)節(jié) 溶液pH。原料來源廣，調(diào)節(jié)十分方便，并且應(yīng)用成本低。
[0020] 有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明所述的噬菌體的保存方 法，方法合理，應(yīng)用方便，噬菌體可以在室溫保存或者冷藏，對保存環(huán)境要求低，適應(yīng)性好， 并且可以長期保存。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為本發(fā)明所述使用實施例1-5保存方法保存的噬菌體存活率圖。
【具體實施方式】
[0022]下面將通過幾個具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，這些實施例只是為了說明問題， 并不是一種限制。
[0023] 實施例1
[0024] -種大腸桿菌噬菌體的保存方法，在4%的濕度條件下完成，包括以下步驟：
[0025] 1)大腸桿菌噬菌體溶液于2°C靜置4h，出現(xiàn)絮狀沉淀，經(jīng)過8000r/min離心20min;
[0026] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8份、氯化鈉0.05份、氯化鉀1份、硫 酸鎂5份、磷酸氫二鉀1份、磷酸二氫鈉8份、明膠0.05份和去離子水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到7;
[0027] 3)噬菌體液等體積的噬菌體保存保護劑混合均勻得噬菌體原液，所述噬菌體保存 保護劑所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉5份、植物蛋白胨3份、蔗糖0.5 份、海藻糖0.8份、香菇多糖1份、硫酸鎂0.2份、氯化鈣0.6份、硫酸鈉0.6份、明膠0.05份、甘 露醇0.8份、聚乙烯吡咯烷酮0.1份、馬鈴薯淀粉0.5份、滑石粉0.3份、甲殼素0.08份、磷酸二 氫鉀0.03份、磷酸氫二鈉0.05份、20 %的甘油1份、吐溫-80 0.02份和去離子水100份；
[0028] 此外，還包括0.3份的氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:聚谷氨酸 1份、天門冬氨酸3份、苯丙氨酸2份、絲氨酸2份、半胱氨酸0.5份、蛋氨酸3份、賴氨酸2份、亮 氨酸0.3份和異亮氨酸0.2份；
[0029] 4)將上述噬菌體原液分裝于安瓿中密封，所述安瓿放入裝有無水氯化鈣的密封容 器中于15°C保存。
[0030] 實施例2
[0031] -種分歧桿菌噬菌體的保存方法，在6%的濕度條件下完成，包括以下步驟：
[0032] 1)分歧桿菌噬菌體溶液于7°C靜置8h，出現(xiàn)絮狀沉淀，經(jīng)過12000r/min離心40min;
[0033] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽15份、氯化鈉0.2份、氯化鉀5份、硫 酸鎂20份、磷酸氫二鉀3份、磷酸二氫鈉12份、明膠0.1份和純化水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到7.5。
[0034] 3)噬菌體液體積2.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻得噬菌體原液，所述噬菌體 保存保護劑所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉12份、植物蛋白胨5份、蔗糖 1.2份、海藻糖1.5份、香菇多糖1.6份、硫酸鎂0.5份、氯化鈣1.2份、硫酸鈉0.8份、明膠0.2 份、甘露醇1.2份、聚乙烯吡咯烷酮0.3份、木薯淀粉0.8份、滑石粉0.5份、甲殼素0.2份、磷酸 二氫鉀0.3份、磷酸氫二鈉0.2份、40 %的甘油3份、吐溫-80 0.1份和純化水100份；
[0035] 此外，還包括0.8份的氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:聚谷氨酸 4份、天門冬氨酸5份、苯丙氨酸8份、絲氨酸5份、半胱氨酸2份、蛋氨酸5份、賴氨酸4份、亮氨 酸0.8份和異亮氨酸0.6份；
[0036] 4)將上述噬菌體原液分裝于安瓿中密封，所述安瓿放入裝有無水甲醇的密封容器 中于2°C保存。
[0037] 實施例3
[0038] -種溶藻弧菌噬菌體的保存方法，在5%的濕度條件下完成，包括以下步驟：
[0039] 1)溶藻弧菌噬菌體溶液于5°C靜置6h，出現(xiàn)絮狀沉淀，經(jīng)過10000r/min離心30min;
[0040] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽12份、氯化鈉0.1份、氯化鉀3份、硫 酸鎂10份、磷酸氫二鉀2份、磷酸二氫鈉10份、明膠0.08份和去離子水100份，并且使用稀鹽 酸和/或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到7.2;
[0041 ] 3)噬菌體液體積2.2倍的噬菌體保存保護劑混合均勻得噬菌體原液，所述噬菌體 保存保護劑所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉8份、植物蛋白胨4份、蔗糖 0.8份、海藻糖0.9份、香菇多糖1.2份、硫酸鎂0.3份、氯化鈣0.8份、硫酸鈉0.7份、明膠0.1 份、甘露醇1份、聚乙烯吡咯烷酮〇. 2份、玉米淀粉0.6份、滑石粉0.4份、甲殼素0.09份、磷酸 二氫鉀0.1份、磷酸氫二鈉0.15份、30%的甘油2份、吐溫-80 0.08份和去離子水100份；
[0042] 此外，還包括0.5份的氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:聚谷氨酸 3份、天門冬氨酸4份、苯丙氨酸6份、絲氨酸4份、半胱氨酸0.8份、蛋氨酸4份、賴氨酸3份、亮 氨酸0.5份和異亮氨酸0.5份；
[0043] 4)將上述噬菌體原液分裝于安瓿中密封，所述安瓿放入裝有硅膠的密封容器中于 7°C保存。
[0044] 實施例4
[0045] -種乳桿菌噬菌體的保存方法，在4%的濕度條件下完成，包括以下步驟：
[0046] 1)乳桿菌噬菌體溶液于5°C靜置5h，出現(xiàn)絮狀沉淀，經(jīng)過12000r/min離心20min;
[0047] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8份、氯化鈉0.2份、氯化鉀3份、硫 酸鎂15份、磷酸氫二鉀3份、磷酸二氫鈉8份、明膠0.05份和純化水100份，并且使用稀鹽酸 和/或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到7;
[0048] 3)噬菌體液體積1.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻得噬菌體原液，所述噬菌體 保存保護劑所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉5份、植物蛋白胨5份、蔗糖1 份、海藻糖0.8份、香菇多糖1.6份、硫酸鎂0.3份、氯化鈣0.8份、硫酸鈉0.8份、明膠0.08份、 甘露醇0.8份、聚乙烯吡咯烷酮0.3份、綠豆淀粉0.7份、滑石粉0.5份、甲殼素0.15份、磷酸二 氫鉀0.2份、磷酸氫二鈉 0.2份、25 %的甘油1份、吐溫-80 0.06份和純化水100份；
[0049] 此外，還包括0.7份的氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:聚谷氨酸 4份、天門冬氨酸3份、苯丙氨酸4份、絲氨酸3份、半胱氨酸0.9份、蛋氨酸3份、賴氨酸2份、亮 氨酸〇. 8份和異亮氨酸0.6份；
[0050] 4)將上述噬菌體原液分裝于安瓿中密封，所述安瓿放入裝有無水甲醇的密封容器 中于4°C保存。
[0051 ] 實施例5
[0052] 一種噬菌體的保存方法，在6 %的濕度條件下完成，包括以下步驟：
[0053] 1)噬菌體溶液于7°C靜置5h，出現(xiàn)絮狀沉淀，經(jīng)過8000r/min離心20min;
[0054] 2)向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液;所述噬菌體緩沖液 以重量組分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽15份、氯化鈉0.2份、氯化鉀1份、硫 酸鎂20份、磷酸氫二鉀2份、磷酸二氫鈉10份、明膠0.06份和去離子水100份，并且使用稀鹽 酸和/或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到7.5;
[0055] 3)噬菌體液體積1.2倍的噬菌體保存保護劑混合均勻得噬菌體原液，所述噬菌體 保存保護劑所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉12份、植物蛋白胨5份、蔗糖 0.5份、海藻糖0.8份、香菇多糖1.2份、硫酸鎂0.4份、氯化鈣0.6份、硫酸鈉0.6份、明膠0.2 份、甘露醇1.2份、聚乙烯吡咯烷酮0.2份、羥乙基淀粉0.7份、滑石粉0.5份、甲殼素0.2份、磷 酸二氫鉀〇. 03份、磷酸氫二鈉0.05份、40%的甘油3份、吐溫-80 0.1份和去離子水100份；
[0056] 此外，還包括0.4份的氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:聚谷氨酸 3份、天門冬氨酸3份、苯丙氨酸2份、絲氨酸5份、半胱氨酸2份、蛋氨酸4份、賴氨酸3份、亮氨 酸0.3份和異亮氨酸0.2份；
[0057] 4)將上述噬菌體原液分裝于安瓿中密封，所述安瓿放入裝有無水氯化鈣的密封容 器中于25°C保存。
[0058] 對使用實施例1-5的噬菌體保護劑的保存1、3、6、9個月后的噬菌體污染情況以及 存活率分別進行考察，如表1所示，噬菌體均未污染，并且如圖1所示，噬菌體在9個月內(nèi)保持 60%以上的存活率。
[0059]表1噬菌體污染情況
[0062]以上所述僅是發(fā)明的幾個實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應(yīng)視為本發(fā)明的保護 范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種噬菌體的保存方法，其特征在于:包括以下步驟： 1)噬菌體溶液于2-7°C靜置4-8h，出現(xiàn)絮狀沉淀，經(jīng)過8000-12000r/min離心20-40min; 2 )向上述沉淀中加入噬菌體緩沖液，將沉淀溶解，得噬菌體液； 3) 噬菌體液體積1-2.5倍的噬菌體保存保護劑混合均勻得噬菌體原液，所述噬菌體保 存保護劑所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:脫脂奶粉5-12份、蛋白胨3-5份、蔗糖 0.5-1.2份、海藻糖0.8-1.5份、香菇多糖1-1.6份、硫酸鎂0.2-0.5份、氯化鈣0.6-1.2 份、硫酸鈉0.6-0.8份、明膠0.05-0.2份、甘露醇0.8-1.2份、聚乙烯吡咯烷酮0.1-0.3 份、淀粉0.5-0.8份、滑石粉0.3-0.5份、甲殼素0.08-0.2份、磷酸二氫鉀0.03-0.3份、磷 酸氫二鈉0.05-0.2份、甘油1-3份、吐溫-80 0.02-0.1份和水100份； 4) 將上述噬菌體原液分裝于安瓿中密封，于室溫或者2-7°C進行凍存。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的噬菌體的保存方法，其特征在于:所述噬菌體保存保護劑以重 量組分計，還包括0.3-0.8份的氨基酸，所述氨基酸以重量組分計，包括以下組分:聚谷氨酸 1-4份、天門冬氨酸3-5份、苯丙氨酸2-8份、絲氨酸2-5份、半胱氨酸0.5-2份、蛋氨酸3-5份、賴氨酸2-4份、亮氨酸0.3-0.8份和異亮氨酸0.2-0.6份。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的噬菌體的保存方法，其特征在于:所述安瓿放入裝有無水氯化 鈣或無水甲醇或硅膠的密封容器中于室溫或2_7°C保存。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的噬菌體的保存方法，其特征在于:所述步驟在4-6%的濕度條件 下完成。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的噬菌體的保存方法，其特征在于:所述噬菌體緩沖液以重量組 分計，包括以下組分:三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽8-15份、氯化鈉0.05-0.2份、氯化鉀1-5 份、硫酸鎂5-20份、磷酸氫二鉀1-3份、磷酸二氫鈉8-12份、明膠0.05-0.1份和水100 份，并且調(diào)節(jié)pH到7-7.5。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的噬菌體的保存方法，其特征在于:所述淀粉為馬鈴薯淀粉、木 薯淀粉、玉米淀粉、綠豆淀粉或羥乙基淀粉的一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的噬菌體的保存方法，其特征在于:所述蛋白胨為植物蛋白胨。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的噬菌體的保存方法，其特征在于:所述甘油為20%-40%的甘油。9. 根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的噬菌體的保存方法，其特征在于:所述的水為去離子水或 純化水。10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的噬菌體的保存方法的制備方法，其特征在于:使用稀鹽酸和/ 或氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH。
【文檔編號】C12N7/00GK105950570SQ201610422049
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】許維素, 宋增福, 陳彪
【申請人】蘇州埃瑞特生物技術(shù)有限公司