專利名稱：水稻條紋葉枯病抗性基因Stvb-i的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻條紋葉枯病抗性基因^v6-z'的分子標(biāo)記方法，屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域，專用于水稻條紋葉枯病抗性品種的選育和純度鑒定。二、 背景技術(shù)水稻條紋葉枯病是由條紋葉枯病毒(Rice Stripe Virus, RSV)引起的病毒病，其傳毒介 體主要是灰飛虱(丄aocfe/;7/2ax Wn'^e//^ Fallen.)。該病于1897年最早發(fā)生在日本關(guān)東的群 馬、櫪木等地區(qū)，而我國最早發(fā)生該病是在1964年。近幾年，隨著氣候環(huán)境和種植結(jié)構(gòu) 調(diào)整，水稻條紋葉枯病發(fā)病規(guī)模有著不斷擴(kuò)大的趨勢。江蘇自1964 1965年首次發(fā)生以 來，就一直在蘇南地區(qū)存在，個(gè)別年份危害較重。1998年以后，條紋葉枯病在江蘇省的 發(fā)生呈猛烈上升趨勢，2000年首次在蘇北地區(qū)暴發(fā)，至2007年己連續(xù)8年在江蘇省范圍 內(nèi)流行且受災(zāi)面積均在千萬畝以上，成為影響江蘇粳稻生產(chǎn)的頭號殺手(王才林，江蘇農(nóng) 業(yè)科學(xué)，2006， (3): 1-5)。盡管早在本世紀(jì)60年代，日本水稻遺傳學(xué)家就對水稻條紋葉枯病抗性資源進(jìn)行了大 量篩選、鑒定以及遺傳分析工作，但迄今仍只有兩種主要的病毒抗性基因的遺傳機(jī)制被闡 明。 一種以日本陸稻品種為代表，抗性由兩對顯性互補(bǔ)基因SA;fl(S/W)和SA^(^v2)共同控 制；另一種以一些非日本秈稻品種為代表，抗性由一對不完全顯性基因5h^/(5h;3)控制(陳 濤等，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006， (2): 1-4)。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，對由主基因和微效 多基因結(jié)合控制的遺傳以及微效多基因控制的遺傳進(jìn)行分析已經(jīng)成為可能。到目前為止， 利用不同的遺傳群體已初步定位了 27個(gè)27Z"孫黛珍等，中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006， 22(12): 318-321)，但這些G7Xs中如果除去上述主要的三個(gè)位點(diǎn)外，其它位點(diǎn)的效應(yīng)值均不太大， 很難在實(shí)際生產(chǎn)中得到應(yīng)用。分析國內(nèi)外目前育成的抗條紋葉枯病栽培粳稻系譜，發(fā)現(xiàn)其抗性基因最初來源于兩個(gè) 秈稻品種Modan和Mudgo，進(jìn)一步研究證實(shí)這兩個(gè)抗性品種的抗性基因均為S/v6々，所 以選育含》v6-/抗性基因的水稻品種是控制水稻條紋葉枯病危害最經(jīng)濟(jì)、有效的方法。 對已研究清楚的抗性基因加以有效利用，可以縮短育種周期，滿足國內(nèi)目前對抗條紋葉枯 病優(yōu)質(zhì)水稻品種的迫切需要。然而，利用傳統(tǒng)的田間或室內(nèi)接蟲鑒定的方法對5^6-/基因 進(jìn)行后代追蹤不漢耗時(shí)耗力，而且存在諸多不確定因素，利用分子標(biāo)記輔助選擇方法可以 有效的解決這一難題。Hayano-Saito Y(Hayano-Saito Y， "7Tzeor々7/7/ 2000， 101(1):59-63)利用/ ^IP或C4尸s標(biāo)記已將抗性基因限定在第11染色體兩個(gè)克隆序列重 疊的約286Kb的區(qū)域內(nèi)。然而，這些標(biāo)記的信息尚未公開，難以用于輔助選擇育種，因此篩選與緊密連鎖的SSR標(biāo)記，無疑可以加速標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在條紋葉枯病抗 性品種選育過程中的利用。三、 發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明是針對上述情況，利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法以含Srv6-/基 因的日本水稻品種關(guān)東194為材料，篩選和尋找穩(wěn)定存在的與水稻條紋葉枯病抗性基因 ■S/vZm'緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記，并用于輔助育種。技術(shù)方案水稻條紋葉枯病抗性基因5h^/的分子標(biāo)記方法，其特征在于用顯性SSR標(biāo)記RMll-8引物正向序列為TAGCCATGCTCATGCGTCAT反向序列為CGCGGT丁TGCAGTAGTTGC擴(kuò)增水稻條紋葉枯病抗性品種或育種材料DNA,如果能夠擴(kuò)增出157bp的單一條帶，則 表明抗條紋葉枯病基因存在，該基因位于水稻第11染色體上。有益效果水稻條紋葉枯病是影響粳稻生產(chǎn)的一種嚴(yán)重病毒病害。本發(fā)明利用分子生物學(xué) 和生物信息學(xué)的方法篩選到一個(gè)與水稻條紋葉枯病抗性基因5^6-/緊密連鎖的SSR標(biāo)記， 該標(biāo)記的應(yīng)用可以加速條紋葉枯病抗性品種選育。其優(yōu)點(diǎn)具體歸納如下(1) 與一些效應(yīng)較小且受環(huán)境影響較大的水稻條紋葉枯病抗性位點(diǎn)(g7Ii)相比， 5h^-Z以其穩(wěn)定、過硬的抗性以及主效、簡單的遺傳方式而被廣泛應(yīng)用傳統(tǒng)育種。對5h^" 基因進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇，可以快速培育出大量抗性穩(wěn)定的水稻品系或品種。(2) 傳統(tǒng)育種是利用含抗性基因的親本與生產(chǎn)上常用的品種進(jìn)行一系列雜交，然后對 條紋葉枯病抗性進(jìn)行單株選擇。由于該病的抗性受環(huán)境條件的影響很大，表型鑒定結(jié)果的 可靠性偏低，因此通過田間抗性鑒定或室內(nèi)接蟲鑒定來判斷條紋葉枯病抗性基因型，不僅 費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且難度大，成本高。通過對其抗性基因緊密連鎖標(biāo)記的帶型檢測，可預(yù)測其 抗性基因型，進(jìn)而在苗期即可鑒定高抗單株，這樣不僅節(jié)約鑒定費(fèi)用，而且大大提高抗條 紋葉枯病水稻品種的選擇效率。(3) 本發(fā)明獲得的與條紋葉枯病抗性基因S v6"緊密連鎖的SSR標(biāo)記，其檢測快速、 簡單，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，適合在短時(shí)間內(nèi)的對大量育種材料進(jìn)行標(biāo)記基因型的檢測，以判 斷其是否具有水稻條紋葉枯病抗性，并進(jìn)行篩選。四

圖1水稻條紋葉枯病抗性品種"關(guān)東194"的系譜 .圖2開發(fā)水稻條紋葉枯病抗性輔助選擇標(biāo)記所涉及的染色體片段圖3 SSR引物RM1卜8對田間抗、感小區(qū)的篩選電泳圖譜(a) RMU-8對田間抗病小區(qū)的篩選(PR:關(guān)東194; PS:武粳3; Fl:武粳13/關(guān)東194; 1~8: 田間抗性和分子鑒定一致單株；9~10:田間抗性和分子鑒定不一致單株)(b)RMll-8對田間感病小區(qū)的篩選(PR:關(guān)東194; PS:武粳13; Fl:武粳13/關(guān)東194; 1~9-田間抗性和分子鑒定一致單株；10:田間抗性和分子鑒定不一致單株) 圖4 SSR標(biāo)記RM11-8對39個(gè)條紋葉枯病抗性品系的電泳篩選圖譜(PR:關(guān)東94; PS:武粳13: F,:武粳13 /關(guān)東194; 1~8:田間抗性和分子鑒定一致的品 系-,9~10:田間抗性和分子鑒定不一致的品系)五具體實(shí)施方式
(結(jié)合附圖具體說明)(1)材料抗病品種關(guān)東194:抗條紋葉枯病的優(yōu)質(zhì)粳稻品種(日本引進(jìn)，含"Modan"的5^6-/ 抗性基因，圖l)，日本茨城縣育成，2003年農(nóng)林水產(chǎn)省登錄，登錄名為農(nóng)林387號。抗 條紋葉枯病，基因型為SA^-!'Sfv6-!'，該品種全生育期130-135天，株高85 95cm，每株有 效穗6 8個(gè)，每穗實(shí)粒數(shù)95 105粒，結(jié)實(shí)率93%~95%，千粒重24~25g。感病品種武粳3:江蘇高產(chǎn)粳稻品種，江蘇省武進(jìn)區(qū)稻麥育種場育成，2003年審定 定名。條紋葉枯病抗性基因型為^v6-/^v6-/。該品種全生育期156天，株高97 102cm， 每株有效穗8 10個(gè)，每穗實(shí)粒數(shù)115-125粒，結(jié)實(shí)率92%~93%，千粒重27 28g。 由抗、感組合武粳13/關(guān)東194產(chǎn)生的高世代抗病和感病小區(qū)。 1999年在海南選用江蘇高產(chǎn)粳稻品種武粳13 (武育5021)(感病親本，條紋葉枯病 抗性基因型為^v6AA;Zm')為母本(？)與引進(jìn)的抗條紋葉枯病的優(yōu)質(zhì)粳稻品種關(guān)東194 (抗性親本，基因型為5h^/S/v6-!')為父本(3)雜交配組。2000年在南京種植F,組合， 同年冬在海南種植F2，成熟后全部單株混收，2001年在南京種植F3，成熟后全部單株混 收。F2代選單株衍生F3小區(qū)，以后每個(gè)小區(qū)繼續(xù)收獲一個(gè)單株加代衍生成相應(yīng)小區(qū)。2002 年(F4)開始選擇單株，此后(2003-2005年)每年在南京種植各世代(F5 ~F7)株系。 單株選擇材料每年正季種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗(yàn)田(南京)，5月 15~18日播種，秧田設(shè)置在灰飛虱蟲源豐富的小麥田邊。6月15~18日移栽。每個(gè)株系種 植40 50株，2行或4行區(qū)，行株距17cmxl7cm,小區(qū)間空1行。田間管理按常規(guī)方法 進(jìn)行，秧田期和移栽后30天內(nèi)不防治灰飛虱。(2)與S v6-i緊密連鎖SSR標(biāo)記的選取、開發(fā)及多態(tài)性篩選利用Hayano-Saito Y (Hayano-Saito Y，" a/. 7T7ew^;^/1998,96(8): 1044-1049)對水稻條紋葉枯病抗性基因5^6-/的定位結(jié)果，并結(jié)合日本水稻基因組網(wǎng)站 (www.rpg.dna.affic.go.jp/IRGSP)已公布的第11染色體整合圖譜的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)基因 上方3.0cM處的一個(gè)WFLP標(biāo)記C1172 (第II染色體一80.2cM)在整合圖譜中同樣存在， 從該標(biāo)記向下到另一個(gè)/ /^XP標(biāo)記E1126S (第11染色體一84.3 cM)共4.1 cM的區(qū)段內(nèi)查 找到10個(gè)克隆序列(圖2)。利用己公布的微衛(wèi)星標(biāo)記并用SSR搜索軟件-SSR HUNTER 2.0 對10個(gè)克隆序列中可能存在的SSR位點(diǎn)進(jìn)行查詢、篩選，并設(shè)計(jì)、合成了 13對SSR引物。利用上述13對引物在抗性親本關(guān)東194和感病親本武粳13間進(jìn)行多態(tài)性篩選，結(jié)果 只有一對引物RM11-8 (表1)在抗性親本和感病親本組合中呈現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)頻率極小 (7.69%)，這可能是抗、感親本均為粳稻，遺傳差異較小的緣故。RMU-8的帶型為顯性， 其？1的帶型與感病親本一致。表l在兩個(gè)親本間表現(xiàn)多態(tài)的SSR標(biāo)記RM11-8標(biāo)己正向序列(5' — 3')反向序列(5' — 3')所在克隆 退火，片段大小RM1卜8TAGCCATGCTCATGCGTCATCGCGGTTTGCAGTAGTTGCSJNBa0038B22 59'C 157bp(3)田間鑒定從2004年正季農(nóng)藝性狀基本穩(wěn)定時(shí)開始對這些小區(qū)的水稻條紋葉枯病抗性進(jìn)行大田 鑒定。移栽30天后調(diào)査條紋葉枯病的自然發(fā)病情況，以感條紋葉枯病品種武育粳3號為 對照，利用條紋葉枯病大發(fā)生的自然條件進(jìn)行抗性篩選，發(fā)病單株病級參照Washio等 (1968)制定的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，即A級長勢很差，病葉整片或部分萎蔫，葉片巻曲、枯死；B級長勢很差，但病葉不萎蔫，下部黃葉病斑連續(xù)，上部葉有褪綠癥狀；Bt級 癥狀與B相似，但長勢較差；Cr級長勢較弱，病葉略巻曲，病部略黃，呈零星點(diǎn)狀或 條紋狀，病健部交界明顯；C級長勢略弱，零星點(diǎn)狀略黃，病健部有間隔；D級長勢 很好，初期可見的很小病斑隨苗的生長被掩飾。將A、 B和Bt作為感病，Cr、 C 、 D和 未出現(xiàn)癥狀的作為抗病，計(jì)算小區(qū)中感病植株的比例為發(fā)病率。將發(fā)病率分成一級 (<4.9%)、 二級(5%~9.9%)、三級(10%~19.9%)、四級(20% 39.9%)和五級(》40%) 5個(gè)等級。根據(jù)系譜關(guān)系統(tǒng)計(jì)不同發(fā)病率等級單株后代出現(xiàn)各級單株的比例，評價(jià)抗性篩 選的效果。為了確保鑒定結(jié)果的可靠性，小區(qū)育秧均選擇在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所 試驗(yàn)田(南京)小麥田周圍，且對這些小區(qū)不噴灑任何殺蟲劑，以保證充足蟲量的遷入， 每年單株接蟲量均保證在5頭以上。水稻病情調(diào)査分3次，前兩次在水稻條紋葉枯病發(fā)病 高峰期進(jìn)行，后一次在水稻分蘗盛期進(jìn)行，發(fā)病程度用小區(qū)發(fā)病率(感病單株占小區(qū)48 個(gè)單株的百分比)表示。連續(xù)三年鑒定為高抗的108個(gè)小區(qū)(無典型發(fā)病株)，視其抗性 基因型為S/vZw'5^6-/，對三年連續(xù)鑒定為高感的68個(gè)小區(qū)(發(fā)病率》感病親本)，視其 感病基因型為加6-i加6-i'。 2006年正季病情調(diào)查結(jié)束后，采用SDS法提取抗感親本、Ft 及代表高世代純合抗性小區(qū)基因型的一個(gè)抗性單株和代表高世代純合感病小區(qū)基因型的 一個(gè)感病單株的葉片提取DNA。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)Chen (Chen X W a/. 7T eor Zpp/ Ge"W, 1997, 95(4): 553-567.)報(bào)道，反應(yīng)產(chǎn)物在4%瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠染色并于凝 膠成像系統(tǒng)下觀察，記載。(4)標(biāo)記選擇效率評價(jià)在優(yōu)良組合武粳13 /關(guān)東194的高世代小區(qū)中，選擇三 年連續(xù)鑒定為高抗小區(qū)的抗性單株(抗病基因型為Srv6-z' S/v6-0和高感小區(qū)的感病單株(感病基因型為加6々^v6-Z)進(jìn)行標(biāo)記RMll-8的篩選(圖3)。結(jié)果顯示對田間鑒定 為純合抗病基因型的小區(qū)進(jìn)行RMll-8的篩選時(shí)，純合抗性親本帶型的小區(qū)數(shù)與田間鑒定 為純合抗病的小區(qū)數(shù)其吻合率為90.74%;對田間鑒定為純合感病的小區(qū)進(jìn)行RM11-8的 篩選時(shí)，由于RMll-8為顯性標(biāo)記無法區(qū)分純合感病親本帶型和抗感雜合帶型，故無法對 其感病小區(qū)的吻合率做準(zhǔn)確判別(表2)。因此，對抗性基因型小區(qū)進(jìn)行SSR標(biāo)記RMll-8 的篩選所產(chǎn)生的吻合率90.74%更適合作為本試驗(yàn)對水稻條紋葉枯病抗性基因輔助選擇效 果的評價(jià)指標(biāo)。表2 田間鑒定和RMll-8標(biāo)記篩選結(jié)果對比田間鑒定基因型個(gè)數(shù)分子標(biāo)記帶型及個(gè)數(shù)吻合率(％)歸-/ SvZw'i n 純合抗性親本帶型純合感病親本帶型或F,帶型 ^ 9890.74 10純合抗性親本帶型純合感病親本帶型或F,帶型08167 —(5) SSR標(biāo)記RMll-8在實(shí)際育種中的應(yīng)用移栽后30天在農(nóng)藝性狀穩(wěn)定的小區(qū)采取單株葉片，用SDS法提取DNA(Deilaporta SL， Wood J， Hicks JB. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep， 1983， 1 (1): 19 ~ 21)。根據(jù)引物RM11-8序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向序列為 TAGCCATGCTCATGCGTCAT，反向序列為CGCGGTTTGCAGTAGTTGC。擴(kuò)增體系10^1， DNA模板1/J， 94°C 預(yù)變性5min， 94°C變性0.5min, 59'C復(fù)性0.5min, 72°C延伸 Imin， 35個(gè)循環(huán)后，72'C再延伸7min。反應(yīng)產(chǎn)物在3.5%瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠 染色并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，根據(jù)帶型判斷各單株的抗性基因型，獲得157bp單一條帶 的確定為抗性基因型S/v6-i v&-i的抗病株系。根據(jù)分子標(biāo)記輔助選擇的上下世代的抗性 表現(xiàn)，評價(jià)標(biāo)記輔助選擇的效果。我們利用標(biāo)記RMll-8對武粳13 /關(guān)東194的后代選 種單株進(jìn)行大量篩選，淘汰純合感病親本或F！帶型的單株(極個(gè)別農(nóng)藝性狀優(yōu)良株予以 保留)，保留純合抗性親本帶型的單株。至2007年，對該組合進(jìn)入課題組品比試驗(yàn)的39 個(gè)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗條品系(其中4個(gè)品系已進(jìn)入江蘇省各類中間試驗(yàn))再次進(jìn)行了標(biāo)記檢 測和田間發(fā)病情況調(diào)査(均為高抗，發(fā)病率低于2°/。)。結(jié)果顯示除JD7033和JD7301的 帶型為純合感病親本或F,帶型而表現(xiàn)高抗外，其它37個(gè)品系的分子檢測結(jié)果均為純合抗 性親本帶型且大田鑒定結(jié)果亦表現(xiàn)為高抗(圖4)。因此，通過上述SSR分子標(biāo)記來鑒定 5h;6-Z基因型并篩選抗病水稻植株，可以迅速提高我國水稻條紋葉枯病抗性品種的育種進(jìn) 程。結(jié)合條紋葉枯病自然發(fā)病情況調(diào)查結(jié)果，只在基因型為S/vZw'5h^-/、抗性級別達(dá)到一、 二級的小區(qū)選擇單株。2006年獲得條紋葉枯病抗性穩(wěn)定、農(nóng)藝性狀一致的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)新 品系"寧5055"，其株高98 102cm，每株8 10穗，穗長16cm，穗型偏直立，每穗總粒數(shù) 140 150粒，結(jié)實(shí)率90%~92%，千粒重26 27g。序列表<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院<120>水稻條紋葉枯病抗性基因》v6-/的分子標(biāo)記方法<130>說明書<140> 00<141> 2008-01-03<160> 2<170> Patentln version 3.1<210> 1<211> 20<212> DNA<213>人工合成<220><221> RMll-8引物正向序列<222> (1)..(20)<223><400> 1tagccatgct catgcgtcat 20<210> 2 <211> 19 <212> DNA <213>人工合成 <220><221> RMll-8引物反向序列<222> (1)..(19)<223><400> 2cgcggtttgc agtagttgc 19
權(quán)利要求
1、水稻條紋葉枯病抗性基因Stvb-i的分子標(biāo)記方法，其特征在于用顯性SSR標(biāo)記RM11-8引物正向序列為TAGCCATGCTCATGCGTCAT反向序列為CGCGGTTTGCAGTAGTTGC擴(kuò)增水稻條紋葉枯病抗性品種或育種材料DNA，如果能夠擴(kuò)增出157bp的單一條帶，則表明抗條紋葉枯病基因Stvb-i存在，該基因位于水稻第11染色體上。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻條紋葉枯病抗性基因Stvb-i的分子標(biāo)記方法，屬于農(nóng)業(yè)生物工程技術(shù)領(lǐng)域。依據(jù)前人對條紋葉枯病抗性基因Stvb-i的定位結(jié)果，利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的方法設(shè)計(jì)了13對與水稻條紋葉枯病抗性基因Stvb-i緊密連鎖的SSR標(biāo)記，其中1對標(biāo)記RM11-8在抗、感育種親本關(guān)東194(攜帶Stvb-i基因)和武粳13之間呈現(xiàn)多態(tài)性。利用已知抗、感基因型的該組合高世代小區(qū)對該標(biāo)記進(jìn)行了抗性選擇效果的評價(jià)，其吻合率為90.74％。因此，RM11-8可作為該組合抗水稻條紋葉枯病輔助選擇的分子標(biāo)記，預(yù)測其抗性基因型，大大提高水稻條紋葉枯病抗性品種的選擇效率和鑒定效率。
文檔編號C12Q1/68GK101225445SQ200810018799
公開日2008年7月23日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月25日
發(fā)明者張亞東, 鎮(zhèn) 朱, 李余生, 靜 林, 王才林, 凌 趙, 濤 陳 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院