一種提高水稻穗瘟抗性的基因GF14e、蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物遺傳技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種提高水稻穗攝抗性的 基因 GF14e、蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由真菌Magnaporthe grisea巧eberOBarr引起的水稻稻攝病是世界各稻區(qū)危害 最嚴(yán)重的水稻病害之一，對(duì)全球稻作栽培產(chǎn)生毀滅性的影響。全球每年因稻攝病造成的產(chǎn) 量損失達(dá)11~30%，直接經(jīng)濟(jì)損失約50億美元，損失的糧食足W養(yǎng)活6000萬(wàn)人口。在我國(guó)， 凡有水稻栽培的地方都有稻攝病發(fā)生。南北稻區(qū)每年均受到不同程度危害，一般減產(chǎn)10~ 20%，重的達(dá)40~50%，局部田塊甚至顆粒無(wú)收。
[0003] 目前，利用品種的抗性，開(kāi)展稻攝病抗性育種被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)境友好的 防治途徑。近年來(lái)，育種學(xué)家們利用常規(guī)育種技術(shù)培育出了許多水稻稻攝病抗病品種。但 是，大部分抗病品種推廣應(yīng)用2~3年后即喪失其稻攝病抗性。如高抗稻攝病品種"窄葉青8 號(hào)"推廣種植不到Ξ年便喪失抗性，高產(chǎn)抗病優(yōu)質(zhì)品種"梗釉89"推廣不到四年，其抗病性也 明顯下降。由此可見(jiàn)，水稻品種稻攝病抗性周期短是水稻生產(chǎn)中一個(gè)普遍而突出的問(wèn)題，延 長(zhǎng)水稻品種稻攝病的持性壽命已成為我國(guó)乃至各水稻生產(chǎn)國(guó)水稻改良中需要優(yōu)先解決的 問(wèn)題。
[0004] 稻攝病在水稻生長(zhǎng)各個(gè)時(shí)期都可能發(fā)生，尤W葉攝和穗攝最為常見(jiàn)。與葉攝相比 而言，穗攝的危害更大，最嚴(yán)重的時(shí)候能導(dǎo)致顆粒無(wú)收。盡管已有的研究表明，水稻葉攝抗 性和穗攝抗性有共通性，但是葉攝抗性和穗攝抗性也有不相同的地方。我們前期在用31個(gè) 近等基因系檢測(cè)其葉攝和穗攝抗性時(shí)發(fā)現(xiàn)，有一些基因系有葉攝抗性但沒(méi)有穗攝抗性，反 之亦然。此外，我們?cè)谟没蛉唐夹g(shù)挖掘水稻葉攝和穗攝響應(yīng)的基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，至少有40% 的基因在葉攝和穗攝接種后的表達(dá)模式是不同的。
[0005] 綜合W上的研究表明，水稻葉攝抗性和穗攝抗性在某種程度上是不同的。因此，為 了解決水稻抗病性周期短的問(wèn)題，解決水稻的穗攝抗性也顯得尤其重要。然而目前已知的 研究基本上都是針對(duì)水稻葉攝抗性的，而對(duì)穗攝抗性的研究則非常少。目前，為了提高水稻 的稻攝病抗性，對(duì)于水稻穗攝抗性的研究刻不容緩。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種提高水稻穗攝抗性的 基因 GF14e、蛋白及其應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了如下具體的技術(shù)方案：
[000引一種提高水稻穗攝抗性的基因 GF14e，所述基因具有如SEQ ID No: 1所示的核巧酸 序列。
[0009]本發(fā)明還提供了一種提高水稻穗攝抗性的蛋白，所述蛋白具有如SEQ ID No:2所 示的氨基酸序列。
[0010] 在其中一些實(shí)施例中，所述蛋白由如SEQ ID No:l所示的核巧酸序列編碼。
[0011] 本發(fā)明還提供了所述提高水稻穗攝抗性的基因 GF14e在提高水稻穗攝抗性方面的 應(yīng)用。
[0012] 14-3-3基因家族是一類非常重要的防衛(wèi)基因，在植物的抗病中發(fā)揮了重要作用。 在水稻中，14-3-3基因家族共包括8個(gè)成員，即GF14a-h。已有的研究表明，GF14e在水稻葉攝 抗性中發(fā)揮負(fù)向的調(diào)控作用。用RNAi技術(shù)沉默GF14e的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致水稻葉片的稻攝病抗性 增加。然而，本發(fā)明的發(fā)明人在用基因忍片技術(shù)挖掘水稻葉攝和穗攝響應(yīng)的基因時(shí)發(fā)現(xiàn)， GF14e在葉攝和穗攝接種后的響應(yīng)是不同的。葉攝接種后，GF14e的表達(dá)水平下調(diào)，運(yùn)與之前 的研究結(jié)果是一致的，但在穗攝接種后，GF14e的表達(dá)水平卻是上調(diào)的，運(yùn)表明其在葉攝和 穗攝抗性中可能發(fā)揮相反的作用。因此，GF14e有可能在穗攝抗性中發(fā)揮正向的調(diào)控作用。
[0013] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下有益效果：
[0014] 1.本發(fā)明首次證明了水稻基因 GF14e是水稻穗攝抗性的功能基因，該基因的克隆 和生物學(xué)功能驗(yàn)證對(duì)于水稻稻攝病抗性的分子機(jī)制研究有重要的參考意義；
[0015] 2.本發(fā)明提供了利用Camv35S啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)GF14e基因的水稻轉(zhuǎn)化過(guò)表達(dá)載體。該 載體轉(zhuǎn)化水稻后能大幅提高GF14e的表達(dá)量，伴隨著表達(dá)量的提高，轉(zhuǎn)化植株的稻攝病穗攝 抗性明顯增強(qiáng)，并且轉(zhuǎn)基因植株在生長(zhǎng)狀態(tài)及農(nóng)藝性狀上沒(méi)有明顯的改變。因此，本發(fā)明通 過(guò)Camv35S啟動(dòng)子過(guò)表達(dá)GF14e的技術(shù)可W應(yīng)用于水稻的基因遺傳工程育種，并能夠應(yīng)用于 生產(chǎn)實(shí)踐中，改良水稻的稻攝病抗性，從而保障目前水稻病害頻發(fā)的氣候條件下的水稻生 產(chǎn)安全。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為實(shí)施例1中所使用的過(guò)表達(dá)載體P冊(cè)SN的載體圖譜；
[0017] 圖2為實(shí)施例2的轉(zhuǎn)基因植株中GF14e表達(dá)水平檢測(cè)圖；
[0018] 圖3為實(shí)施例3中過(guò)表達(dá)GF14e對(duì)水稻植株的穗攝抗性的影響，其中**表示與對(duì)照 相比存在極顯著差異。
【具體實(shí)施方式】
[0019] W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未 注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，所采用的技術(shù)手段通常為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0020] 實(shí)施例1提高水稻穗攝抗性的基因及過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0021] (1)、取水稻稻攝病高抗品種Ξ黃占2號(hào)（SHZ-2)的幼苗葉片部位，用Tr i Zo 1 Reagent(Invitrogen公司，其貨號(hào)為：15596026)提取葉片總RNA，采用甲醒變性凝膠電泳和 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的純度及量；
[0022] (2)、取化g的總RNA做起始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所采用的逆轉(zhuǎn)錄酶為PrimeScript(TAKARA 公司），逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟參考該逆轉(zhuǎn)錄酶的使用說(shuō)明。W逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用引物:F， ACGCGTCGACATATCTGGCCCAAGAGCAGTA(SEQ ID No：3)；R,GGAATTCAGGCTCACAACTGACATACCG (SEQ ID No:4)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR所用的聚合酶為KOD FX(Toyok)公司）。反應(yīng)體系為50uL， 按照KOD FX的說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為:94°C5min; 94°C30sec，57°C30sec，68 °C80sec，35個(gè)循環(huán);68°C10minDPCR擴(kuò)增獲得約1268bp的片段；
[0023] (3)、采用PCR產(chǎn)物直接純化的方法回收該片段后，用Sail和EcoRI對(duì)片段和PHQSN 載體(其載體圖如圖1所示，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W參考文獻(xiàn):擬南芥AtNHX5基