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      甲基?β?環(huán)糊精在提高桿狀病毒外源蛋白表達量中的應用

      文檔序號:10679923閱讀:465來源:國知局
      甲基?β?環(huán)糊精在提高桿狀病毒外源蛋白表達量中的應用
      【專利摘要】甲基?β?環(huán)糊精在提高桿狀病毒外源蛋白表達量中的應用,本發(fā)明用一定濃度MβCD孵育用于表達外源蛋白的細胞,能顯著的提高昆蟲桿狀病毒感染效率并提高外源蛋白的表達量。本發(fā)明可明顯改善桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達效率,同時MβCD本身易溶于水和有機溶劑,已經(jīng)廣泛的應用于藥品和食品行業(yè),具有良好安全性,因此應用桿狀病毒表達藥用蛋白同樣可以應用本方法。本發(fā)明提供的方法容易理解,操作簡單易行,效果明顯。
      【專利說明】
      甲基-e-環(huán)糊精在提高桿狀病毒外源蛋白表達量中的應用
      技術領域
      [0001] 本發(fā)明屬于病毒學領域W及蛋白質表達系統(tǒng)領域,設及甲基-0-環(huán)糊精(Methyl- 0-cyclodextrin,簡稱她CD,也有表示為MBCD,Me-0CD,MeBCD)提高昆蟲桿狀病毒入侵效率, 進而提高外源蛋白表達量的具體應用方法。
      【背景技術】
      [0002] 桿狀病毒是一類具有囊膜的雙鏈DNA病毒,自然界中主要感染鱗翅目、膜翅目和雙 翅目昆蟲。自Smith等人首次利用首猜銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nucleopolyhe化ovi;rus,AcMNPV)作載體成功表達人0-干擾素 W來,至今已用桿狀病毒表達 的蛋白有千種(Acharya A,Sriram S&Saehrawat S.Bombyx mori nucleopolyhedrovirus molecular biology and biotechnological applications for large-scale synthesis of recombinant proteins.Curr Sci 2002,83:455-465.),目前應用的昆蟲桿狀病毒表達 系統(tǒng)主要有AcMNPV和家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhe化ovi;rus,BmNPV), 由于桿狀病毒具有強大多角體啟動子及PIO啟動子,表達的外源蛋白具有較好的修飾加工, 具有良好的生物學活性,而且其基因組可W插入較大片段外源DNA等,所W昆蟲桿狀病毒表 達系統(tǒng)已被公認為是優(yōu)良的真核表達系統(tǒng)。近年來,利用重組桿狀病毒生產(chǎn)的藥物及疫苗 已經(jīng)上市,例如利用桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒疫苗(Cervarix?,葛蘭素史克) 已經(jīng)上市,并取得非常好的免疫效果。
      [0003] 為了更好的利用桿狀病毒表達外源蛋白,國內外許多學者致力于如何提高其表達 量方面的研究:法國學者將病毒中組織蛋白酶基因、幾下質酶基因和plO基因破壞W增加表 達量(專利:改進的桿狀病毒表達系統(tǒng),公開號:103748229A);美國科學家通過利用多種信 號膚改變外源蛋白加工與分泌(專利:Method to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems. Uni ted States.Patent 5278050)?提高表達量。一系列經(jīng)過改造的桿狀病毒在應用中都需要通過 重組病毒的繁殖、大量擴增環(huán)節(jié),才能應用于外源蛋白的表達,在重組病毒制備及擴增過程 中,需要消耗大量的人力財力,如果能在病毒感染的過程中,應用一定手段提高感染效率、 進而提高其表達量,可節(jié)省人力物力,降低成本,達到事半功倍的效果。
      [0004] MKD,是0-環(huán)糊精(e-CD)的烷基化衍生物,白色粉末,無毒、無嗅、微甜,易溶于水 和有機溶劑,在食品及藥物中得到了廣泛應用。謝伯泰等綜述了 M0CD在口服藥、鼻腔噴霧 劑、栓劑W及透皮吸收劑方面的應用前景,并且指出M0CD是毒性比較小的藥物穩(wěn)定劑、增溶 劑及吸收促進劑,但要注意她CD使用劑量,W保證其具有較好的安全性(謝伯泰,馬曉明,姚 孫賢,謝薇梅.甲基化-e-環(huán)糊精的特性及其在藥物中的應用.中國新藥雜志2009年第18卷 第8期705-709.)。本課題組前期在研究桿狀病毒入侵過程時發(fā)現(xiàn)M0CD在較高濃度下,可W 抑制BmNPV感染BmN細胞,正是在運用一系列的連續(xù)濃度梯度M0CD研究抑制入侵的過程中, 意外的發(fā)現(xiàn)當使用低濃度她CD時,非但沒有抑制病毒的感染,反而增強病毒的感染性,最終 增加了桿狀病毒的對外源蛋白的表達量。利用她CD提高桿狀病毒感染率及外源蛋白表達量 方面還沒有報道,所w本發(fā)明是首次對運種提高桿狀病毒表達載體外源蛋白表達量的方法 做具體報道。

      【發(fā)明內容】

      [0005] 解決的技術問題:本發(fā)明的目的是提供一種化學藥物一一M0CD的新用途,提供應 用一定濃度的甲基-e-環(huán)糊精提高桿狀病毒外源蛋白表達量的新方法,該方法簡便,成本低 廉,易于操作推廣。
      [0006] 技術方案:甲基-0-環(huán)糊精在提高昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)外源蛋白表達量中的應 用。
      [0007] 所述昆蟲桿狀病毒為AcMNPV病毒或BmNPV病毒。
      [000引所述表達系統(tǒng)為sf21、s巧或BmN細胞。
      [0009] 所述表達系統(tǒng)為貼壁培養(yǎng)及懸浮培養(yǎng)的細胞。
      [0010] 所述甲基-e-環(huán)糊精的工作濃度為0.125-2mM。
      [0011] 甲基-0-環(huán)糊精在提高昆蟲桿狀病毒入侵宿主細胞的效率的應用。
      [0012] 提高昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)外源蛋白表達量的組合物,有效成分包括甲基-0-環(huán) 糊精。
      [001引1.M0CD(購自Sigma公司)溶液的配制及桿狀病毒準備
      [0014] 用1 XPBS溶解MPCD,配制濃度為50~lOOmM的儲存液備用。
      [0015] 將重組桿狀病毒感染敏感宿主細胞,感染后60-9化收獲出芽病毒(Budded virus, BV),用終點稀釋法測定病毒滴度,4°C避光保存用于后續(xù)研究。
      [0016] 2.細胞的解育
      [0017] 將對數(shù)生長期的昆蟲細胞接種到培養(yǎng)皿/板中,不同細胞株保持其最適密度,比如 sf 21和sf9保持在約5 X 104個細胞/cm2,BmN細胞約1 X 104個細胞/cm2,貼壁12-2地后,用配 制好的M0CD儲存液加入到貼壁昆蟲細胞培養(yǎng)液中,使M0CD終濃度分別為0.125~2mM,解育 10-120min,解育細胞溫度為24-29°C,WOmM M0CD(即等體積1 XPBS)解育液作為對照。解育 時間到后,分別去除(或者不去除nxPBS和不同濃度的MKD解育液,用無血清的TC-100培 養(yǎng)基輕輕沖洗細胞2次。
      [0018] 3.病毒感染效率分析及外源蛋白表達量分析
      [0019] 接著用感染復數(shù)(multiplicity of infection,M0I)為0.01~50的桿狀病毒感染 相應的宿主細胞,感染60-120min后,除去病毒液,用無血清培養(yǎng)基輕輕洗涂細胞兩次(也可 不洗),加入正常的培養(yǎng)基,感染后化利用流式細胞儀分析被感染細胞中巧光表達效率,確 定病毒感染效率。外源蛋白表達量分析則收集感染后24-120h細胞樣品,檢測細胞中表達的 巧光素酶活性,比較不同處理間巧光素酶相對活性差異。
      [0020] 有益效果:本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)MKD的一種新用途。用一定濃度MKD解育用于表達外 源蛋白的細胞,能顯著的提高昆蟲桿狀病毒感染效率并提高外源蛋白的表達量。當用 0.25mM M0CD解育BmN細胞時,BmNPV病毒感染的細胞數(shù)量提高了35%左右,而巧光素酶的活 性比對照提高了 799%,其它濃度的增強效果也達到極顯著水平;AcMNPV入侵效率提高了 51%。本發(fā)明公開的用途,可明顯改善桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達效率,同時M0CD本身易溶于 水和有機溶劑,已經(jīng)廣泛的應用于藥品和食品行業(yè),具有良好安全性,因此應用桿狀病毒表 達藥用蛋白同樣可w應用本方法。本發(fā)明提供的方法容易理解,操作簡單易行,效果明顯。
      【附圖說明】
      [0021] 圖1.不同濃度她CD預處理sf 21細胞對AcMNPV病毒感染率分析圖。分別用終濃度為 OmM(等體積的 1 X PBS作為對照,CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、ImM、2mM的她CD處理30min 后,再用AcBac-eg巧感染(M0I = 5Hh,去除感染液后正常培養(yǎng)。6h后用流式細胞儀檢測細胞 相對感染率,其中CT化感染率設為100 %,其他各處理相對感染率如圖所示,*表示與對照相 比較差異顯著(P<〇.05),**表示與對照相比較差異極顯著(P<0.01)。
      [0022] 圖2.不同濃度MKD預處理sf 9細胞對AcMNPV病毒感染率分析圖。分別用終濃度為 OmM(等體積的 1 X PBS作為對照,CT化)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、ImM、1.5mM、2mM的M PCD處理sf 9細胞30min后,用AcBac-egf p感染(MOI = 5)化,去除感染液后正常培養(yǎng),6h后用 流式細胞儀檢測細胞感染率。**表示與對照相比較差異極顯著(P<〇.01)。
      [0023] 圖3.不同濃度的M0CD對AcMNPV病毒外源蛋白表達量影響示意圖(感染后9化)。分 別用終濃度為OmM(等體積的 1 X PBS作為對照,CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、ImM、2mM CD處理sf 21 30min后,接著用AcBac-Luc (MOI = 5)分別感染不同處理細胞Ih,去除感染液后 正常培養(yǎng),在感染后96h收集細胞檢測巧光素酶活性。**表示與對照相比較差異極顯著(P< 0.01)。
      [0024] 圖4.0.25mM的MPCD處理細胞,AcMNPV表達巧光素酶的時相分析圖(MOI = 5)。用 0.25mM MKD解育sf21細胞30min后,用AcBac-Luc分別感染她CD及對照細胞(M0I = 5),27°C 感染Ih后,移去病毒液,在感染后2地、4她、72h、96h、12化各時間點收集樣品,檢測分析巧光 素酶相對活性。*表示與對照相比較差異顯著(P<〇.05),**表示與對照相比較差異極顯著(P <0.01)。
      [0025] 圖5.不同濃度她CD處理BmN細胞后對BmNPV感染率分析圖。使用MPCD終濃度分別為 0.125mM、0.25mM、0.5mM、lmM、2mM,對照加入相應體積lXPBS,27°C解育30min后去除解育 液,用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍后用BmBac-e奸P (M0I = 5) 27 °C感染化,移去病毒液, 清洗兩遍,放置于27°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)化后,流式細胞儀統(tǒng)計感染細胞數(shù)。**表示與對照相比較 差異極顯著(P<0.01)。
      [0026] 圖6 .M0CD(0.25mM)解育細胞時間對BmNPV感染率影響示意圖。終濃度為0.25mM CD 27°C分別解育10、30、45、60、90、120min,對照加入相應體積1 X PBS。然后去除解育液,用 無血清的TC-100培養(yǎng)基輕輕沖洗細胞2次,接著用BmBac-eg巧感染細胞(M0I = 5),27°C感染 化后去掉病毒液,用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍,放置于27°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)化后,流式細 胞儀統(tǒng)計巧光細胞數(shù)量。*表示與對照相比較差異顯著(P<〇.05),**表示與對照相比較差異 極顯著(P<0.01)。
      [0027] 圖7 .不同濃度M0CD對BmNPV病毒(不同感染劑量)表達的巧光素酶活性影響示意 圖。使用0.125mM、0.25mM、0.5mM、MKD終濃度27°C解育BmN細胞30min,對照加入相 應體積1 XPBS,后去除解育液沖洗細胞2次,用病毒BmBac-Luc(M0I = 1及MOI = 0.1)感染BmN 細胞,27°C感染化后去除病毒液,用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍,放置于27°C培養(yǎng)箱培 養(yǎng)24h后測定細胞中巧光素酶活性。深灰色柱狀圖為M0I = 1感染劑量,**表示各處理與對照 達到極顯著水平(P<0.01);淺灰色為M0I = 0.1感染劑量,T表示處理與對照達到顯著水平(P <0.05),巧表示各處理與對照達到極顯著水平(P<0.01)。
      【具體實施方式】
      [002引 WAcMNPV 為例:
      [0029] 用1 X PBS(購自上海生工生物工程股份有限公司)溶解郵CD,配制濃度為50mM的儲 存液。
      [0030] 為了便于觀察及統(tǒng)計本發(fā)明所述的提高外源蛋白的表達效率,分別將hsp70操縱 下的報告基因 eg巧和AcMNPV多角體基因啟動子控制下的巧光素酶基因轉座到AcMNPVBac- t〇-Bac( Invitrogen)的化7轉座插入位點,命名AcBac-egfp和AcBac-Luc,提取DNA,轉染 sf21,收獲出芽病毒粒子(Budded Virus,BV)后,繼續(xù)用于感染sf21細胞,7化后收獲病毒, 終點稀釋法測定病毒滴度,4°C避光保存,用于本發(fā)明中設及的實例。
      [0031] 實施例1:分別用終濃度為0.125mM、0.25mM、0.5mM、的她CD處理后,AcBac- egfp感染率分析(M0I = 5)
      [0032] 在24孔細胞培養(yǎng)板中各接種約1 X lO5/孔的sf21細胞,貼壁后,將配制好的MPCD儲 存液加入到貼壁細胞sf 21的細胞培養(yǎng)液中,使M0CD終濃度分別為0mM(等體積1 X PBS,圖 1CTRL)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、lmM、2m]\L27°C解育30min后去除解育液,用無血清TC-100 培養(yǎng)基輕輕沖洗細胞2次(也可不洗),接著用M0I = 5的AcBac-egfp病毒感染不同處理的細 胞,27°C感染化后移去病毒液,用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍(也可不洗),添加正常培 養(yǎng)基,放置于27 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)化后,用流式細胞儀統(tǒng)計有巧光表達的細胞數(shù)量及總細胞數(shù), 利用excel t測驗分析處理與對照組間是否存在顯著性差異。實驗設=個重復,并重復兩 次。圖1是M0I = 5AcBac-egfp感染宿主昆蟲細胞sf21示例的結果,統(tǒng)計結果顯示0.125-2mM 濃度的M0CD處理細胞相對感染率較對照均有顯著的增加。
      [0033] 實施例2:分別用終濃度為0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、ImM、1.5mM、2mM 的她 CD 處理sf9后,AcBac-e奸p感染率分析(M0I = 5)
      [0034] 在24孔細胞培養(yǎng)板中各接種約IX lO5個/孔的sf9,貼壁后,用配制好的MKD儲存 液加入到貼壁細胞S f 9的細胞培養(yǎng)液中,使郵C D終濃度分別為0 m M (等體積1 X P B S,圖 1CT化)、0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、ImM、1.5mM、2mM,27°C解育30min后去除解育液,用 無血清的TC-lOO培養(yǎng)基輕輕沖洗細胞2次,接著用M0I = 5AcBac-egfp分別感染不同濃度地3 CD解育的細胞,27°C感染比后,移去病毒液,用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍,添加常規(guī)培 養(yǎng)基,放置于27 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)化后,用流式細胞儀統(tǒng)計有巧光表達的細胞數(shù)量及總細胞數(shù), 利用excel中t測驗分析處理與對照組間是否存在顯著性差異。實驗設S個重復,并重復兩 次。圖2是M0I = lAcBac-e奸P感染宿主昆蟲細胞sf 9示例的結果,統(tǒng)計結果表明用0.125-2mM 濃度處理細胞后,表達巧光蛋白的細胞數(shù)量較對照均有極顯著的提高。
      [0035] 實施例3:不同濃度的M0CD對AcBac-Luc巧光素酶表達量影響(M0I = 5,感染后96h)
      [0036] 在24孔細胞培養(yǎng)板中各接種約IX 105個/孔的sf21,貼壁后,用配制好的她CD儲存 液加入到細胞培養(yǎng)液中,使M0CD終濃度分別為0.125mM、0.25mM、0.5mM、等體積的1 XPBS作為對照(即圖3CT化),27°C解育30min后去除解育液,用無血清的TC-lOO培養(yǎng)基輕輕 沖洗細胞2次,接著用AcBac-Luc (M0I = 5)分別感染不同處理細胞,27 °C感染比后,移去病毒 液,用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍,加入正常培養(yǎng)基,在感染后96h收集細胞檢測巧光素 酶活性,各個處理均設=個重復。樣品收集時,首先去除培養(yǎng)基,用IXPBS洗兩遍,再用50化 L巧光素酶試劑盒(Promega)中裂解液裂解、收集MPCD處理及對照細胞,-80°C保存,直至 120h后收集完所有樣品,參照Promega產(chǎn)品指南所述方法用20/20。LuminometeHPromega 公司)檢測巧光素酶活性。細胞裂解混合物1200化pm 4°C離屯、5min,取上清進行10倍稀釋, 再取化L稀釋液與20化底物混合,測定巧光素酶相對活性。圖3是AcBac-Luc感染不同濃度藥 物處理sf21的結果,統(tǒng)計結果顯示在0.25~2mM藥物處理的細胞巧光素酶的活性極顯著高 于對照。
      [0037] 實施例4.終濃度為0.25mM的MKD處理后,AcBac-Luc感染后不同時間點巧光素酶 活性分析(M0I = 5)
      [0038] 在24孔細胞培養(yǎng)板中各接種約IX 105個/孔的sf21,貼壁后,用配制好的她CD儲存 液加入到細胞培養(yǎng)液中,使她CD終濃度為0.25mM,對照加入相應量的1 XPBS(即圖4CTRL), 27°(:解育3〇111111后去除解育液,用無血清的1'(:-100培養(yǎng)基輕輕沖洗細胞2次,接著用4。8曰(3- Luc分別感染M0CD及對照細胞(M0I = 5),27°C感染化后,移去病毒液,用無血清的TC-100培 養(yǎng)基輕洗2遍,加入正常培養(yǎng)基,在感染后2地、4她、72h、96h、12化各時間點收集樣品,各個 處理均設S個重復。巧光素酶活性的測定見本發(fā)明實施例3。圖4是Ac麗PV感染sf21示例的 結果,統(tǒng)計結果顯示藥物處理的細胞巧光素酶的活性顯著高于對照(P<〇.05)。
      [0039] WBmNPV 為例:
      [0040] BmBacJS13是一株與BmNPV具有相同感染特性的Bacmid[Huang JS et al .Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhe化oviru.Virologica Sinica.2007,22(3) :218-225]。為了便于觀察及統(tǒng)計 本發(fā)明所述的感染效率,將hsp70操縱下的報告基因 egfp和BmNPV多角體基因啟動子操縱下 的巧光素酶基因分別轉座到BmBacJS13中化7轉座插入位點,命名BmBac-egfp和BmBac-Luc, 提取DNA,轉染家蠶細胞,收獲BV后,繼續(xù)用于感染家蠶細胞,7化后收獲病毒,終點稀釋法測 定病毒滴度,4°C避光保存,用于本發(fā)明中W下實例。
      [0041 ] 實施例5:不同濃度Mf3CD處理BmN細胞后,表達綠色巧光蛋白細胞感染率比例調查
      [0042] 在24孔細胞培養(yǎng)板中各接種約5X104個/孔的BmN細胞,貼壁后,分別取不同量的M PCD儲存液加入到細胞培養(yǎng)液中,使M0CD終濃度分別為0.125mM、0.25mM、0.5mM、對 照加入相應體積1 X PBS,27 °C解育30min后去除解育液,用無血清的TC-lOO培養(yǎng)基輕輕沖洗 細胞2次,接著用BmBac-egf P (M0I = 5)分別感染不同處理的細胞,27 °C感染化后,移去病毒 液,用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍,添加常規(guī)培養(yǎng)基,放置于27 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)化后,流式 細胞儀統(tǒng)計感染細胞數(shù),t測驗分析比較不同濃度MKD對病毒感染效率影響。圖5是BmBac- egfp感染BmN細胞示例的結果,統(tǒng)計結果顯示0.125、0.25、0.5mM M0CD處理組都有顯著的增 強效果,感染效率比對照分別提高29%、35%、33%,達到極顯著水平(P<0.01),其它各處理 也有一定增強效果。
      [0043] 實施例6:Mf3CD(0.25mM)處理細胞時間與病毒感染率關系
      [0044] 在24孔細胞培養(yǎng)板中各接種約5 X 104個/孔的BmN細胞,貼壁后,加入MKD儲存液 使終濃度為〇.25mM,對照加入1XPBS,27°C分別解育10、30、45、60、90、120111111。然后去除解 育液,用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕輕沖洗細胞2次,接著用BmBac-egfp感染細胞(M0I = 5), 27°C感染化后去掉病毒液,用無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍,放置于27°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)化 后,流式細胞儀統(tǒng)計巧光細胞數(shù)量,t測驗分析M0CD解育時間對病毒感染效率的影響。實驗 設S個重復。圖6是BmBac-egf P感染M0CD解育BmN不同時間示例的結果。統(tǒng)計顯示M0CD處理 細胞lOminW上即有較好的增強效果,10-120分鐘處理均顯著高于對照。
      [0045] 實施例7:不同濃度M0CD對不同感染劑量病毒感染細胞中表達的巧光素酶表活性 影響
      [0046] 在24孔細胞培養(yǎng)板中各接種約5X104個/孔的BmN細胞,貼壁后,分別取配制好的M PCD儲存液加入到細胞培養(yǎng)液中,使M0CD終濃度分別0.125mM、0.25mM、0.5mM、對照 加入相應體積1XPBS,27°C解育30min后去除解育液,用無血清的TC-lOO培養(yǎng)基輕輕沖洗細 胞2次,接著用病毒BmBac-Luc(M0I = 1及M0I = 0.1)感染細胞,27°C感染化后去除病毒液,用 無血清的TC-100培養(yǎng)基輕洗2遍,放置于27 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)2地后測定細胞中巧光素酶活性, 檢測方法見本發(fā)明實施例3。實驗設=個重復。圖7是BmBac-Luc感染BmN細胞示例的結果,統(tǒng) 計結果表明不同濃度M0CD處理細胞均可W提高巧光素酶表達量,W0.25mM處理效果最為明 顯,在用M0I = 1劑量感染中,處理比對照的活性提高了799%,達到極顯著水平,其它處理也 都達到極顯著水平(P<〇.01);在用M0I = 0.1劑量感染中與處理比對照的活性提高了 532%, 達到極顯著水平(P<0.01),其它不同劑量病毒感染都達到顯著(0.125mM,P<0.05)與極顯著 效果(P<〇.〇l)。
      [0047] 最后應當說明的是:W上所述的實施例和實施方式中所述M0CD濃度和處理時間僅 用于說明性目的而非限制,但本領域的普通技術人員應當理解,在細胞狀態(tài),培養(yǎng)方式(懸 浮培養(yǎng)及貼壁培養(yǎng)),細胞培養(yǎng)基種類(了(:100,6'日。日'3,5。90011 8。1,6邱'日33['^〇友.5尸1 等)、培養(yǎng)基理化性質等(比如酸堿度等)微小的差異,W及細胞類型(如化5等),可W在形式 上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變,而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和 范圍,并被包括在本申請的精神和范圍之內;同時也包含其它桿狀病毒及在病毒入侵中依 賴于膽固醇的其它囊膜病毒,也被包括在本申請的精神和范圍之內。
      【主權項】
      1. 甲基-β-環(huán)糊精在提高昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)外源蛋白表達量中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于所述昆蟲桿狀病毒為AcMNPV病毒或BmNPV病 毒。3. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于所述表達系統(tǒng)為8€21、8€9、把811行代(沿5) 或BmN細胞。4. 根據(jù)權利要求3所述的應用,其特征在于所述表達系統(tǒng)為貼壁培養(yǎng)及懸浮培養(yǎng)的細 胞。5. 根據(jù)權利要求1所述的應用,其特征在于所述甲基-β_環(huán)糊精的工作濃度為0.125-2mM〇6. 甲基-β-環(huán)糊精在提高昆蟲桿狀病毒入侵宿主細胞的效率的應用。7. -種提高昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)外源蛋白表達量的組合物,其特征在于有效成分包 括甲基-β-環(huán)糊精。
      【文檔編號】C12N15/866GK106047932SQ201610383426
      【公開日】2016年10月26日
      【申請日】2016年6月1日
      【發(fā)明人】黃金山, 郝碧芳, 南文斌, 柳林, 沈興家
      【申請人】江蘇科技大學
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