識(shí)別prame抗原短肽的t細(xì)胞受體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種能夠特異性結(jié)合衍生自PRAME抗原的短肽RYLFPPLFM的T細(xì)胞受體(TCR)，所述抗原短肽RYLFPPLFM可與HLA A2402形成復(fù)合物并一起被呈遞到細(xì)胞表面。本發(fā)明還提供了編碼所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的載體。另外，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明TCR的細(xì)胞。
【專利說(shuō)明】
識(shí)別PRAME抗原短肽的T細(xì)胞受體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及能夠識(shí)別源自PRAME抗原短肽的TCR，本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)上述TCR來(lái)獲 得的PRAME特異性的Τ細(xì)胞，及他們?cè)陬A(yù)防和治療PRAME相關(guān)疾病中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] PRAME 為黑色素瘤特異性抗原（preferentially expressed antigen of melanoma，PRAME)， 在88%初發(fā)和95%轉(zhuǎn)移黑色素瘤中都有表達(dá)（Ikeda H, et al. Iimmity, 1997, 6 (2) : 199-208)，正 常皮膚組織和良性黑素細(xì)胞則不表達(dá)。PRAME在細(xì)胞內(nèi)生成后被降解成小分子多肽，并與 MHC (主組織相容性復(fù)合體）分子結(jié)合形成復(fù)合物，被呈遞到細(xì)胞表面。RYLFPPLFM是衍生自 PRAME抗原的短肽，是PRAME相關(guān)疾病治療的一種靶標(biāo)。除了黑色素瘤，PRAME還在多種腫 瘤表達(dá)，包括肺鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、頭頸部腫瘤、霍杰金氏淋巴瘤、肉瘤及成神 經(jīng)管細(xì)胞瘤等（van，t Veer LJ，et al. Nature, 2002, 415 (6871) :530-536 ;Boon K，et al. Oncogene, 2003, 22(48) :7687-7694)另外，其在白血病中PRAME亦有顯著表達(dá)，急性淋巴細(xì) 胞白血病17%~42%，急性粒細(xì)胞白血病30%~64%(3七6；[1^&(3110,6七&1.0&1106166116七 Cytogene，2002, 138(1) :89-91)。對(duì)于上述疾病的治療，可以采用化療和放射性治療等方 法，但都會(huì)對(duì)自身的正常細(xì)胞造成損害。
[0003] T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療是將對(duì)靶細(xì)胞抗原具有特異性的反應(yīng)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)入病人體 內(nèi)，使其針對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮作用。T細(xì)胞受體（TCR)是T細(xì)胞表面的一種膜蛋白，其能夠識(shí)別 相應(yīng)的靶細(xì)胞表面的抗原短肽。在免疫系統(tǒng)中，通過(guò)抗原短肽特異性的TCR與短肽-主組織 相容性復(fù)合體（PMHC復(fù)合物）的結(jié)合引發(fā)T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞（APC)直接的物理接觸， 然后T細(xì)胞及APC兩者的其他細(xì)胞膜表面分子就發(fā)生相互作用，引起一系列后續(xù)的細(xì)胞信 號(hào)傳遞和其他生理反應(yīng)，從而使得不同抗原特異性的T細(xì)胞對(duì)其靶細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。因 此，本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于分離出對(duì)NY-ES0-1抗原短肽具有特異性的TCR，以及將該TCR轉(zhuǎn) 導(dǎo)T細(xì)胞來(lái)獲得對(duì)NY-ES0-1抗原短肽具有特異性的T細(xì)胞，從而使他們?cè)诩?xì)胞免疫治療中 發(fā)揮作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種識(shí)別PRAME抗原短肽的T細(xì)胞受體。
[0005] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種T細(xì)胞受體（TCR)，所述TCR能夠與RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物結(jié)合。
[0006] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含TCR α鏈可變域和TCR β鏈可變域，所述TCR α鏈 可變域的CDR3的氨基酸序列為VVNHFIDSGYALN(SEQ ID Ν0:12);和/或所述TCR0鏈可變 域的 CDR3 的氨基酸序列為 ATSPDASNEKLF(SEQ ID Ν0:15)。
[0007] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR α鏈可變域的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)為：
[0008] a CDR1-NSASQS (SEQ ID NO:10)
[0009] a CDR2-VYSSGN (SEQ ID NO:11)
[0010] a CDR3-VVNHFIDSGYALN (SEQ ID NO:12);和 / 或
[0011] 所述TCRi3鏈可變域的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)為：
[0012] β CDR1-KGHDR (SEQ ID NO:13)
[0013] β CDR2-SFDVKD (SEQ ID NO:14)
[0014] β CDR3-ATSPDASNEKLF (SEQ ID NO:15)。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含TCRa鏈可變域和TCRf3鏈可變域，所述TCRa鏈 可變域?yàn)榕cSEQ ID NO: 1具有至少90%序列相同性的氨基酸序列；和/或所述TCRi3鏈可 變域?yàn)榕cSEQ ID N0 :5具有至少90%序列相同性的氨基酸序列。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含a鏈可變域氨基酸序列SEQ ID N0:1。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO: 5。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR為α β異質(zhì)二聚體，其包含TCR a鏈恒定區(qū)TRAC*01 和 TCR0 鏈恒定區(qū) TRBC1*01 或 TRBC2*01。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的a鏈氨基酸序列為SEQ ID NO :3和/或所述TCR的 β鏈氨基酸序列為SEQ ID N0:7。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR是可溶的。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR為單鏈。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR是由a鏈可變域與β鏈可變域通過(guò)肽連接序列連接 而成。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR在a鏈可變區(qū)氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或 第94位，和/或a鏈J基因短肽氨基酸倒數(shù)第3位、倒數(shù)第5位或倒數(shù)第7位中具有一個(gè) 或多個(gè)突變；和/或所述TCR在β鏈可變區(qū)氨基酸第11、13、19、21、53、76、89、91、或第94 位，和/或β鏈J基因短肽氨基酸倒數(shù)第2位、倒數(shù)第4位或倒數(shù)第6位中具有一個(gè)或多 個(gè)突變，其中氨基酸位置編號(hào)按MGT(國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)）中列出的位置編號(hào)。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的a鏈可變域氨基酸序列包含SEQ ID Ν0:32和/或 所述TCR的β鏈可變域氨基酸序列包含SEQ ID N0:34。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的氨基酸序列為SEQ ID NO: 30。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR包括（a)除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRa鏈；以 及（b)除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRi3鏈；
[0027] 并且（a)和（b)各自包含功能性可變結(jié)構(gòu)域，或包含功能性可變結(jié)構(gòu)域和所述 TCR鏈恒定結(jié)構(gòu)域的至少一部分。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域之間形成人工二 硫鍵。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，在所述TCR中形成人工二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了選自下列 的一組或多組位點(diǎn)：
[0030] TRAO01 外顯子 1 的 Thr48 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Ser57 ;
[0031] TRAO01 外顯子 1 的 Thr45 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Ser77 ;
[0032] TRAO01 外顯子 1 的 TyrlO 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Serl7 ;
[0033] TRAO01 外顯子 1 的 Thr45 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Asp59 ;
[0034] TRAO01 外顯子 1 的 Serl5 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Glul5 ;
[0035] TRAO01 外顯子 1 的 Arg53 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Ser54 ;
[0036] TRAO01 外顯子 1 的 Pro89 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Alal9 ;和
[0037] TRAO01 外顯子 1 的 TyrlO 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Glu20。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈氨基酸序列為SEQ ID NO:26和/或所述TCR 的β鏈氨基酸序列為SEQ ID N0:28。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間含有人工鏈間二硫 鍵。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，其特征在于，在所述TCR中形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘 基取代了選自下列的一組或多組位點(diǎn)：
[0041] TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；
[0042] TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位氨基酸；
[0043] TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或
[0044] TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR包含α鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結(jié)構(gòu)域以 外的全部或部分β鏈恒定域，但其不包含α鏈恒定域，所述TCR的α鏈可變域與β鏈形 成異質(zhì)二聚體。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述TCR的α鏈和/或β鏈的C-或Ν-末端結(jié)合有偶聯(lián)物。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，與所述Τ細(xì)胞受體結(jié)合的偶聯(lián)物為可檢測(cè)標(biāo)記物、治療劑、ΡΚ修 飾部分或任何這些物質(zhì)的組合。優(yōu)選地，所述治療劑為抗-CD3抗體。
[0048] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種多價(jià)TCR復(fù)合物，其包含至少兩個(gè)TCR分子，并且 其中的至少一個(gè)TCR分子為本發(fā)明第一方面所述的TCR。
[0049] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼本發(fā)明第一方 面所述的TCR分子的核酸序列或其互補(bǔ)序列。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含編碼TCRa鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO:33。
[0051 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的核酸分子包含編碼TCR β鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO:35。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述核酸分子包含編碼TCR a鏈的核苷酸序列SEQ ID NO :4和 /或包含編碼TCRi3鏈的核苷酸序列SEQ ID N0:8。
[0053] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第三方面所述的核 酸分子；優(yōu)選地，所述的載體為病毒載體；更優(yōu)選地，所述的載體為慢病毒載體。
[0054] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞中含有本發(fā)明 第四方面所述的載體或基因組中整合有外源的本發(fā)明第三方面所述的核酸分子。
[0055] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種細(xì)胞，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明第三方面所述的核酸 分子或本發(fā)明第四方面所述的載體；優(yōu)選地，所述細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞或干細(xì)胞。
[0056] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載 體以及本發(fā)明第一方面所述的TCR、本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、本發(fā)明第三方面所 述的核酸分子、本發(fā)明第四方面所述的載體、或本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞。
[0057] 本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的T細(xì)胞受體、或本發(fā)明第二方 面所述的TCR復(fù)合物、本發(fā)明第三方面所述的核酸分子、本發(fā)明第四方面所述的載體、或本 發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞的用途，用于制備治療腫瘤或自身免疫疾病的藥物。
[0058] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種治療疾病的方法，包括給需要治療的對(duì)象施用適 量的本發(fā)明第一方面所述的T細(xì)胞受體、或本發(fā)明第二方面所述的TCR復(fù)合物、本發(fā)明第三 方面所述的核酸分子、本發(fā)明第四方面所述的載體、或本發(fā)明第六方面所述的細(xì)胞、或本發(fā) 明第七方面所述的藥物組合物。
[0059] 優(yōu)選地，所述的疾病為腫瘤，優(yōu)選地所述腫瘤包括黑色素瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、乳腺 癌、腎細(xì)胞癌、頭頸部腫瘤、霍杰金氏淋巴瘤、肉瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、白血?。òǖ幌?于，急性淋巴細(xì)胞白血病，急性粒細(xì)胞白血?。?、胃癌、肺癌、食道癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細(xì) 胞癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等。
[0060] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0061] 圖la、圖lb、圖lc、圖ld、圖le和圖If分別為T(mén)CRa鏈可變域氨基酸序列、TCRa 鏈可變域核苷酸序列、TCR a鏈氨基酸序列、TCR a鏈核苷酸序列、具有前導(dǎo)序列的TCR a鏈 氨基酸序列以及具有前導(dǎo)序列的TCR a鏈核苷酸序列。
[0062] 圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為T(mén)CR0鏈可變域氨基酸序列、TCR0 鏈可變域核苷酸序列、TCR0鏈氨基酸序列、TCRi3鏈核苷酸序列、具有前導(dǎo)序列的TCRi3鏈 氨基酸序列以及具有前導(dǎo)序列的TCR β鏈核苷酸序列。
[0063] 圖3為單克隆細(xì)胞的⑶8+及四聚體-ΡΕ雙陽(yáng)性染色結(jié)果。
[0064] 圖4a和圖4b分別為可溶性TCR α鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0065] 圖5a和圖5b分別為可溶性TCR β鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0066] 圖6為純化后得到的可溶性TCR的膠圖。最左側(cè)泳道為還原膠，中間泳道為分子 量標(biāo)記（marker)，最右側(cè)泳道為非還原膠。
[0067] 圖7a和圖7b分別為單鏈TCR的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0068] 圖8a和圖8b分別為單鏈TCRa鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0069] 圖9a和圖9b分別為單鏈TCRi3鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0070] 圖10a和圖10b分別為單鏈TCR連接序列（linker)的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0071 ] 圖11為純化后得到的可溶性單鏈TCR的膠圖。左側(cè)泳道為分子量標(biāo)記（marker)， 右側(cè)泳道為非還原膠。
[0072] 圖12為本發(fā)明可溶性TCR與RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物結(jié)合的BIAcore動(dòng)力 學(xué)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0073] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，找到了與PRAME抗原短肽RYLFPPLFM(SEQ ID N0:9)能夠特異性結(jié)合的TCR，所述抗原短肽RYLFPPLFM可與HLA A2402形成復(fù)合物并一起 被呈遞到細(xì)胞表面。本發(fā)明還提供了編碼所述TCR的核酸分子以及包含所述核酸分子的載 體。另外，本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)導(dǎo)本發(fā)明TCR的細(xì)胞。
[0074] 術(shù)語(yǔ)
[0075] MHC分子是免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)，可以是I類(lèi)或II類(lèi)MHC分子。因此，其對(duì) 于抗原的呈遞具有特異性，不同的個(gè)體有不同的MHC，能呈遞一種蛋白抗原中不同的短肽到 各自的APC細(xì)胞表面。人類(lèi)的MHC通常稱為HLA基因或HLA復(fù)合體。
[0076] T細(xì)胞受體（TCR)，是呈遞在主組織相容性復(fù)合體（MHC)上的特異性抗原肽的唯一 受體。在免疫系統(tǒng)中，通過(guò)抗原特異性的TCR與pMHC復(fù)合物的結(jié)合引發(fā)T細(xì)胞與抗原呈遞 細(xì)胞（APC)直接的物理接觸，然后T細(xì)胞及APC兩者的其他細(xì)胞膜表面分子就發(fā)生相互作 用，這就引起了一系列后續(xù)的細(xì)胞信號(hào)傳遞和其他生理反應(yīng)，從而使得不同抗原特異性的T 細(xì)胞對(duì)其靶細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)。
[0077] TCR是由α鏈/β鏈或者γ鏈/δ鏈以異質(zhì)二聚體形式存在的細(xì)胞膜表面的糖 蛋白。在95%的Τ細(xì)胞中TCR異質(zhì)二聚體由α和β鏈組成，而5%的Τ細(xì)胞具有由γ和 δ鏈組成的TCR。天然α β異質(zhì)二聚TCR具有α鏈和β鏈，α鏈和β鏈構(gòu)成α β異源 二聚TCR的亞單位。廣義上講，α和β各鏈包含可變區(qū)、連接區(qū)和恒定區(qū)，β鏈通常還在 可變區(qū)和連接區(qū)之間含有短的多變區(qū)，但該多變區(qū)常視作連接區(qū)的一部分。各可變區(qū)包含 嵌合在框架結(jié)構(gòu)（framework regions)中的3個(gè)⑶R(互補(bǔ)決定區(qū)），Q)R1、Q)R2和⑶R3〇 ⑶R區(qū)決定了 TCR與pMHC復(fù)合物的結(jié)合，其中⑶R3由可變區(qū)和連接區(qū)重組而成，被稱為超 變區(qū)。TCR的α和β鏈一般看作各有兩個(gè)"結(jié)構(gòu)域"即可變域和恒定域，可變域由連接的 可變區(qū)和連接區(qū)構(gòu)成。TCR恒定域的序列可以在國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)aMGT)的公開(kāi)數(shù) 據(jù)庫(kù)中找到，如TCR分子α鏈的恒定域序列為"TRAC*01"，TCR分子β鏈的恒定域序列為 "TRBC1*01"或"TRBC2*01"。此外，TCR的α和β鏈還包含跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)，胞質(zhì)區(qū)很短。
[0078] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明多肽"、"本發(fā)明的TCR"、"本發(fā)明的Τ細(xì)胞受體"可互換 使用。
[0079] 天然鏈間二硫鍵與人工鏈間二硫鍵
[0080] 在天然TCR的近膜區(qū)C α與C β鏈間存在一組二硫鍵，本發(fā)明中稱為"天然鏈間二 硫鍵"。在本發(fā)明中，將人工引入的，位置與天然鏈間二硫鍵的位置不同的鏈間共價(jià)二硫鍵 稱為"人工鏈間二硫鍵"。
[0081] 為方便描述二硫鍵的位置，本發(fā)明中TRAO01與TRBC1*01或TRBC2*01氨基酸序 列的位置編號(hào)按從N端到C端依次的順序進(jìn)行位置編號(hào)，如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從 N端到C端依次的順序第60個(gè)氨基酸為P(脯氨酸），則本發(fā)明中可將其描述為T(mén)RBC1*01 或TRBC2*01外顯子1的Pro60,也可將其表述為T(mén)RBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位 氨基酸，又如TRBC1*01或TRBC2*01中，按從N端到C端依次的順序第61個(gè)氨基酸為Q (谷 氨酰胺），則本發(fā)明中可將其描述為T(mén)RBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Gln61，也可將其表 述為T(mén)RBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸，其他以此類(lèi)推。本發(fā)明中，可變區(qū) TRAV與TRBV的氨基酸序列的位置編號(hào)，按照頂GT中列出的位置編號(hào)。如TRAV中的某個(gè)氨 基酸，頂GT中列出的位置編號(hào)為46,則本發(fā)明中將其描述為T(mén)RAV第46位氨基酸，其他以此 類(lèi)推。本發(fā)明中，其他氨基酸的序列位置編號(hào)有特殊說(shuō)明的，則按特殊說(shuō)明。
[0082] 發(fā)明詳述
[0083] TCR 分子
[0084] 在抗原加工過(guò)程中，抗原在細(xì)胞內(nèi)被降解，然后通過(guò)MHC分子攜帶至細(xì)胞表面。T 細(xì)胞受體能夠識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞表面的肽-MHC復(fù)合物。因此，本發(fā)明的第一方面提供了一 種能夠結(jié)合RYLFPPLFM-HLA Α2402復(fù)合物的TCR分子。優(yōu)選地，所述TCR分子是分離的或 純化的。該TCR的α和β鏈各具有3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)。
[0085] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述TCR的α鏈包含具有以下氨基酸序列的 CDR ：
[0086] a CDR1-NSASQS (SEQ ID NO:10)
[0087] a CDR2-VYSSGN (SEQ ID NO:11)
[0088] a CDR3-VVNHFIDSGYALN (SEQ ID NO:12);和 / 或
[0089] 所述TCR β鏈可變域的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)為：
[0090] β CDR1-KGHDR (SEQ ID NO:13)
[0091] β CDR2-SFDVKD (SEQ ID NO:14)
[0092] β CDR3-ATSPDASNEKLF (SEQ ID NO:15)。
[0093] 可以將上述本發(fā)明的CDR區(qū)氨基酸序列嵌入到任何適合的框架結(jié)構(gòu)中來(lái)制備嵌 合TCR。只要框架結(jié)構(gòu)與本發(fā)明的TCR的CDR區(qū)兼容，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的 CDR區(qū)就能夠設(shè)計(jì)或合成出具有相應(yīng)功能的TCR分子。因此，本發(fā)明TCR分子是指包含上述 α和/或β鏈CDR區(qū)序列及任何適合的框架結(jié)構(gòu)的TCR分子。本發(fā)明TCRa鏈可變域?yàn)?與SEQ ID NO: 1具有至少90%，優(yōu)選地95%，更優(yōu)選地98%序列相同性的氨基酸序列；和/ 或本發(fā)明TCRI3鏈可變域?yàn)榕cSEQ ID N0:5具有至少90%，優(yōu)選地95%，更優(yōu)選地98 %序 列相同性的氨基酸序列。
[0094] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明的TCR分子是由α與β鏈構(gòu)成的異質(zhì)二聚 體。具體地，一方面所述異質(zhì)二聚TCR分子的α鏈包含可變域和恒定域，所述α鏈可變域 氨基酸序列包含上述 α 鏈的 CDR1(SEQ ID N0:10)、CDR2(SEQ ID N0:11)和 CDR3(SEQ ID NO: 12)。優(yōu)選地，所述TCR分子包含a鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO: 1。更優(yōu)選地，所 述TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。另一方面，所述異質(zhì)二聚TCR分子 的β鏈包含可變域和恒定域，所述β鏈可變域氨基酸序列包含上述β鏈的⑶R1(SEQ ID NO: 13)、CDR2 (SEQ ID NO :14)和 CDR3 (SEQ ID NO: 15)。優(yōu)選地，所述 TCR 分子包含 β 鏈可 變域氨基酸序列SEQ ID NO: 5。更優(yōu)選地，所述TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列為SEQ ID N0:5〇
[0095] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明的TCR分子是由α鏈的部分或全部和/或β 鏈的部分或全部組成的單鏈TCR分子。有關(guān)單鏈TCR分子的描述可以參考文獻(xiàn)Chung et al (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91，12654-12658。根據(jù)文獻(xiàn)中所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員能 夠容易地構(gòu)建包含本發(fā)明⑶Rs區(qū)的單鏈TCR分子。具體地，所述單鏈TCR分子包含V α、 V β和C β，優(yōu)選地按照從Ν端到C端的順序連接。
[0096] 所述單鏈TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列包含上述α鏈的⑶R1(SEQ ID Ν0 : 10)、CDR2 (SEQ ID NO :11)和 CDR3 (SEQ ID NO :12)。優(yōu)選地，所述單鏈 TCR 分子包含 α 鏈 可變域氨基酸序列SEQ ID NO: 1。更優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子的α鏈可變域氨基酸序列 為SEQ ID Ν0:1。所述單鏈TCR分子的β鏈可變域氨基酸序列包含上述β鏈的⑶R1(SEQ ID NO :13)、CDR2 (SEQ ID NO :14)和 CDR3 (SEQ ID NO: 15)。優(yōu)選地，所述單鏈 TCR 分子包 含β鏈可變域氨基酸序列SEQ ID NO: 5。更優(yōu)選地，所述單鏈TCR分子的β鏈可變域氨基 酸序列為SEQ ID NO:5。
[0097] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，本發(fā)明的TCR分子的恒定域是人的恒定域。本領(lǐng)域 技術(shù)人員知曉或可以通過(guò)查閱相關(guān)書(shū)籍或MGT(國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)）的公開(kāi)數(shù) 據(jù)庫(kù)來(lái)獲得人的恒定域氨基酸序列。例如，本發(fā)明TCR分子α鏈的恒定域序列可以為 "TRAC*01"，TCR分子β鏈的恒定域序列可以為"TRBC1*01"或"TRBC2*01"。頂GT的TRAO01 中給出的氨基酸序列的第53位為Arg，在此表示為：TRAO01外顯子1的Arg53,其他以此 類(lèi)推。優(yōu)選地，本發(fā)明TCR分子α鏈的氨基酸序列為SEQ ID N0:3,和/或β鏈的氨基酸 序列為 SEQ ID Ν0:7。
[0098] 天然存在的TCR是一種膜蛋白，通過(guò)其跨膜區(qū)得以穩(wěn)定。如同免疫球蛋白（抗體） 作為抗原識(shí)別分子一樣，TCR也可以被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于診斷和治療，這時(shí)需要獲得可溶性的TCR 分子?？扇苄缘腡CR分子不包括其跨膜區(qū)?？扇苄訲CR有很廣泛的用途，它不僅可用于研 究TCR與pMHC的相互作用，也可用作檢測(cè)感染的診斷工具或作為自身免疫病的標(biāo)志物。類(lèi) 似地，可溶性TCR可以被用來(lái)將治療劑（如細(xì)胞毒素化合物或免疫刺激性化合物）輸送到 呈遞特異性抗原的細(xì)胞，另外，可溶性TCR還可與其他分子（如，抗-CD3抗體）結(jié)合來(lái)重新 定向T細(xì)胞，從而使其靶向呈遞特定抗原的細(xì)胞。本發(fā)明也獲得了對(duì)PRAME抗原短肽具有 特異性的可溶性TCR。
[0099] 為獲得可溶性TCR，一方面，本發(fā)明TCR可以是在其α和β鏈恒定域的殘基之間 引入人工二硫鍵的TCR。半胱氨酸殘基在所述TCR的α和β鏈恒定域間形成人工鏈間二硫 鍵。半胱氨酸殘基可以取代在天然TCR中合適位點(diǎn)的其他氨基酸殘基以形成人工鏈間二硫 鍵。例如，取代TRAO01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57 的半胱氨酸殘基來(lái)形成二硫鍵。引入半胱氨酸殘基以形成二硫鍵的其他位點(diǎn)還可以是： TRAO01外顯子1的Thr45和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser77 ;TRAO01外顯子1的 TyrlO 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Serl7 ;TRAO01 外顯子 1 的 Thr45 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Asp59 ;TRAO01 外顯子 1 的 Serl5 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外 顯子 1 的 Glul5 ;TRAO01 外顯子 1 的 Arg53 和 TRBC1*01 或 TRBC2*01 外顯子 1 的 Ser54 ; TRAO01外顯子1的Pro89和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Alal9 ;或TRAO01外顯子 1的TyrlO和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Glu20。即半胱氨酸殘基取代了上述α與 β鏈恒定域中任一組位點(diǎn)?？稍诒景l(fā)明TCR恒定域的一個(gè)或多個(gè)C末端截短最多50個(gè)、或 最多30個(gè)、或最多15個(gè)、或最多10個(gè)、或最多8個(gè)或更少的氨基酸，以使其不包括半胱氨 酸殘基來(lái)達(dá)到缺失天然二硫鍵的目的，也可通過(guò)將形成天然二硫鍵的半胱氨酸殘基突變?yōu)?另一氨基酸來(lái)達(dá)到上述目的。
[0100] 如上所述，本發(fā)明的TCR可以包含在其α和β鏈恒定域的殘基間引入的人工二 硫鍵。應(yīng)注意，恒定域間含或不含上文所述的引入的人工二硫鍵，本發(fā)明的TCR均可含有 TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2恒定域序列。TCR的TRAC恒定域序列和TRBC1或TRBC2 恒定域序列可通過(guò)存在于TCR中的天然二硫鍵連接。
[0101] 為獲得可溶性TCR，另一方面，本發(fā)明TCR還包括在其疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR， 這些疏水芯區(qū)域的突變優(yōu)選為能夠使本發(fā)明可溶性TCR的穩(wěn)定性提高的突變，如在公開(kāi)號(hào) 為W02014/206304的專利文獻(xiàn)中所述。這樣的TCR可在其下列可變域疏水芯位置發(fā)生突變： (α和/或β鏈）可變區(qū)氨基酸第11，13，19,21，53,76,89,91，94位，和/或<1鏈1基因 (TRAJ)短肽氨基酸位置倒數(shù)第3, 5, 7位，和/或β鏈J基因（TRBJ)短肽氨基酸位置倒 數(shù)第2, 4,6位，其中氨基酸序列的位置編號(hào)按國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)aMGT)中列出的位 置編號(hào)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉上述國(guó)際免疫遺傳學(xué)信息系統(tǒng)，并可根據(jù)該數(shù)據(jù)庫(kù)得到不同 TCR的氨基酸殘基在頂GT中的位置編號(hào)。
[0102] 本發(fā)明中疏水芯區(qū)域發(fā)生突變的TCR可以是由一柔性肽鏈連接TCR的a與β鏈 的可變域而構(gòu)成的穩(wěn)定性可溶單鏈TCR。應(yīng)注意，本發(fā)明中柔性肽鏈可以是任何適合連接 TCRa與β鏈可變域的肽鏈。如在本發(fā)明實(shí)施例4中構(gòu)建的單鏈可溶性TCR，其a鏈可變 域氨基酸序列為SEQ ID N0:32,編碼的核苷酸序列為SEQ ID Ν0:33;β鏈可變域氨基酸序 列為SEQ ID Ν0:34,編碼的核苷酸序列為SEQ ID Ν0:35。
[0103] 另外，對(duì)于穩(wěn)定性而言，專利文獻(xiàn)201510260322. 4還公開(kāi)了在TCR的a鏈可變區(qū) 與β鏈恒定區(qū)之間引入人工鏈間二硫鍵能夠使TCR的穩(wěn)定性顯著提高。因此，本發(fā)明的高 親和力TCR的a鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間還可以含有人工鏈間二硫鍵。具體地，在所述 TCR的a鏈可變區(qū)與β鏈恒定區(qū)之間形成人工鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基取代了：TRAV 的第46位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的第60位氨基酸；TRAV的第47位氨 基酸和TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的61位氨基酸；TRAV的第46位氨基酸和TRBC1*01 或TRBC2*01外顯子1的第61位氨基酸；或TRAV的第47位氨基酸和TRBC1*01或TRBC2*01 外顯子1的第60位氨基酸。優(yōu)選地，這樣的TCR可以包含（i )除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全 部或部分TCRa鏈，和（ii )除其跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分TCRi3鏈，其中（i )和 (? )均包含TCR鏈的可變域和至少一部分恒定域，a鏈與β鏈形成異質(zhì)二聚體。更優(yōu)選 地，這樣的TCR可以包含a鏈可變域和β鏈可變域以及除跨膜結(jié)構(gòu)域以外的全部或部分 β鏈恒定域，但其不包含a鏈恒定域，所述TCR的a鏈可變域與β鏈形成異質(zhì)二聚體。
[0104] 本發(fā)明的TCR也可以多價(jià)復(fù)合體的形式提供。本發(fā)明的多價(jià)TCR復(fù)合體包含兩 個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)本發(fā)明TCR相結(jié)合而形成的多聚物，如可以用ρ53的四聚結(jié)構(gòu)域來(lái) 產(chǎn)生四聚體，或多個(gè)本發(fā)明TCR與另一分子結(jié)合而形成的復(fù)合物。本發(fā)明的TCR復(fù)合物可 用于體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞特定抗原的細(xì)胞，也可用于產(chǎn)生具有此類(lèi)應(yīng)用的其他多價(jià) TCR復(fù)合物的中間體。
[0105] 本發(fā)明的TCR可以單獨(dú)使用，也可與偶聯(lián)物以共價(jià)或其他方式結(jié)合，優(yōu)選以共 價(jià)方式結(jié)合。所述偶聯(lián)物包括可檢測(cè)標(biāo)記物（為診斷目的，其中所述TCR用于檢測(cè)呈遞 RYLFPPLFM-HLA Α2402復(fù)合物的細(xì)胞的存在）、治療劑、ΡΚ(蛋白激酶）修飾部分或任何以 上這些物質(zhì)的組合結(jié)合或偶聯(lián)。
[0106] 用于診斷目的的可檢測(cè)標(biāo)記物包括但不限于：焚光或發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、 MRI (磁共振成像）或CT (電子計(jì)算機(jī)X射線斷層掃描技術(shù)）造影劑、或能夠產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn) 物的酶。
[0107] 可與本發(fā)明TCR結(jié)合或偶聯(lián)的治療劑包括但不限于：1.放射性核素（Koppe等， 2005，癌轉(zhuǎn)移評(píng)論（Cancer metastasis reviews) 24, 539) ;2·生物毒（Chaudhary 等， 1989,自然（Nature) 339, 394 ;Epel 等，2002,癌癥免疫學(xué)和免疫治療（Cancer Immunology and Immunotherapy) 51，565) ;3·細(xì)胞因子如 IL-2 等（Gillies 等，1992,美國(guó)國(guó)家科學(xué) 院院刊（PNAS)89,1428 ;Card 等，2004,癌癥免疫學(xué)和免疫治療（Cancer Immunology and Immunotherapy)53,345;Halin 等，2003,癌癥研究（Cancer Research)63,3202) ;4·抗體 Fc 片段（Mosquera 等，2005,免疫學(xué)雜志（The Journal Of Immunology) 174,4381) ;5·抗 體 scFv 片段（Zhu 等，1995,癌癥國(guó)際期刊（International Journal of Cancer)62, 319); 6.金納米顆粒 / 納米棒（Lapotko 等，2005,癌癥通信（Cancer letters) 239, 36 ;Huang 等， 2006,美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志（Journal of the American Chemical Society) 128,2115) ;7·病 毒顆粒（Peng 等，2004,基因治療（Gene therapy) 11，1234) ;8·脂質(zhì)體（Mamot 等，2005,癌 癥研究（Cancer research)65，11631) ;9.納米磁粒；10.前藥激活酶（例如，DT-心肌黃酶 (DTD)或聯(lián)苯基水解酶-樣蛋白質(zhì)（BPHL)) ;11.化療劑（例如，順鉑）或任何形式的納米 顆粒等。
[0108] 另外，本發(fā)明的TCR還可以是包含衍生自超過(guò)一種物種序列的雜合TCR。例如，有 研究顯示鼠科TCR在人T細(xì)胞中比人TCR能夠更有效地表達(dá)。因此，本發(fā)明TCR可包含人 可變域和鼠的恒定域。這一方法的缺陷是可能引發(fā)免疫應(yīng)答。因此，在其用于過(guò)繼性T細(xì) 胞治療時(shí)應(yīng)當(dāng)有調(diào)節(jié)方案來(lái)進(jìn)行免疫抑制，以允許表達(dá)鼠科的T細(xì)胞的植入。
[0109] 應(yīng)理解，本文中氨基酸名稱采用國(guó)際通用的單英文字母或三英文字母表示，氨基 酸名稱的單英文字母與三英文字母的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下：Ala(A)、Arg(R)、Asn(N)、Asp(D)、 Cys(C)、Gln(Q)、Glu(E)、Gly(G)、His(H)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Pro(P)、 Ser (S)、Thr (T)、Trp (W)、Tyr (Y)、Val (V)。
[0110] 核酸分子
[0111] 本發(fā)明的第二方面提供了編碼本發(fā)明第一方面TCR分子或其部分的核酸分子，所 述部分可以是一個(gè)或多個(gè)CDR，α和/或β鏈的可變域，以及α鏈和/或β鏈。
[0112] 編碼本發(fā)明第一方面TCR分子α鏈⑶R區(qū)的核苷酸序列如下：
[0113] a CDRl-aacagtgcttctcagtct (SEQ ID NO:16)
[0114] a CDR2_gtatactccagtggtaat (SEQ ID NO:17)
[0115] a CDR3-RtRRtRaaccattttataRattccRRRtatRcactcaac (SEQ ID NO:18)
[0116] 編碼本發(fā)明第一方面TCR分子β鏈⑶R區(qū)的核苷酸序列如下：
[0117] β CDRl-aagggtcatgataga (SEQ ID NO:19)
[0118] β CDR2_tcctttgatgtcaaagat (SEQ ID NO :20)
[0119] β CDR3-gccaccagtcccgacgcttctaatgaaaaactgttt (SEQ ID NO:21)
[0120] 因此，編碼本發(fā)明TCR α鏈的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18,和/或編碼本發(fā)明TCR β鏈的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序 列包括 SEQ ID N0:19、SEQ ID Ν0:20 和 SEQ ID Ν0:21。
[0121] 本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列可以是單鏈或雙鏈的，該核酸分子可以是RNA或 DNA，并且可以包含或不包含內(nèi)含子。優(yōu)選地，本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列不包含內(nèi)含子 但能夠編碼本發(fā)明多肽，例如編碼本發(fā)明TCRa鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列 包括SEQ ID N0:2和/或編碼本發(fā)明TCRi3鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括 SEQ ID N0:6?；蛘撸幋a本發(fā)明TCRa鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID N0:33和/或編碼本發(fā)明TCRi3鏈可變域的本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包括SEQ ID N0:35。更優(yōu)選地，本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列包含SEQ ID N0:4和/或SEQ ID N0:8。 或者，本發(fā)明核酸分子的核苷酸序列為SEQ ID N0:31。
[0122] 應(yīng)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并，不同的核苷酸序列可以編碼相同的多肽。因此，編 碼本發(fā)明TCR的核酸序列可以與本發(fā)明附圖中所示的核酸序列相同或是簡(jiǎn)并的變異體。以 本發(fā)明中的其中一個(gè)例子來(lái)說(shuō)明，"簡(jiǎn)并的變異體"是指編碼具有SEQ ID N0:1的蛋白序列， 但與SEQ ID N0:2的序列有差別的核酸序列。
[0123] 核苷酸序列可以是經(jīng)密碼子優(yōu)化的。不同的細(xì)胞在具體密碼子的利用上是不同 的，可以根據(jù)細(xì)胞的類(lèi)型，改變序列中的密碼子來(lái)增加表達(dá)量。哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及多種其他 生物的密碼子選擇表是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0124] 本發(fā)明的核酸分子全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂玫幌抻赑CR擴(kuò)增法、重組法或 人工合成的方法獲得。目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明TCR(或其片 段，或其衍生物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA 分子（或如載體）和細(xì)胞中。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0125] 載體
[0126] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的核酸分子的載體，包括表達(dá)載體，即能夠在體內(nèi)或體 外表達(dá)的構(gòu)建體。常用的載體包括細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。
[0127] 病毒遞送系統(tǒng)包括但不限于腺病毒載體、腺相關(guān)病毒（AAV)載體、皰疹病毒載體、 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體。
[0128] 優(yōu)選地，載體可以將本發(fā)明的核苷酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中，例如T細(xì)胞中，使得該細(xì)胞表 達(dá)PRAME抗原特異性的TCR。理想的情況下，該載體應(yīng)當(dāng)能夠在T細(xì)胞中持續(xù)高水平地表 達(dá)。
[0129] 細(xì)胞
[0130] 本發(fā)明還涉及用本發(fā)明的載體或編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。所述宿主 細(xì)胞中含有本發(fā)明的載體或染色體中整合有本發(fā)明的核酸分子。宿主細(xì)胞選自：原核細(xì)胞 和真核細(xì)胞，例如大腸桿菌、酵母細(xì)胞、CH0細(xì)胞等。
[0131] 另外，本發(fā)明還包括表達(dá)本發(fā)明的TCR的分離的細(xì)胞，特別是T細(xì)胞。該T細(xì)胞可 衍生自從受試者分離的T細(xì)胞，或者可以是從受試者中分離的混合細(xì)胞群，諸如外周血淋 巴細(xì)胞（PBL)群的一部分。如，該細(xì)胞可以分離自外周血單核細(xì)胞（PBMC)，可以是CD4 +輔 助T細(xì)胞或⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。該細(xì)胞可在⑶4 +輔助T細(xì)胞/⑶8 +細(xì)胞毒性T細(xì)胞的 混合群中。一般地，該細(xì)胞可以用抗體（如，抗-CD3或抗-CD28的抗體）活化，以便使它們 能夠更容易接受轉(zhuǎn)染，例如用包含編碼本發(fā)明TCR分子的核苷酸序列的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0132] 備選地，本發(fā)明的細(xì)胞還可以是或衍生自干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞（HSC)。將基因轉(zhuǎn) 移至HSC不會(huì)導(dǎo)致在細(xì)胞表面表達(dá)TCR，因?yàn)楦杉?xì)胞表面不表達(dá)CD3分子。然而，當(dāng)干細(xì)胞 分化為迀移至胸腺的淋巴前體（lymphoid precursor)時(shí)，CD3分子的表達(dá)將啟動(dòng)在胸腺細(xì) 胞的表面表達(dá)該引入的TCR分子。
[0133] 有許多方法適合于用編碼本發(fā)明TCR的DNA或RNA進(jìn)行T細(xì)胞轉(zhuǎn)染（如，Robbins 等.，（2008) J. Immunol. 180:6116-6131)。表達(dá)本發(fā)明TCR的T細(xì)胞可以用于過(guò)繼免疫治 療。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠知曉進(jìn)行過(guò)繼性治療的許多合適方法（如，Rosenberg等.，（2008) Nat Rev Cancer8(4) :299-308)。
[0134] PRAME抗原相關(guān)疾病
[0135] 本發(fā)明還涉及在受試者中治療和/或預(yù)防與PRAME相關(guān)疾病的方法，其包括 過(guò)繼性轉(zhuǎn)移PRAME特異性T細(xì)胞至該受試者的步驟。該P(yáng)RAME特異性T細(xì)胞可識(shí)別 RYLFPPLFM-HLA Α2402 復(fù)合物。
[0136] 本發(fā)明的PRAME特異性的Τ細(xì)胞可用于治療任何呈遞PRAME抗原短肽 RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物的PRAME相關(guān)疾病，如腫瘤。所述腫瘤包括但不限于黑色素 瘤、肺鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、頭頸部腫瘤、霍杰金氏淋巴瘤、肉瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞 瘤、白血?。òǖ幌抻?，急性淋巴細(xì)胞白血病，急性粒細(xì)胞白血?。⑽赴?、肺癌、食道 癌、膀胱癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等。
[0137] 治療方法
[0138] 可以通過(guò)分離患有與PRAME抗原相關(guān)疾病的病人或志愿者的T細(xì)胞，并將本發(fā)明 的TCR導(dǎo)入上述T細(xì)胞中，隨后將這些基因工程修飾的細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)來(lái)進(jìn)行治療。 因此，本發(fā)明提供了一種治療PRAME相關(guān)疾病的方法，包括將分離的表達(dá)本發(fā)明TCR的T細(xì) 胞，優(yōu)選地，該T細(xì)胞來(lái)源于病人本身，輸入到病人體內(nèi)。一般地，包括（1)分離病人的T細(xì) 胞，⑵用本發(fā)明核酸分子或能夠編碼本發(fā)明TCR分子的核酸分子體外轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞，⑶將 基因工程修飾的T細(xì)胞輸入到病人體內(nèi)。分離、轉(zhuǎn)染及回輸?shù)募?xì)胞的數(shù)量可以由醫(yī)師決定。
[0139] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0140] (1)本發(fā)明的TCR能夠與PRAME抗原短肽復(fù)合物RYLFPPLFM-HLA A2402結(jié)合，同時(shí) 轉(zhuǎn)導(dǎo)了本發(fā)明TCR的細(xì)胞能夠被特異性激活并且對(duì)靶細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷作用。
[0141] 下面的具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常 規(guī)條件，例如（Sambrook和Russell等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（Molecular Cloning-A Laboratory Manual)(第三版）（2001) CSHL出版社）中所述的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù) 按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明均可從市售渠道獲得。
[0142] 實(shí)施例1克隆PRAME抗原短肽特異性T細(xì)胞
[0143] 利用合成短肽RYLFPPLFM(SEQ ID N0. :9 ;北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）刺激來(lái) 自于基因型為HLA-A2402的健康志愿者的外周血淋巴細(xì)胞（PBL)。將RYLFPPLFM短肽與帶 有生物素標(biāo)記的HLA-A2402復(fù)性，制備pHLA單倍體。這些單倍體與用PE標(biāo)記的鏈霉親和 素（BD公司）組合成PE標(biāo)記的四聚體，分選該四聚體及抗-CD8-APC雙陽(yáng)性細(xì)胞。擴(kuò)增分 選的細(xì)胞，并按上述方法進(jìn)行二次分選，隨后用有限稀釋法進(jìn)行單克隆。單克隆細(xì)胞用四聚 體染色，篩選到的雙陽(yáng)性克隆如圖3所示。
[0144] 實(shí)施例2獲取PRAME抗原短肽特異性T細(xì)胞克隆的TCR基因與載體的構(gòu)建
[0145] 用Quick-RNA? MiniPrep (ΖΥΜ0 research)抽提實(shí)施例1中篩選到的抗原短肽 RYLFPPLFM特異性、HLA-A2402限制性的T細(xì)胞克隆的總RNA。cDNA的合成采用clontech 的SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒，采用的引物是設(shè)計(jì)在人類(lèi)TCR基因的C端保守區(qū)。將序 列克隆至T載體（TAKARA)上進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)注意，該序列為互補(bǔ)序列，不包含內(nèi)含子。經(jīng)測(cè) 序，該雙陽(yáng)性克隆表達(dá)的TCR的α鏈和β鏈序列結(jié)構(gòu)分別如圖1和圖2所示，圖la、圖lb、 圖lc、圖ld、圖le和圖If分別為T(mén)CRa鏈可變域氨基酸序列、TCRa鏈可變域核苷酸序列、 TCR a鏈氨基酸序列、TCR a鏈核苷酸序列、具有前導(dǎo)序列的TCR a鏈氨基酸序列以及具有 前導(dǎo)序列的TCRa鏈核苷酸序列；圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖2e和圖2f分別為T(mén)CRi3鏈 可變域氨基酸序列、TCRi3鏈可變域核苷酸序列、TCRi3鏈氨基酸序列、TCRi3鏈核苷酸序 列、具有前導(dǎo)序列的TCRi3鏈氨基酸序列以及具有前導(dǎo)序列的TCRi3鏈核苷酸序列。
[0146] 經(jīng)鑒定，α鏈包含具有以下氨基酸序列的⑶R:
[0147] a CDR1-NSASQS (SEQ ID NO:10)
[0148] a CDR2-VYSSGN (SEQ ID NO:11)
[0149] a CDR3-WNHFIDSGYALN (SEQ ID NO: 12)
[0150] β鏈包含具有以下氨基酸序列的⑶R:
[0151] β CDR1-KGHDR (SEQ ID NO:13)
[0152] β CDR2-SFDVKD (SEQ ID NO:14)
[0153] β CDR3-ATSPDASNEKLF (SEQ ID NO:15)
[0154] 通過(guò)重疊（overlap)PCR分別將TCRa鏈和β鏈的全長(zhǎng)基因克隆至慢病毒表 達(dá)載體pLenti (addgene)。具體為：用overlap PCR將TCRa鏈和TCR0鏈的全長(zhǎng)基因進(jìn) 行連接得到TCRa-2A_TCRi3片段。將慢病毒表達(dá)載體及TCRa-2A_TCRi3酶切連接得到 pLenti-TRA-2A-TRB-IRES-NGFR質(zhì)粒。作為對(duì)照用，同時(shí)也構(gòu)建表達(dá)eGFP的慢病毒載體 pLenti-eGFP。之后再用293T/17包裝假病毒。
[0155] 實(shí)施例3 PRAME抗原短肽特異性可溶TCR的表達(dá)、重折疊和純化
[0156] 為獲得可溶的TCR分子，本發(fā)明的TCR分子的a和β鏈可以分別只包含其可變 域及部分恒定域，并且a和β鏈的恒定域中分別引入了一個(gè)半胱氨酸殘基以形成人工鏈 間二硫鍵，引入半胱氨酸殘基的位置分別為T(mén)RAO01外顯子1的Thr48和TRBC2*01外顯子 1的Ser57 ;其a鏈的氨基酸序列與核苷酸序列分別如圖4a和圖4b所示，其β鏈的氨基 酸序列與核苷酸序列分別如圖5a和圖5b所示，引入的半胱氨酸殘基以加粗和加下劃線字 母表示。通過(guò)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（Molecular Cloning a Laboratory Manual)(第三 版，Sambrook和Russell)中描述的標(biāo)準(zhǔn)方法將上述TCRa和β鏈的目的基因序列經(jīng)合成 后分別插入到表達(dá)載體pET28a+(Novagene)，上下游的克隆位點(diǎn)分別是Ncol和Notl。插入 片段經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)無(wú)誤。
[0157] 將TCR α和β鏈的表達(dá)載體分別通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)細(xì)菌BL21 (DE3)， 細(xì)菌用LB培養(yǎng)液生長(zhǎng)，于0D6QQ= 0. 6時(shí)用終濃度0. 5mM IPTG誘導(dǎo)，TCR的α和β鏈表 達(dá)后形成的包涵體通過(guò)BugBuster Mix (Novagene)進(jìn)行提取，并且經(jīng)BugBuster溶液反 復(fù)多次洗滌，包涵體最后溶解于6M鹽酸胍，10mM二硫蘇糖醇（DTT)，10mM乙二胺四乙酸 (EDTA)，20mM Tris(pH 8. 1)中。
[0158] 溶解后的TCR α和β鏈以1 :1的質(zhì)量比快速混合于5M尿素，0. 4M精氨酸，20mM Tris(pH 8. 1)，3. 7mM cystamine，6· 6πιΜβ-mercapoethylamineGO )中，終濃度為 60mg/ mL?；旌虾髮⑷芤褐糜?0倍體積的去離子水中透析（4°C )，12小時(shí)后將去離子水換成緩沖 液（20mM Tris，pH 8. 0)繼續(xù)于4°C透析12小時(shí)。透析完成后的溶液經(jīng)0. 45 μ Μ的濾膜過(guò) 濾后，通過(guò)陰離子交換柱（HiTrap Q HP，5ml，GE Healthcare)純化。洗脫峰含有復(fù)性成功的 α和β二聚體的TCR通過(guò)SDS-PAGE膠確認(rèn)。TCR隨后通過(guò)凝膠過(guò)濾層析（HiPrep 16/60， Sephacryl S_100HR，GE Healthcare)進(jìn)一步純化。純化后的 TCR 純度經(jīng)過(guò) SDS-PAGE 測(cè)定 大于90%，濃度由BCA法確定。本發(fā)明得到的可溶性TCR的SDS-PAGE膠圖如圖6所示。
[0159] 實(shí)施例4 PRAME抗原短肽特異性的可溶性單鏈TCR的產(chǎn)生
[0160] 根據(jù)專利文獻(xiàn)W02014/206304中所述，利用定點(diǎn)突變的方法將實(shí)施例2中TCRa 與β鏈的可變域構(gòu)建成了一個(gè)以柔性短肽（linker)連接的穩(wěn)定的可溶性單鏈TCR分子。 該單鏈TCR分子的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖7a和圖7b所示。其a鏈可變域的 氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖8a和圖8b所示；其β鏈可變域的氨基酸序列及核苷酸 序列分別如圖9a和圖9b所示；其linker序列的氨基酸序列及核苷酸序列分別如圖10a和 圖10b所示。
[0161] 將目的基因經(jīng)Nco I和Not I雙酶切，與經(jīng)過(guò)Nco I和Not I雙酶切的pET28a載 體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5 α，涂布含卡那霉素的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑 取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR篩選，對(duì)陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序，確定序列正確后抽提重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 E. coli BL21(DE3),用于表達(dá)。
[0162] 實(shí)施例5 PRAME抗原短肽特異性的可溶性單鏈TCR的表達(dá)、復(fù)性和純化
[0163] 將實(shí)施例4中制備的含有重組質(zhì)粒pET28a_模板鏈的BL21 (DE 3)菌落全部接 種于含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8,加入IPTG至終濃度為 0.5mM，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h。5000rpm離心15min收獲細(xì)胞沉淀物，用Bugbuster Master Mix(Merck)裂解細(xì)胞沉淀物，6000rpm離心15min回收包涵體，再用Bugbuster(Merck)進(jìn) 行洗滌以除去細(xì)胞碎片和膜組分，6000rpm離心15min，收集包涵體。將包涵體溶解在緩沖 液（20mM Tris-HCl pH 8.0,8M尿素）中，高速離心去除不溶物，上清液用BCA法定量后進(jìn) 行分裝，于_80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0164] 向5mg溶解的單鏈TCR包涵體蛋白中，加入2. 5mL緩沖液（6M Gua-HCl，50mM Tris-HCl pH 8.1，lOOmM NaCl，10mM EDTA)，再加入 DTT 至終濃度為 10mM，37°C處理 30min。 用注射器向125mL復(fù)性緩沖液（lOOmM Tris-HClpH 8. 1，0. 4M L-精氨酸，5M尿素，2mM ED ΤΑ, 6· 5πιΜβ -mercapthoethylamine, 1. 87mM Cystamine)中滴加上述處理后的單鏈TCR，4°C 攪拌l〇min，然后將復(fù)性液裝入截留量為4kDa的纖維素膜透析袋，透析袋置于1L預(yù)冷的 水中，4°C緩慢攪拌過(guò)夜。17小時(shí)后，將透析液換成1L預(yù)冷的緩沖液（20mM Tris-HCl pH 8. 0)，4°C繼續(xù)透析8h，然后將透析液換成相同的新鮮緩沖液繼續(xù)透析過(guò)夜。17小時(shí)后，樣 品經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，真空脫氣后通過(guò)陰離子交換柱（HiTrap Q HP, GE Healthcare)，用 20mM Tris-HCl pH 8.0配制的0-1M NaCl線性梯度洗脫液純化蛋白，收集的洗脫組分進(jìn)行 SDS-PAGE分析，包含單鏈TCR的組分濃縮后進(jìn)一步用凝膠過(guò)濾柱（Superdex 75 10/300，GE Healthcare)進(jìn)行純化，目標(biāo)組分也進(jìn)行SDS-PAGE分析。
[0165] 用于BIAcore分析的洗脫組分進(jìn)一步采用凝膠過(guò)濾法測(cè)試其純度。條件為：色譜 柱 Agilent Bio SEC-3(300A，Φ7. 8X300mm)，流動(dòng)相為 150mM 磷酸鹽緩沖液，流速 0. 5mL/ min，柱溫25°C，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214nm〇
[0166] 本發(fā)明獲得的可溶性單鏈TCR的SDS-PAGE膠圖如圖11所示。
[0167] 實(shí)施例6結(jié)合表征
[0168] BIAcore 分析
[0169] 本實(shí)施例證明了可溶性的本發(fā)明TCR分子能夠與RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物特 異性結(jié)合。
[0170] 使用BIAcore T200實(shí)時(shí)分析系統(tǒng)檢測(cè)實(shí)施例3和實(shí)施例5中得到的TCR分子與 RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物的結(jié)合活性。將抗鏈霉親和素的抗體（GenScript)加入偶聯(lián) 緩沖液（lOmM醋酸鈉緩沖液，pH 4. 77)，然后將抗體流過(guò)預(yù)先用EDC和NHS活化過(guò)的CM5芯 片，使抗體固定在芯片表面，最后用乙醇胺的鹽酸溶液封閉未反應(yīng)的活化表面，完成偶聯(lián)過(guò) 程，偶聯(lián)水平約為15,000RU。
[0171] 使低濃度的鏈霉親和素流過(guò)已包被抗體的芯片表面，然后將RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物流過(guò)檢測(cè)通道，另一通道作為參比通道，再將0. 05mM的生物素以10yL/min的 流速流過(guò)芯片2min，封閉鏈霉親和素剩余的結(jié)合位點(diǎn)。
[0172] 上述RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物的制備過(guò)程如下：
[0173] a.純化
[0174] 收集100ml誘導(dǎo)表達(dá)重鏈或輕鏈的E. coli菌液，于4°C8000g離心10min后用10ml PBS 洗滌菌體一次，之后用 5ml BugBuster Master Mix Extraction Reagents (Merck)劇烈 震蕩重懸菌體，并于室溫旋轉(zhuǎn)孵育20min，之后于4°C，6000g離心15min，棄去上清，收集包 涵體。
[0175] 將上述包涵體重懸于5ml BugBuster Master Mix中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育5min ;加 30ml稀釋10倍的BugBuster，混勾，4°C 6000g離心15min ;棄去上清，加30ml稀釋10倍的 BugBuster 重懸包涵體，混勾，4°C 6000g 離心 15min，重復(fù)兩次，加 30ml 20mM Tris-HCl pH 8. 0重懸包涵體，混勻，4°C 6000g離心15min，最后用20mM Tris-HCl 8M尿素溶解包涵體， SDS-PAGE檢測(cè)包涵體純度，BCA試劑盒測(cè)濃度。
[0176] b.復(fù)性
[0177] 將合成的短肽RYLFPPLFM(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）溶解于DMS0至20mg/ ml的濃度。輕鏈和重鏈的包涵體用8M尿素、20mM Tris pH 8. 0、10mM DTT來(lái)溶解，復(fù)性前 加入3M鹽酸胍、10mM醋酸鈉、10mM EDTA進(jìn)一步變性。將RYLFPPLFM肽以25mg/L (終濃度） 加入復(fù)性緩沖液（〇. 4M L-精氨酸、100mM Tris pH 8. 3、2mM EDTA、0. 5mM氧化性谷胱甘肽、 5mM還原型谷胱甘肽、0. 2mM PMSF，冷卻至4°C )，然后依次加入20mg/L的輕鏈和90mg/L的 重鏈（終濃度，重鏈分三次加入，8h/次），復(fù)性在4°C進(jìn)行至少3天至完成，SDS-PAGE檢測(cè) 能否復(fù)性成功。
[0178] c.復(fù)性后純化
[0179] 用10體積的20mM Tris pH 8. 0作透析來(lái)更換復(fù)性緩沖液，至少更換緩沖液兩次 來(lái)充分降低溶液的離子強(qiáng)度。透析后用〇. 45 μ m醋酸纖維素濾膜過(guò)濾蛋白質(zhì)溶液，然后加 載到HiTrap Q HP(GE通用電氣公司）陰離子交換柱上（5ml床體積）。利用Akta純化儀 (GE通用電氣公司），20mM Tris pH 8. 0配制的0-400mM NaCl線性梯度液洗脫蛋白，pMHC 約在250mM NaCl處洗脫，收集諸峰組分，SDS-PAGE檢測(cè)純度。
[0180] d.生物素化
[0181] 用Mi 11 ipore超濾管將純化的pMHC分子濃縮，同時(shí)將緩沖液置換為20mM Tris pH 8.0,然后加入生物素化試劑 0.05M Bicine pH 8.3、10mM ATP、10mM Mg0Ac、50yM D-Biotin、100 μ g/ml BirA酶（GST-BirA)，室溫孵育混合物過(guò)夜，SDS-PAGE檢測(cè)生物素化 是否完全。
[0182] e.純化生物素化后的復(fù)合物
[0183] 用Millipore超濾管將生物素化標(biāo)記后的pMHC分子濃縮至1ml，采用凝膠過(guò)濾 層析純化生物素化的pMHC，利用Akta純化儀（GE通用電氣公司），用過(guò)濾過(guò)的PBS預(yù)平衡 HiPr^)? 16/60S200HR柱（GE通用電氣公司），加載lml濃縮過(guò)的生物素化pMHC分子，然后 用PBS以lml/min流速洗脫。生物素化的pMHC分子在約55ml時(shí)作為單峰洗脫出現(xiàn)。合并 含有蛋白質(zhì)的組分，用Millipore超濾管濃縮，BCA法（Thermo)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，加入蛋白 酶抑制劑cocktail (Roche)將生物素化的pMHC分子分裝保存在-80°C。
[0184] 利用BIAcore Evaluation軟件計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)，得到本發(fā)明可溶性的TCR分子以 及本發(fā)明構(gòu)建的可溶性單鏈TCR分子與RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物結(jié)合的動(dòng)力學(xué)圖譜如 圖12所示。圖譜顯示，本發(fā)明得到的可溶性TCR分子以及可溶性單鏈TCR分子都能夠與 RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物結(jié)合。同時(shí)，還利用上述方法檢測(cè)了本發(fā)明可溶性的TCR分子 與其他幾種無(wú)關(guān)抗原短肽與HLA復(fù)合物的結(jié)合活性，結(jié)果顯示本發(fā)明TCR分子與其他無(wú)關(guān) 抗原均無(wú)結(jié)合。
[0185] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種T細(xì)胞受體（TCR)，其特征在于，所述TCR能夠與RYLFPPLFM-HLA A2402復(fù)合物 結(jié)合；優(yōu)選地，所述的TCR包含TCR α鏈可變域和TCR β鏈可變域，其特征在于，所述TCR α 鏈可變域的CDR3的氨基酸序列為VVNHFIDSGYALN(SEQ ID Ν0:12);和/或所述TCR0鏈可 變域的CDR3的氨基酸序列為ATSPDASNEKLF(SEQ ID Ν0:15); 更優(yōu)選地，所述TCR α鏈可變域的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)為： aCDRl-NSASQS (SEQ ID NO: 10) aCDR2-VYSSGN (SEQ ID NO: 11) a CDR3-VVNHFIDSGYALN (SEQ ID NO:12);和 / 或 所述TCR β鏈可變域的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)為： eCDRl-KGHDR (SEQ ID NO: 13) 0CDR2-SFDVKD (SEQ ID NO: 14) β CDR3-ATSPDASNEKLF (SEQ ID NO:15)。2. 如權(quán)利要求1所述的TCR，其特征在于，其包含TCR a鏈可變域和TCR β鏈可變域， 所述TCR a鏈可變域?yàn)榕cSEQ ID NO: 1具有至少90%序列相同性的氨基酸序列；和/或所 述TCRi3鏈可變域?yàn)榕cSEQ ID N0:5具有至少90%序列相同性的氨基酸序列。3. 如權(quán)利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR的a鏈和/或β鏈的C-或N-末 端結(jié)合有偶聯(lián)物；優(yōu)選地，與所述Τ細(xì)胞受體結(jié)合的偶聯(lián)物為可檢測(cè)標(biāo)記物、治療劑、ΡΚ修 飾部分或任何這些物質(zhì)的組合；優(yōu)選地，所述治療劑為抗-CD3抗體。4. 一種多價(jià)TCR復(fù)合物，其特征在于，包含至少兩個(gè)TCR分子，并且其中的至少一個(gè) TCR分子為上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的TCR。5. -種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含編碼上述任一權(quán)利要求所述的TCR 分子的核酸序列或其互補(bǔ)序列； 優(yōu)選地，所述的核酸分子包含編碼TCRa鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID Ν0:2或SEQ ID NO:33 ;和 / 或 所述的核酸分子包含編碼TCRf3鏈可變域的核苷酸序列SEQ ID NO :6或SEQ ID N0:35〇6. -種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求25-28中任一所述的核酸分子；優(yōu) 選地，所述的載體為病毒載體；更優(yōu)選地，所述的載體為慢病毒載體。7. -種分離的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞中含有權(quán)利要求26中所述的載 體或染色體中整合有外源的權(quán)利要求25-28中任一所述的核酸分子。8. -種細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)權(quán)利要求25-28中任一所述的核酸分子或權(quán) 利要求29中所述載體；優(yōu)選地，所述細(xì)胞為T(mén)細(xì)胞或干細(xì)胞。9. 一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有藥學(xué)上可接受的載體以及權(quán)利要求 1-23中任一項(xiàng)所述的TCR、權(quán)利要求24中所述的TCR復(fù)合物、權(quán)利要求25-28中任一所述 的核酸分子、或權(quán)利要求28中所述的細(xì)胞。10. 權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞受體、或權(quán)利要求24中所述的TCR復(fù)合物 或權(quán)利要求31中所述的細(xì)胞的用途，其特征在于，用于制備治療腫瘤或自身免疫疾病的藥 物。
【文檔編號(hào)】C12N15/867GK106084036SQ201510741810
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2015年11月2日
【發(fā)明人】李懿, 區(qū)裕升, 吳萬(wàn)里, 林燕梅, 李思韻
【申請(qǐng)人】廣州市香雪制藥股份有限公司