吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了式(Ⅰ)所示的吡唑并[3,4?d]嘧啶衍生物。本發(fā)明提供的化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，可以用于預(yù)防和/或治療腫瘤相關(guān)疾病，尤其是肺癌，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】
吡唑并[3,4-d]嘧啶衍生物
技術(shù)領(lǐng)域
[00011本發(fā)明涉及吡唑并[3，4-d]啼啶衍生物。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，肺癌是發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快，對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤 之一。
[0003] 然而，盡管市場(chǎng)上已經(jīng)存在多種治療肺癌的藥物，但是都存在著各種缺陷，例如生 物利用度不高、專屬性不強(qiáng)、毒副作用大等問題。而這些缺陷，往往是由于化合物本身的結(jié) 構(gòu)特點(diǎn)及其作用靶標(biāo)所帶來的，難以在進(jìn)一步的研究開發(fā)中克服。
[0004] 因此，本領(lǐng)域人員都希望合成出結(jié)構(gòu)各異的多種化合物以及探索到新的作用靶標(biāo) 以克服前述缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種全新結(jié)構(gòu)的吡唑并[3,4_d]嘧啶衍生物。
[0006] 本式(I)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其溶劑合物：
[0007]
[0008] 其中，
[0009 ]辦表示-NH2、_NH( &-C4 烷基)或者 _N( &-C4 烷基)2;
[0010] R2表示氫或CrC6烷基；
[0011] R3表示氫或CrC6烷基；
[0012] -〇R4表示在苯環(huán)上任意一個(gè)位置的取代基，R4表示-(R 5〇)n-R6-X;
[0013] η表示1~10的正整數(shù)；
[0014] 也和1?6分別獨(dú)立地選自亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基、亞庚基、 亞辛基、亞壬基或亞癸基；
[0015] X表示鹵原子、-OH或-0S02-R?，R?表示苯基或被1個(gè)或多個(gè)&-〇5烷基取代的苯基。
[0016] 進(jìn)一步地，辦為-順2。
[0017] 進(jìn)一步地，R2為氫。
[0018] 進(jìn)一步地，烷基，優(yōu)選正丁基或叔丁基。
[0019] 進(jìn)一步地，辦為-順2，且吣為氫，且R3表示&-C6烷基，優(yōu)選正丁基或叔丁基。
[0020] 進(jìn)一步地，η為3、4或5。
[0021] 進(jìn)一步地，取和辦均為亞乙基。
[0022] 進(jìn)一步地，X為對(duì)甲苯磺?；?。
[0023] 進(jìn)一步地，所述化合物為如下化合物之一：
[0024]
[0025] Ts表示對(duì)甲苯磺?；?。
[0026] 本發(fā)明還提供了前述的化合物、或其溶劑合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗 腫瘤藥物中的用途。
[0027] 進(jìn)一步地，所述藥物是治療肺癌的藥物。
[0028] 進(jìn)一步地，所述肺癌是非小細(xì)胞肺癌。
[0029] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它是前述的化合物、或其溶劑合物、或其藥學(xué)上 可接受的鹽為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。
[0030] 本發(fā)明中，所述Ci-C4的烷基是指(^、(：2、(：3、〇4的烷基，即具有1~4個(gè)碳原子的直鏈 或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基等等。類似的， 所述&~〇5的烷基是指&、(： 2、(：3、〇4、(：5、(：6的烷基，即具有1~6個(gè)碳原子的直鏈或支鏈的烷 基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基等等。
[0031] 本發(fā)明中，"治療"也包括復(fù)發(fā)性(relapse)預(yù)防或階段性(phase)預(yù)防，以及急性 或慢性體征、癥狀和/或功能失常的治療。治療可以是對(duì)癥治療，例如抑制癥狀。它可以在短 期內(nèi)實(shí)現(xiàn)，在中期內(nèi)調(diào)整，或者可以說是長(zhǎng)期治療，例如在維持療法里面。
[0032] 所述"預(yù)防"包括延遲和/或阻止病癥、疾病或病況和/或其伴發(fā)癥狀的發(fā)作；防止 對(duì)象染上病癥、疾病或病況;或降低對(duì)象染上病癥、疾病或病況的風(fēng)險(xiǎn)的方法。本發(fā)明中， "藥學(xué)上可接受的"是指某載體、運(yùn)載物、稀釋劑、輔料，和/或所形成的鹽通常在化學(xué)上或物 理上與構(gòu)成某藥物劑型的其它成分相兼容，并在生理上與受體相兼容。
[0033] 本發(fā)明中，"鹽"是將化合物或其立體異構(gòu)體，與無機(jī)和/或有機(jī)酸和堿形成的酸式 和/或堿式鹽，也包括兩性離子鹽（內(nèi)鹽），還包括季銨鹽，例如烷基銨鹽。這些鹽可以是在化 合物的最后分離和純化中直接得到。也可以是通過將化合物，或其立體異構(gòu)體，與一定數(shù)量 的酸或堿適當(dāng)（例如等當(dāng)量)進(jìn)行混合而得到。這些鹽可能在溶液中形成沉淀而以過濾方法 收集，或在溶劑蒸發(fā)后回收而得到，或在水介質(zhì)中反應(yīng)后冷凍干燥制得。本發(fā)明中所述鹽可 以是化合物的鹽酸鹽、硫酸鹽、枸櫞酸鹽、苯磺酸鹽、氫溴酸鹽、氫氟酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、 丙酸鹽、丁二酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽或三氟乙酸 鹽。
[0034] 試驗(yàn)結(jié)果顯示，本發(fā)明的化合物對(duì)肺癌細(xì)胞株A549和H1299具有明顯的抑制作用， 具有廣闊的市場(chǎng)前景。
[0035] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0036] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0037]下述附圖中，編號(hào)hx-03-2對(duì)應(yīng)本發(fā)明化合物2,編號(hào)hx-03-3為對(duì)應(yīng)本發(fā)明化合物 4，編號(hào)hx-03-l對(duì)應(yīng)本發(fā)明為化合物5，pp 1為陽性對(duì)照藥。
[0038] 圖 1:在不同時(shí)間（4h，24h，48h，72h)中，HX03-1，HX03-2，HX03-3，PP1 對(duì) A549 在不同 高濃度（50um，80um，100um)的抑制率。
[0039] 圖 2: HX03-1，HX03-2，HX03-3，PP1 對(duì)A549在不同高濃度（50um，80um，lOOum)、在不 同時(shí)間（4h，24h，48h，72h)的抑制率。
[0040] 圖 3:在不同時(shí)間（處，2411，4811，7211)中，^03-1，^03-2，^03-3，？？1對(duì)厶549在不同 低濃度（1 〇um，25um，40um)的抑制率。
[0041 ]圖 4:!?03-1，^03-2，^03-3，？？1對(duì)厶549在不同低濃度（1011111，2511111，4011111)、在不同 時(shí)間（4h，24h，48h，7 2h)的抑制率。
[0042] 圖 5: HX03-1 對(duì)A549在不同高濃度（1 Oum，25um，40um，50um，80um，lOOum)、在不同時(shí) 間（4h，24h，48h，7 2h)的抑制率。
[0043] 圖6: HX03-2對(duì)A549在不同高濃度（1 Oum，25um，40um，50um，80um，lOOum)、在不同時(shí) 間（4h，24h，48h，7 2h)的抑制率。
[0044] 圖 7: HX03-3對(duì)A549在不同高濃度（1 Oum，25um，40um，50um，80um，lOOum)、在不同時(shí) 間（4h，24h，48h，7 2h)的抑制率。
[0045] 圖8 :PP1 對(duì)A549在不同高濃度（10um，25um，40um，50um，80um，lOOum)、在不同時(shí)間 (處，2411，4811，7211)的抑制率。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 關(guān)鍵中間體產(chǎn)物可通過自制得到，其余所有參與合成的試劑在商業(yè)中均可從國(guó) 藥、長(zhǎng)征公司購買得到。
[0047] 實(shí)施例1本發(fā)明關(guān)鍵中間體的制備
[0048] (1)制備5-氨基-1-叔丁基-1氫-吡唑-4-氰基
[0049]
[0050] 在叔丁基肼鹽酸鹽（8.678,69.61111]1〇1)中加入三乙胺（9.71]11^，69.61111]1〇1)后，加入無 水乙醇（460mL)在室溫下攪拌溶解后，分批少量加入乙氧基亞甲基丙二腈（8.5g， 69.6mmol)。將溶液加熱回流3個(gè)小時(shí)后，冷卻，蒸發(fā)溶劑得到橙色固體。用乙酸乙酯（0.5L) 和水(0.25L)萃取，加入硫酸鎂干燥后，將有機(jī)層蒸發(fā)溶劑得到橙黃色固體。繼續(xù)將所得固 體用含10%乙酸乙酯的環(huán)己烷溶液洗滌抽慮得到晶狀固體5-氨基-1-叔丁基1氫-吡唑-4-氰基9.54g(產(chǎn)率為83%)。
[0051] 4 MMR(400MHz，DMS0-d6):S7.45(s，lH)，6.29(br sJHhI.SUsjHhHRMSCCI) calcd for C8H12N4(M)164.1062,found 164.1080.
[0052] (2)制備1 -叔丁基-1氫-吡唑[3，4-d ]嘧啶-4-氨基
[0053]
[0054] 在5-氨基-1-叔丁基1氫-吡唑-4-氰基(8，1. lg，1. lmmol)中加入甲酰胺（15mL)，加 熱回流6個(gè)小時(shí)?；旌衔镉靡宜嵋阴?3x 30mL)提取，得到的有機(jī)層用硫酸鎂干燥，過濾后減 壓蒸發(fā)溶劑得到褐色固體(〇. 97g，0.97mmol)(產(chǎn)率為77% )。
[0055] 4 NMR(200MHz，CDC13):S8.31(s，lH)，6.33(b，2H)，4.40(t，J=7.2Hz，2H)，1.87 (m,2H),1.31(m,2H),0.92(t,J=7.3Hz,3H)；HR-MS(ESI+)：Calc.for[C9H13N5]:192.1205 [M+H]+；Found 192.1251[M+H]+〇
[0056] (3)制備3-溴-卜叔丁基-丨氫-吡唑[3,4-d]嘧啶- 4-氨基
[0057]
[0058] 在1-叔丁基-1氫-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-氨基(0.97g，5. lmmol)中加入25mL水后，再 加入溴(〇.52mL，10.2mmol)，室溫下攪拌lh，然后在100°C加熱2h。得到固體用乙酸乙酯萃取 (3x 25mL)，在用5%硫酸氫鈉(25mL)和氯化鈉溶液(25mL)分別洗滌。然后有機(jī)層用硫酸鎂 干燥，過濾和濃縮，通過減壓蒸發(fā)溶劑得到桃紅色固體1.2g(產(chǎn)率為84% )。
[0059] 4 MMR(200MHz，CDC13):S8.28(s，lH)，6.42(s，2H)，1.75(s，9H);HR-MS(ESI+): Calc.for[C9H12BrN5]:270.0310[M+H]+；Found 270.0388[M+H]+〇
[0060] (4)制備4-(4-氨基-卜叔丁基-丨氫-吡唑[3,4- d]嘧啶-3-)苯酚
[0061]
[0062 ] 將4- (4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜戊硼烷-2-基)苯酚(660mg，3 · Ommo 1)加入到 3-溴-1-叔丁基-1氫-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-氨基（150mg，0.56mmol)的1,4-二氧乙烷/水(5: 1,
[0063] 25mL: 5mL)溶液中后，繼續(xù)加入碳酸鉀（41 · 4mg，3 · Ommol)和pdcl2dppf (4mg， 0.05mmol)。然后在油浴90°C中加熱2小時(shí)。加入水和乙酸乙酯萃取混合物，有機(jī)層用無水 硫酸鎂干燥并減壓蒸發(fā)得到白色固體l〇〇mg(產(chǎn)率為75%)。
[0064] 咕 NMR(600MHz，DMS0-6d)δ9·83(s，1H，HOAr)，8·28(s，1H，CH)，6·97-7·83(m，4H， Ar),1.80(m,9H,t-Bu)；HR-MS(ESI+)：Calc.for[C9H12BrN5]:284.1467[M+H]+；Found 284.1513[M+H]+〇
[0065] (5)制備1-正丁基-3-碘-1氫-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-氨基
[0066]
[0067]稱取3-碘-1 氫-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-氨基（28,0.0077111〇1)和碳酸鉀（4.28， 0.03lOmol)，加入DMF(50mL)溶解后加熱到90°C回流后，正丁基碘(2mL)用分液漏斗滴加到 溶液中。反應(yīng)3小時(shí)后，蒸發(fā)溶劑，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥后減壓蒸發(fā)， 并用柱層析分離純化得到白色固體1.86g(產(chǎn)率為77%)。
[0068] 4 NMR(200MHz，CDC13):S8.31(s，lH)，6.33(b，2H)，4.40(t，J=7.2Hz，2H)，1.87 (m,2H),1.31(m,2H),0.92(t,J=7.3Hz,3H)；HR-MS(ESI+)：Calc.for[C9H12IN5]:318.0171 [M+H]+；Found 318.0213[M+H]+〇
[0069] (6)制備4-(4-氨基-卜正丁基-丨氫-吡唑[3, 4-d]嘧啶-3-)苯酚
[0070]
[0071 ] 將4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜戊硼烷-2-基)苯酚(660mg，3 · Ommol)加入到 3-碘-1-叔丁基-1氫-吡唑[3，4-d]嘧啶-4-氨基（180mg，0 · 56mmol)的1，4-二氧乙烷/水(5: 1，25mL: 5mL)溶液中后，繼續(xù)加入碳酸鉀（41 · 4mg，3 .Ommol)和pdcl2dppf (4mg，0 · 05mmol)。 然后在油浴90°C中加熱2小時(shí)。加入水和乙酸乙酯萃取混合物，有機(jī)層用無水硫酸鎂干燥并 減壓蒸發(fā)得到白色固體123mg(產(chǎn)率為77% )。
[0072] 4 NMR(600MHz，DMS0-6d):δ9·75(s，1H，HOAr)，8·20(s，1H，CH)，6·89-7·46(m，4H， Ar-H)，4.28(t，2H，CH2)，1.78(m，2H，J = 6.0Hz，CH2)，1.22(m，2H，J = 6.0Hz，CH2)，0.86(t， 3H,J=6.OHz,CH3)；HR-MS(ESI+)：Calc.for[C9H12BrN5]:284.1467[M+H]+；Found 284.1513[M+H]+〇
[0073] 實(shí)施例2制備2-(2-(2-(2-(4-(4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-3-)苯氧 基）乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙基4-甲基苯磺酸(化合物1)
[0074]
[0075] 四甘醇雙(對(duì)甲苯鹽酸鹽）（16411^，3.46111111〇1)，4-(4-氨基-1-叔丁基-1氫-吡唑[3， 4_d]啼啶_3_)苯酸（100mg，3·46mmol)，和無水碳酸鐘（100mg，3·46mol)于50mL苯溶液中回 流加熱4h，lN HC1的中和后，將反應(yīng)混合物用二氯甲烷萃取。然后將溶液減壓干燥，得到固 體后進(jìn)行柱色譜分離得到棕黃色糖漿狀產(chǎn)物160mg(產(chǎn)率為76% )。
[0076] 咕匪1?(60冊(cè)!^，0150-(16):38.23(8，1!1，〇1)，7.09-7.79(4!1，111，&仰111-!1)，3.46-4.14(m，16H，CH2-CH2)，2.40(s，3H，CH3)，1.74(S，9H，t-bu);HR-MS(ESI+):Calc.for [C30H39N507S]:614.2604[M+H]+;Found 614.2646[M+H]+，634.2469[M+Na]+，652.2216[M+ K+] 〇
[0077] 實(shí)施例3制備2-(2-(2-(2-(4-(4-氨基-1-正丁基-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-3-)苯氧 基）乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙基4-甲基苯磺酸(化合物2)
[0078]
[0079] 四甘醇雙(對(duì)甲苯鹽酸鹽）（16411^，3.46111111〇1)，4-(4-氨基-1-正丁基-1氫-吡唑[3， 4_d]啼啶_3_)苯酸（100mg，3·46mmol)，和無水碳酸鐘（100mg，3·46mol)于50mL苯溶液中回 流加熱4h，lN HC1的中和后，將反應(yīng)混合物用二氯甲烷萃取。然后將溶液減壓干燥，得到固 體后進(jìn)行柱色譜分離得到棕黃色糖漿狀產(chǎn)物158mg(產(chǎn)率為73% )。
[0080]咕 NMR(600MHz，DMS0-d6):S8.239(s，lH，CH)，7.09-7.79(4H，m，arom-H)，4.32(t， 2H，J=6Hz，CH2)，3.44-4.16(m，16H，CH2-CH2)，2.91(s，3H，CH3)，2.40(t，3H，CH3)，2.05-2.65(m,4H,CH2),0.88(t,2H,CH2)〇HR-MS(ESI+)：Calc.for[C30H39N507S]:614.2604[M+H] +；Found 614.2762[M+H]+〇
[0081 ] 實(shí)施例4制備2-(2-(2-(2-(4-(4-氨基-1-正丁基-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-3-)苯氧 基）乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙醇(化合物3)
[0082]
[0083] 2-(2-(2-(2-羥基乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙基4-甲基苯磺酸（116mg，3.46mmol)， 4-(4-氨基-1-正丁基-1氫-吡唑[3,4_(1]啼啶-3-)苯酸（10〇11^，3.461]1111〇1)，和無水碳酸鉀 (lOOmg，3.46mmo 1)于50mL苯溶液中回流加熱4h，IN HC1的中和后，將反應(yīng)混合物用二氯甲 烷萃取。然后將溶液減壓蒸發(fā)干燥，得到固體后進(jìn)行柱色譜分離得到棕黃色糖漿狀產(chǎn)物 130mg(產(chǎn)率為 80%)。
[0084] 實(shí)施例5制備1-正丁基-3-(4-(2-(2-(2-(2-氟乙氧）乙氧基）乙氧基）乙氧基）苯 基)-1H-吡唑[3,4-d]嘧啶-4-氨基(化合物4)
[0085；
[0086]在20mL of干燥的THF中加入2-(2-(2-(2-(4-(4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑[3，4-d] 嘧啶-3-)苯氧基）乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙基4-甲基苯磺酸(61.311^，0.1111111〇1)，然后加入 無水TBAF(1.0mL，lM in THF).反應(yīng)混合物加熱回流3h。反應(yīng)完后蒸發(fā)溶劑，并用二氯甲烷 萃取，減壓蒸發(fā)溶劑后進(jìn)行柱色譜分離純化得到48mg(產(chǎn)率為65 % )。
[0087] 4 MMR(600MHz，DMS0-d6):δ8·20(s，1H，CH)，7·07-7·55(m，4H，Ar-H)，3·19-4·53 (m，16H，CH2)，1.72(s，9H，t-Bu) ;HR-MS(ESI+):Calc.for[C23H32FN504]:462.2438[M+H]+; Found 462.2485[M+H]+
[0088] 實(shí)施例6制備2-(2-(2-(2-(4-(4-氨基-1-叔丁基-1H-吡唑[3，4-d]嘧啶-3-)苯氧 基）乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙醇(化合物5)
[0089]
[0090] 2-(2-(2-(2-羥基乙氧基）乙氧基）乙氧基）乙基4-甲基苯磺酸（116mg，3.46mmol)， 4-(4-氨基-1-叔丁基-1氫-吡唑[3,4_d]啼啶-3-)苯?K100 mg，3.46mmol)，和無水碳酸鉀 (lOOmg，3.46mmo 1)于50mL苯溶液中回流加熱4h，IN HC1的中和后，將反應(yīng)混合物用二氯甲 烷萃取。然后將溶液減壓蒸發(fā)干燥，得到固體后進(jìn)行柱色譜分離得到棕黃色糖漿狀產(chǎn)物 132mg(產(chǎn)率為 81%)。
[0091] 咕 NMR(600MHz，DMS0-d6):S8.22(s，lH，CH)，7.10-7.57(m，4H，Ar-H)，4.58(t，lH， J=6.0Hz，0H)，3.41-4.17(m，16H，CH2)，5.76(s，2H，NH2)，1.74(s，9H，t-Bu) ;HR-MS(ESI+): Calc·for[C23H33N505]:460·2515[M+H] + ;Found460·2556[M+H] +，482·2379[M+Na] +。
[0092] 實(shí)施例7本發(fā)明化合物的藥效試驗(yàn)
[0093] 采用MTT檢測(cè)法，其為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線 粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素 C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的 formanzan結(jié)晶，formazan結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比，還原生成的formanzan結(jié) 晶可在二甲亞砜(DMS0)中溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的光密度值(0D)值，即可反應(yīng)出活 細(xì)胞數(shù)量。
[0094] 一、實(shí)驗(yàn)步驟
[0095] 肺癌細(xì)胞株:A549和H1299
[0096] 實(shí)驗(yàn)用品：肺癌細(xì)胞株、細(xì)胞培養(yǎng)所需工具、MTT以及化合物母液為10mm〇l/L，陽性 對(duì)照藥Src抑制劑ppl。
[0097] 1、具體方法。
[0098] (3-1)復(fù)蘇A549和H1299細(xì)胞，待狀態(tài)良好時(shí)，即傳代一次后細(xì)胞長(zhǎng)到80 %左右（即 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)進(jìn)行鋪板(96孔板）。
[0099] (3-2)首先，收集細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞 接種到96孔板，具體每孔的細(xì)胞數(shù)依據(jù)不同細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和藥物作用時(shí)間來確定，549鋪 5000和1299鋪5000,每孔200ul(100ul的細(xì)胞懸液+100ul的不同濃度梯度的藥物稀釋液）， 邊孔(36個(gè))加200ul的雙無培養(yǎng)基，（為了防止邊緣效應(yīng)）。
[0100] (3-3)鋪板加藥后，根據(jù)24h、48h、72h處理，然后呈色，每孔加含20ulMTT溶液(5mg/ mL)的培養(yǎng)液200ul，繼續(xù)培養(yǎng)l-4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需 要離心后再吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMS0,在搖床上震蕩15~20min，使結(jié)晶 物充分溶解。
[0101] (3-4)比色:在酶標(biāo)儀上測(cè)定，選擇490或者570nm波長(zhǎng)，從而測(cè)定各孔的光吸收值， 記錄結(jié)果。
[0102] (3_5)計(jì)算
[0103] 抑制率=(對(duì)照-給藥)/對(duì)照X 100%
[0104] IC5Q(半數(shù)抑制濃度)時(shí)可根據(jù)不同濃度的抑制率用spass軟件求算。
[0105]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0106] A549細(xì)胞作用處、2411、4811、7211，藥物劑量分為低濃度組（1〇11111、2511111、4〇11111)和高濃 度組(5011111、8011111、10011111)，分別鋪板6000和5000細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下表1~5以及圖1~4 所示：
[0107]表1本發(fā)明化合物對(duì)A549的抑制作用(4h)
[0108]
[0109] 表2本發(fā)明化合物對(duì)A549的抑制作用（24h)
[0110]
[0111]表3本發(fā)明化合物對(duì)A549的抑制作用(48h)
[0112]
[0113] 表4本發(fā)明化合物對(duì)A549的抑制作用(7 2h)
[0114]
[0115] 表5對(duì)照藥PP1對(duì)A549的抑制作用（7 2h)
[0116]
[0117] H1299每孔鋪5000,作用處、2411、4811、7211，結(jié)果如下表5~9和圖5~8所示：表6本 發(fā)明化合物對(duì)H1299的抑制作用(4h)
[0118]
[0119] 表7本發(fā)明化合物對(duì)H1299的抑制作用（24h)
[0120]
[0121] 表8本發(fā)明化合物對(duì)H1299的抑制作用
(48h)
[0122]
[0123] 表9本發(fā)明化合物對(duì)HI 299的抑制作用(72h)
[0124]
[0125] 綜上所述，本發(fā)明提供的化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，可以用于預(yù)防 和/或治療腫瘤相關(guān)疾病，尤其是肺癌，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 式(I)所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、或其溶劑合物：(I ) 其中， Ri 表示-NH2、-NH( C1-C4 烷基)或者 _N( C1-C4 烷基)2; R2表不氫或Cl_C6烷基； R3表不氫或Cl_C6烷基； _0R4表不在苯環(huán)上任意個(gè)位置的取代基，R4表不_(R5〇)n_R6 _X ; η表示1~10的正整數(shù)； R5和R6分別獨(dú)立地選自亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基、亞己基、亞庚基、亞辛 基、亞壬基或亞癸基； X表示鹵原子、-OH或-OSO2-R7，R7表示苯基或被1個(gè)或多個(gè)&-〇5烷基取代的苯基。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于:R1S-NH2。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于:R2為氫。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于:R3表示&-〇5烷基，優(yōu)選正丁基或叔丁基。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于:RA-NH2，且1?2為氫，且R 3表示 C1-C6烷基，優(yōu)選正丁基或叔丁基。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于:η為3、4或5。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于:RdPR6均為亞乙基。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的化合物，其特征在于:X為對(duì)甲苯磺酰基。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，所述化合物為如下化合物之一：Ts表示對(duì)甲苯磺?；?0. 權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的化合物、或其溶劑合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備 抗腫瘤藥物中的用途;優(yōu)選的，所述藥物是治療肺癌的藥物;更優(yōu)選的，所述肺癌是非小細(xì) 胞肺癌。11. 一種藥物組合物，其特征在于:它是以權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的化合物、或其溶劑 合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備而成的制劑。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106008527SQ201610515065
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月29日
【發(fā)明人】何楊, 李為民, 張立
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)華西醫(yī)院