Wt1抗原性多肽和含有該多肽的抗腫瘤劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種能夠?qū)碓床煌亩喾NT細胞進行刺激，對多種癌癥強烈誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的多肽。一種多肽，其為含有來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位及來自WT1蛋白質(zhì)的殺傷表位的融合多肽，在每1分子的該融合多肽中含有總計3～6個的前述輔助表位和前述殺傷表位。
【專利說明】
WT1抗原性多肽和含有該多肽的抗腫瘤劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及能夠用于癌癥免疫療法的、來自由Wilms腫瘤基因 WT1編碼的WT1蛋白 質(zhì)的抗原性多肽、制造對該多肽特異性的T細胞的方法、以及含有該多肽等的抗腫瘤劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為難以醫(yī)治的疾病-癌癥（惡性腫瘤）的治療方法之一，可以列舉利用患者個體 所具有的免疫系統(tǒng)使癌細胞萎縮的、即所謂的癌癥免疫療法。該方法的重點在于，如何使免 疫系統(tǒng)將癌細胞識別為異物、并誘導(dǎo)出對癌細胞具有攻擊性的免疫細胞。
[0003] 參與抗腫瘤免疫的重要免疫細胞有表達作為細胞表面蛋白質(zhì)的CD8的T細胞(CD8+ T細胞）、表達作為細胞表面蛋白質(zhì)的CD4的T細胞(CD4+T細胞）<XD8+T細胞為在被活化時將 提呈與HLA I類分子結(jié)合的抗原的細胞溶解的T細胞(細胞毒性T細胞、CTL) XD4+T細胞為分 泌細胞因子的Th細胞，被通過HLAII類分子提呈抗原的巨噬細胞和/或樹突狀細胞等活化， 對用于誘導(dǎo)和維持CD8+T細胞發(fā)揮輔助功能。此外，已知Th細胞根據(jù)所分泌的細胞因子的種 類而分成Thl細胞(產(chǎn)生IFN-丫等的細胞）、Th2細胞(產(chǎn)生白介素-4等的細胞)和ThO細胞(產(chǎn) 生細胞因子能力低或同時產(chǎn)生IFN-y、IL_4等的細胞），各細胞的作用正不斷地得到闡明。 此外，CD4+T細胞通過針對MHC 11類分子陰性腫瘤(MHC II類-腫瘤）的間接機制、例如通過 活化巨噬細胞或介由殺傷T細胞、NK細胞或者通過針對MHC II類陽性腫瘤的直接機制，從而 也能夠具有效應(yīng)功能。
[0004] 迄今為止，人的癌癥免疫治療中的T細胞研究主要聚焦于⑶8+HLA I類限制性CTL 應(yīng)答的鑒定和誘導(dǎo)（專利文獻1)。對于CD4+T細胞，報道了作為癌抗原之一的酪氨酸酶及其 對CD4+T細胞的表位(輔助表位)的鑒定(專利文獻2)。酪氨酸酶在黑素細胞系列的正常細胞 及腫瘤細胞中表達，是與被視為CD4+黑素瘤反應(yīng)性T細胞的特異性靶標的、MHC II類分子結(jié) 合的黑素瘤締合性組織特異性抗原(非專利文獻1)。但是，酪氨酸酶為僅在有限類型的腫瘤 中表達的抗原，很難稱其為癌癥免疫治療中有希望的癌抗原。
[0005] 本發(fā)明人中的部分發(fā)明人著眼于編碼被稱為MAGE的、被CD8+T細胞識別的腫瘤特 異抗原的基因家族，發(fā)現(xiàn)來自其中之一的MAGE-A4蛋白質(zhì)的多肽片段作為癌癥疫苗肽(輔助 表位)有用(專利文獻3)。但是，表達MAGE-A4蛋白質(zhì)的癌癥的種類有限，因此，依然非常期待 對更多種類的癌癥也能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的新的多肽的發(fā)現(xiàn)。
[0006] 另一方面，WT1蛋白質(zhì)是在白血病、各種固體癌中高表達的由Wilms腫瘤基因 WT1編 碼的蛋白質(zhì)。期待其作為癌癥疫苗肽的候選，多名研究者已經(jīng)報道了來自WT1蛋白質(zhì)的多個 輔助表位、殺傷表位，是癌相關(guān)蛋白質(zhì)的代表例子(專利文獻4~6、非專利文獻1~3)。
[0007] 此外，由這樣的輔助表位、殺傷表位誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答受HLA基因的多態(tài)性控制（限 制）（參照后述表1~5的"HLA限制性"）。此外，還已知，即使是來自具有相同的HLA等位基因 的患者的T細胞之間，對于基于輔助表位、殺傷表位的免疫應(yīng)答也在其的有無、強弱方面存 在差異。因此，需要對來源不同的多種T細胞進行刺激、對多種癌癥能夠誘導(dǎo)更強的免疫應(yīng) 答的多肽。
[0008] 關(guān)于這一點，本發(fā)明人等開發(fā)了一種使1個輔助表位和1個殺傷表位鍵合而成的長 鏈多肽(輔助/殺傷-嵌合表位長肽;H/K-HELP)，進而還明確了 ：通過使用該H/K-HELP，與將 該輔助表位及該殺傷表位混合使用時相比，能夠更有效地誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答(產(chǎn)生 抗原特異性CTL及Th細胞）（非專利文獻4)。此外，關(guān)于所涉及的H/K-HELP，本發(fā)明人還證實： 通過將使1個來自MAGE蛋白質(zhì)的輔助表位和1個來自MAGE蛋白質(zhì)的殺傷表位鍵合而成的H/ K-HELP施與大腸癌轉(zhuǎn)移到肺的人類患者，對MAGE強烈誘導(dǎo)了特異性免疫應(yīng)答，該患者的腫 瘤增殖以及CEA腫瘤標志物有意義地降低(非專利文獻4及5)。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0010] 專利文獻
[0011] 專利文獻1:國際公開第95/19783號
[0012] 專利文獻2:國際公開第97/11669號
[0013] 專利文獻3:國際公開第2008/053579號
[0014] 專利文獻4:國際公開第2007/047764號
[0015] 專利文獻5:國際公開第00/18795號
[0016] 專利文獻6:日本日本特開2006-280324號公報
[0017]非專利文獻
[0018] 非專利文獻 1:Oka Y?等、Current Medicinal Chemistry、2008年12月、15卷、29 號、3052~3061頁
[0019] 非專利文獻2:Kobayashi H?等、Cancer Immunol Immunother?、2006年7月、55卷、 7號、850~860頁
[0020] 非專利文獻3:Borbulevych 0Y等、Mol Immunol ?、2010年9月、47卷、15號、2519~ 2524 頁
[0021]非專利文獻4:大竹淳矢等、"輔助/殺傷-嵌合表位長肽(H/K-HELP)與短肽相比顯 示優(yōu)異的抗原特異性Thl、Tcl細胞誘導(dǎo)能"、第71回日本癌學會學術(shù)總會記事、2012年8月30 日發(fā)行、101頁
[0022]非專利文獻5:Takahashi N?等、Cancer Sci.、2012年 1 月、103卷、1 號、150~153頁

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023]發(fā)明要解決的課題
[0024]本發(fā)明是鑒于前述現(xiàn)有技術(shù)所具有的課題而作出的，目的在于，提供一種能夠?qū)?來源不同的多種T細胞進行刺激、對多種癌癥強烈誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的多肽。
[0025]用于解決課題的手段
[0026] 本發(fā)明人為了達成前述目的，著眼于在白血病、各種固體癌中高表達的由腫瘤基 因 WT1編碼的蛋白質(zhì)，制備使1個來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位和1個來自WT1蛋白質(zhì)的殺傷表 位鍵合而成的H/K-HELP，對T細胞進行刺激，并與將這些表位混合而對T細胞進行刺激的情 況進行了比較。但是，與預(yù)期相反的是，未能確認在非專利文獻4和5中所確認到的免疫應(yīng)答 幾進等。
[0027] 另一方面，發(fā)現(xiàn):在利用使總計3個以上的來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位和殺傷表位 鍵合而成的H/K-HELP對T細胞進行刺激時，與將這些表位混合對T細胞進行刺激的情況相 比，能夠?qū)碓床煌母喾N的CD4+T細胞和CD8+T細胞進行刺激，誘導(dǎo)更多的產(chǎn)生細胞因 子（IFN-y )的Thl細胞及CTL。進而，通過利用在輔助表位的兩側(cè)鍵合有殺傷表位的H/K-HELP對T細胞進行刺激，與利用在輔助表位的一側(cè)鍵合有2個殺傷表位的H/K-HELP對T細胞 進行刺激的情況相比，能夠?qū)碓床煌母嗟腃D4+T細胞進行刺激，誘導(dǎo)更多的產(chǎn)生IFN-y的Thl細胞，從而完成了下述各發(fā)明。
[0028] <1>一種多肽，其為含有來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位及來自WT1蛋白質(zhì)的殺傷表 位的融合多肽，在每1分子的該融合多肽中含有總計3~6個的前述輔助表位和前述殺傷表 位。
[0029] <2>根據(jù)<1>所述的多肽，其中，在每1分子前述融合多肽中含有1個前述輔助 表位和2個前述殺傷表位。
[0030] <3>根據(jù)<2>所述的多肽，其中，前述殺傷表位鍵合在前述輔助表位的兩側(cè)。
[0031] <4>根據(jù)<1>~<3>中任一項所述的多肽，其中，前述輔助表位的氨基酸序列 為選自序列號:2~39中記載的氨基酸序列中的至少一種氨基酸序列，且前述殺傷表位的氨 基酸序列為選自序列號:40~45中記載的氨基酸序列中的至少一種氨基酸序列。
[0032] <5>根據(jù)<2>所述的多肽，其中，前述輔助表位的氨基酸序列為序列號：5中記 載的氨基酸序列，且前述殺傷表位的氨基酸序列為序列號：40和/或44中記載的氨基酸序 列。
[0033] <6>根據(jù)<3>所述的多肽，其中，前述輔助表位的氨基酸序列為序列號：5中記 載的氨基酸序列，鍵合在前述輔助表位的氨基末端側(cè)的前述殺傷表位的氨基酸序列為序列 號:40中記載的氨基酸序列，且鍵合在前述輔助表位的羧基末端側(cè)的前述殺傷表位的氨基 酸序列為序列號:44中記載的氨基酸序列。
[0034] <7 > -種抗腫瘤劑，其含有< 1 >~<6 >中任一項所述的多肽作為有效成分。
[0035] <8>-種在體外制造針對表達WT1蛋白質(zhì)的腫瘤細胞產(chǎn)生細胞因子的T細胞的方 法，其含有如下工序:培育<1>~<6>中任一項所述的多肽和單核細胞的工序、以及培育 前述所培育單核細胞和抗原提呈細胞的工序。
[0036] <9>-種抗腫瘤劑，其含有利用<8>所述的制造方法制造的T細胞作為有效成 分。
[0037] < 10 >根據(jù)< 9 >所述的抗腫瘤劑，其還含有< 1 >~< 6 >中任一項所述的多肽。
[0038] <11>-種抗腫瘤劑，其以<1>~<6>中任一項所述的多肽及抗原提呈細胞為 有效成分。
[0039] < 12 >-種抗腫瘤劑，其以利用<1>~<6>中任一項所述的多肽脈沖后的抗原 提呈細胞為有效成分。
[0040] 發(fā)明的效果
[0041 ]根據(jù)本發(fā)明，可以提供一種能夠?qū)碓床煌亩喾NT細胞進行刺激、對多種癌癥強 烈誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-y等細胞因子等的免疫應(yīng)答的多肽。
【附圖說明】
[0042]圖1為示出使用來自WT1蛋白質(zhì)的多肽、由末梢血單核細胞誘導(dǎo)對該多肽進行特異 性免疫應(yīng)答的T細胞(抗原特異性T細胞)的方法的概略圖。
【具體實施方式】
[0043] <本發(fā)明的來自WT1蛋白質(zhì)的抗原性多肽>
[0044] 如后述實施例所示，通過使總計3個以上的來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位和殺傷表位 鍵合而制作長鏈多肽，與將這些表位混合而對T細胞進行刺激的情況相比，能夠?qū)碓床煌?的多種⑶4+T細胞及⑶8+T細胞進行刺激、更多地誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞因子的Thl細胞及CTL。另一 方面，即使使來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位和殺傷表位各1個鍵合而制作長鏈多肽，所述Thl細 胞或CTL的誘導(dǎo)也并不亢進。
[0045]因此，本發(fā)明的來自WT1蛋白質(zhì)的抗原性多肽為含有來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位及 來自WT1蛋白質(zhì)的殺傷表位的融合多肽，在每1分子的該融合多肽中含有總計3~6個的前述 輔助表位和前述殺傷表位。
[0046]在本發(fā)明中，"多肽"是指多個氨基酸連接而成的化合物。即，所謂肽也包括寡肽及 蛋白質(zhì)。此外，構(gòu)成多肽的氨基酸可以為天然型，也可以為非天然型，還可以為類似物(氨基 酸的N-?；铩?-?；?、酯化物、酰胺化物、烷基化物等）。此外，氨基酸的側(cè)鏈可以進 行化學修飾(添加糖鏈、添加脂質(zhì)、乙酰化、磷酸化、泛素化等）。進而，多肽的氨基末端、游離 的氨基可以鍵合有甲?；?、乙酰基、叔丁氧羰基(t-Boc)等，本發(fā)明的肽的羰基末端、游離的 羧基可以鍵合有甲基、乙基、叔丁基、芐基等。
[0047]在本發(fā)明中，"WT1蛋白質(zhì)"是指在白血病、各種固體癌中高表達的由Wilms腫瘤基 因 WT1編碼的蛋白，來自人的WT1蛋白質(zhì)中，典型的為由序列號：1中記載的氨基酸序列構(gòu)成 的蛋白（RefSeq ID:NM_024426.4所特定的堿基序列編碼的蛋白質(zhì)）。
[0048]此外，WT1蛋白質(zhì)除了這樣的具有典型的氨基酸序列的蛋白質(zhì)以外，在天然中還能 存在氨基酸發(fā)生了變異的類型。因此，例如，人WT1蛋白質(zhì)還包括在由序列號：1中記載的氨 基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)中置換、缺失、插入或添加1個或多個氨基酸的氨基酸序列所構(gòu)成的 蛋白質(zhì)。氨基酸序列的置換、缺失、插入或添加一般為10個以內(nèi)的氨基酸(例如，5個以內(nèi)的 氨基酸、3個以內(nèi)的氨基酸、1個氨基酸）。
[0049]在本發(fā)明中，"輔助表位"是指也被稱為"Th表位"或"CD4+輔助表位"的、具有對CD4 +T細胞進行刺激而誘導(dǎo)其的免疫應(yīng)答的活性的抗原決定簇、構(gòu)成其的氨基酸序列或含有該 氨基酸序列的抗原性多肽中的任意者。在本發(fā)明中，對"輔助表位"的長度沒有特別限制，通 常為5~30個氨基酸，優(yōu)選為7~25個氨基酸，更優(yōu)選為9~22個氨基酸，特別優(yōu)選為16個氨 基酸。
[0050]需要說明的是，在本發(fā)明中，"免疫應(yīng)答"是指T細胞等負責免疫的細胞將外源性異 物(細菌、病毒等或它們的片段)或內(nèi)源性異物(癌細胞等或它們的片段)識別為抗原、特異 性地進行應(yīng)答的反應(yīng)，可以列舉例如:通過識別所述抗原而進行的IFN-y等細胞因子的產(chǎn) 生、進而通過所涉及的細胞因子的產(chǎn)生等誘導(dǎo)的細菌、病毒及癌細胞等的清除。
[0051 ]在本發(fā)明中，"殺傷表位"是指:也被稱為"CTL表位"或"細胞毒性T細胞表位"的、具 有對CD8+T細胞進行刺激而誘導(dǎo)其的免疫應(yīng)答的活性的抗原決定簇、構(gòu)成其的氨基酸序列 或含有該氨基酸序列的抗原性多肽。在本發(fā)明中，對"殺傷表位"的長度沒有特別限制，通常 為5~30個氨基酸，優(yōu)選為6~25個氨基酸，更優(yōu)選為8~20個氨基酸，特別優(yōu)選為9個氨基 酸。
[0052] 抗原性多肽可以使用公知技術(shù)（例如，Paul WE編集、Fundamental Immunology、第 3版、243~247頁、Raven出版、1993年）來鑒定。作為用于鑒定抗原性多肽的技術(shù)，可以列舉 以與抗原特異性抗血清和/或T細胞株或克隆的進行反應(yīng)的能力為指標的多肽篩選方法。例 如，在ELISA和/或T細胞反應(yīng)性分析中，以反應(yīng)性實質(zhì)上大于或等于全長WT1蛋白質(zhì)的水平 作為指標，在WT1蛋白質(zhì)中的多肽中，可以選擇與抗血清和/或T細胞反應(yīng)的部分作為來自 WT1蛋白質(zhì)的抗原性多肽。這樣的篩選可以使用Harlow和Lane、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1998中記載的那樣本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法 來實施。
[0053] 此外，構(gòu)成表位的氨基酸序列還可以通過利用電腦程序的分析來進行推測。輔助 表位的氨基酸序列可以通過MHC_THREAD(http : //www. csd . abdn. ac . uk/~g jlk/MHC-Thread/)、EpiPredict(http://www.epipredict.de/index.html)、HLA_DR4binding (http://www-dcs?nci?nih?gov/branches/surgery/sbprog?html)、ProPred(http:// www. imtech.res . in/raghava/propred/)等電腦程序來進行推測。殺傷表位的氨基酸序列 可以通過 BIMAS(http ://bimas.dcrt.nih. gov/molbio/hla _bind/)、SVMHC (http : // www?sbc?su?se/svmhc/)、PREDEP(http://bioinfo.md.huji?ac?il/marg/Teppred/mhc-bind/)、NetMHC(http://www.cbs.dtu.dk/servi ces/NetMHC/)、PREDICT(http:// sdmc.krdl.org.sg:8080/predict/)、LpPep(http://reiner.bu.edu/zhiping/ lppep .html )等電腦程序來進行推測。此外，還可以通過SYFPEITHI (http :// syfpeithi?bmi-heidelberg?com/Scripts/MHCServer?dll/EpiPredict?htm)、RankPep (http://www .mifoundat ion ? org/Tools/rankpep ? html)等電腦程序來推測殺傷表位及輔 助表位的氨基酸序列。
[0054]含有通過這些電腦程序而推測出的氨基酸序列的多肽是否具有對CD4+T細胞或 CD8+T細胞進行刺激、誘導(dǎo)其的免疫應(yīng)答的活性，可以如后述實施例中所示那樣在使用樹突 狀細胞、末梢血細胞或纖維芽細胞的體外刺激分析中，通過供給所涉及的多肽，從而進行評 價。此外，還可以通過將所涉及的多肽供于使用表達HLA的轉(zhuǎn)基因小鼠動物的體內(nèi)刺激分 析，來進行評價。
[0055]在本發(fā)明中，"來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位"或"來自WT1蛋白質(zhì)的殺傷表位"不僅包 括由天然WT1蛋白質(zhì)的部分連續(xù)的氨基酸序列構(gòu)成的抗原性多肽，還包括其的變異體。作為 所涉及的變異體，可以列舉含有在WT1蛋白質(zhì)的部分連續(xù)的氨基酸序列中置換、缺失、插入 或添加1個或多個氨基酸而成的氨基酸序列的變異體。氨基酸序列的置換、缺失、插入或添 加一般為10個以內(nèi)的氨基酸(例如，5個以內(nèi)的氨基酸、優(yōu)選為3個以內(nèi)的氨基酸、更優(yōu)選為1 氨基酸），作為本發(fā)明的變異體，特別優(yōu)選含有在WT1蛋白質(zhì)的部分連續(xù)的氨基酸序列中置 換了1個氨基酸的氨基酸序列的變異體。
[0056]此外，作為本發(fā)明所涉及的"來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位"的合適例子，可以列舉由 表1中記載的序列號:2~39中的任一個所述的氨基酸序列構(gòu)成的多肽，作為更合適的例子， 可以列舉由序列號:5中記載的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。作為本發(fā)明所涉及的"來自WT1蛋白 質(zhì)的殺傷表位"的合適例子，可以列舉由表5記載的序列號:40~45中的任一個記載的氨基 酸序列構(gòu)成的多肽，作為更合適的例子，可以列舉由序列號:40或44中記載的氨基酸序列構(gòu) 成的多肽。




[0067] 需要說明的是，表1~5中記載的多肽對⑶4+T細胞或⑶8+T細胞具有抗原性已經(jīng)在 專利文獻4~6、非專利文獻1~3中證實。此外，如表1~5中記載的，由序列號:9中記載的氨 基酸序列構(gòu)成的多肽(輔助表位8)是將天然的WT1蛋白質(zhì)中的194位的精氨酸殘基置換為酪 氨酸殘基的多肽，由序列號：42中記載的氨基酸序列構(gòu)成的多肽(殺傷表位3)是將天然的 WT1蛋白質(zhì)中的194位的精氨酸殘基置換為酪氨酸殘基的多肽，由序列號:44中記載的氨基 酸序列構(gòu)成的多肽(殺傷表位5)是將天然的WT1蛋白質(zhì)中的304位的甲硫氨酸殘基置換為酪 氨酸殘基的多肽。
[0068] 本發(fā)明的"融合多肽"是將每1分子前述輔助表位和前述殺傷表位的總計3~6個多 肽人為地鍵合而成的。前述輔助表位及前述殺傷表位的個數(shù)如果低于前述下限時，變得不 能對來源不同的多種T細胞進行刺激；如果超過前述上限時，變得難以通過化學合成等制 備。此外，對本發(fā)明的融合多肽的鏈長沒有特別限制，優(yōu)選為30~100個氨基酸。
[0069] 關(guān)于本發(fā)明的每1分子融合多肽中所含有的表位(前述輔助表位或前述殺傷表位） 的個數(shù)，規(guī)定為:在1個表位中含有其它表位時，并不含有該其它表位的個數(shù)(1個）。例如，關(guān) 于含有表1中記載的輔助表位7(由人WT1蛋白質(zhì)的第190~208位的氨基酸構(gòu)成的多肽)的本 發(fā)明的融合多肽，如表5所示，在人WT1蛋白質(zhì)的第190~208位的氨基酸中含有殺傷表位7 (由人WT1蛋白質(zhì)的第194~202位的氨基酸構(gòu)成的多肽），但在該每1分子融合多肽中所含有 的表位的個數(shù)不包括殺傷表位7的個數(shù)（1個殺傷表位）。此外，例如，關(guān)于含有表1中記載的 輔助表位6(由人WT1蛋白質(zhì)的第396~417位的氨基酸構(gòu)成的多肽）的本發(fā)明的融合多肽，含 有輔助表位2~4 (分別為由人WT1蛋白質(zhì)的第399~413位的氨基酸構(gòu)成的多肽、由人WT1蛋 白質(zhì)的第405~415位的氨基酸構(gòu)成的多肽、由人WT1蛋白質(zhì)的第400~415位的氨基酸構(gòu)成 的多肽），但在該每1分子融合多肽中所含有的表位的個數(shù)中不含輔助表位2~4(3個輔助表 位)。
[0070] 本發(fā)明的"融合多肽"中，每個各序列可以含有1個以上的序列不同的表位，也可以 含有多個序列相同的表位。
[0071] 此外，本發(fā)明的"融合多肽"中，對前述輔助表位及前述殺傷表位的配置沒有特別 限制，前述輔助表位及前述殺傷表位可以在中間未夾持前述殺傷表位及前述輔助表位地分 別連續(xù)配置2個以上，此外，也可以是前述輔助表位和前述殺傷表位交替配置。
[0072] 作為本發(fā)明的"融合多肽"，優(yōu)選為在每1分子中含有總計3個的前述輔助表位和前 述殺傷表位，更優(yōu)選為含有1個前述輔助表位和2個前述殺傷表位，進而優(yōu)選為包含含有序 列號：5中記載的氨基酸序列的多肽、含有序列號:40中記載的氨基酸序列的多肽和含有序 列號:44中記載的氨基酸序列的多肽的融合多肽。
[0073] 此外，如后述實施例所示，從能夠?qū)碓床煌母喾N的CD4+T細胞及CD8+T細胞 進行刺激、更多地誘導(dǎo)抗原特異性的產(chǎn)生細胞因子的Thl細胞及CTL的觀點出發(fā)，作為本發(fā) 明的"融合多肽"進而優(yōu)選為前述殺傷表位鍵合在前述輔助表位的兩側(cè)的多肽，特別優(yōu)選為 在含有序列號:5中記載的氨基酸序列的多肽的氨基末端側(cè)鍵合有含有序列號:40中記載的 氨基酸序列的多肽、在含有序列號:5中記載的氨基酸序列的多肽的羧基末端側(cè)鍵合有含有 序列號:44中記載的氨基酸序列的多肽的融合多肽。
[0074] 本發(fā)明的"融合多肽"中，表位之間既可以直接鍵合也可以間接鍵合。作為所涉及 的間接鍵合，可以列舉例如介由連接多肽的鍵合。作為所涉及的連接多肽的長度，通常為1 ~100個氨基酸、優(yōu)選為1~50個氨基酸、更優(yōu)選為1~30個氨基酸、進而優(yōu)選為2~10個氨基 酸(例如，5個氨基酸），特別優(yōu)選為介由含有5個甘氨酸的連接多肽的鍵合。
[0075] 本發(fā)明的融合多肽只要在每1分子中含有總計3~6個前述輔助表位和前述殺傷表 位即可，也可以進一步添加對蛋白質(zhì)的分離純化有用通常作為標簽使用的His標簽、GFP之 類的標記蛋白，還可以添加生物素等標記化合物。
[0076] 本發(fā)明的融合多肽，可通過對編碼它們的DNA應(yīng)用各種公知的基因重組方法，來制 造該融合多肽作為重組蛋白質(zhì)。典型的例子為，使用適當?shù)腄NA合成儀合成編碼有本發(fā)明的 融合多肽的DNA，適當選擇或組合該技術(shù)領(lǐng)域的參考書例如Sambrook等的Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第2版（Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年 等）中介紹的各種方法，構(gòu)建表達本發(fā)明的融合多肽的表達載體，用該表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿 菌等適當?shù)乃拗骷毎?，生產(chǎn)該多肽。如前所述，此時可增加用于制造重組多肽的各種操作， 如添加組氨酸標簽等。
[0077] 此外，本發(fā)明的融合多肽還可以以經(jīng)各種保護基修飾過的氨基酸為原料通過化學 合成來制造。不使用基因、宿主細胞而通過有機化學方法合成融合多肽的方法，對本領(lǐng)域技 術(shù)人員而言是眾所周知的。例如，"第5版實驗化學講座16有機化合物的合成IV"（相本三郎 等著、日本化學會編)等介紹了各種多肽的化學合成方法，本發(fā)明的多肽可使用這些方法中 的任意一種來合成。此外，也可以使用通常被稱為肽合成儀的市售儀器來合成。
[0078] <本發(fā)明的抗腫瘤劑>
[0079] 如后述實施例所示，前述融合多肽能夠?qū)碓床煌亩喾NT細胞進行刺激，強烈誘 導(dǎo)它們的免疫應(yīng)答。因此，還能夠提供一種含有本發(fā)明的融合多肽作為有效成分的抗腫瘤 劑。
[0080] 在本發(fā)明中，"抗腫瘤劑"是指對T細胞進行刺激而誘導(dǎo)它們的免疫應(yīng)答，從而能夠 抑制腫瘤細胞的増殖和/或誘導(dǎo)該腫瘤細胞死亡的藥劑。即，本發(fā)明的抗腫瘤劑不僅是能夠 通過施與對象而對對象內(nèi)的T細胞進行刺激、激活免疫應(yīng)答的藥劑(用于主動免疫療法的藥 劑），還包括含有在對象外被刺激而使其免疫應(yīng)答被激活的T細胞等的藥劑（用于被動免疫 療法的藥劑）。
[0081 ]此外，作為成為本發(fā)明的"抗腫瘤劑"的治療或預(yù)防對象的腫瘤，只要是表達WT1蛋 白質(zhì)的腫瘤即可，可以列舉例如白血?。毙怨撬栊园籽　⒓毙粤馨托园籽　⒙怨撬?性白血病等)及固體癌（腎胚細胞瘤(Wi lms瘤）、腎癌、乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、胃癌、腸癌、 前列腺癌、卵巢癌、黑素瘤等）。
[0082] 此外，作為本發(fā)明的抗腫瘤劑的其它方式，可以列舉含有使用本發(fā)明的融合多肽 及該融合多肽制造的、對表達WT1蛋白質(zhì)的腫瘤細胞產(chǎn)生細胞因子的T細胞作為有效成分的 抗腫瘤劑。
[0083] 所涉及的"對表達WT1蛋白質(zhì)的腫瘤細胞產(chǎn)生細胞因子的T細胞"可以通過例如以 下方法來制造。
[0084] 所述方法含有培育本發(fā)明的融合多肽和單核細胞的工序、及培育前述所培育的單 核細胞和抗原提呈細胞的工序。
[0085]在本發(fā)明中，"單核細胞"是指淋巴細胞及單核細胞，可以列舉例如末梢血單核細 胞(PBMC、末梢血單核細胞）、臍帶血單核細胞、腫瘤組織浸潤淋巴細胞的形態(tài)。需要說明的 是，腫瘤組織浸潤淋巴細胞是指從由罹患癌癥的對象切除的腫瘤組織中、或采集的胸水、腹 水中分離的淋巴細胞。
[0086]本發(fā)明的融合多肽和單核細胞的"培育"例如通過在培養(yǎng)單核細胞的培養(yǎng)基中添 加本發(fā)明的融合多肽來進行。此外，還可以通過在固定有本發(fā)明的融合多肽的平板中培養(yǎng) 單核細胞來進行。作為所涉及的培育時的條件，只要適合于單核細胞的維持即可，可以列舉 例如在為了維持單核細胞而利用的培養(yǎng)基(例如，添加血清的AM-V培養(yǎng)基）中在37 °C、5 % CO2中培養(yǎng)15分鐘~48小時。
[0087] 作為按照此種方式進行培育的單核細胞和進行培育的抗原提呈細胞，只要是在其 表面表達可以與在前述培育時使用的本發(fā)明的融合多肽結(jié)合的HLA的細胞即可，可以列舉 例如樹突狀細胞、B細胞、巨噬細胞。此外，作為本發(fā)明中所涉及的抗原提呈細胞，可以是在 其表面上表達利用本發(fā)明的融合多肽脈沖的前述HLA的細胞。此外，所涉及的抗原提呈細胞 可以在與單核細胞培育前照射X射線、絲裂霉素處理等而使其喪失增殖能力。
[0088] 作為所涉及的抗原提呈細胞和單核細胞培育時的條件，只要適合于維持單核細胞 及抗原提呈細胞即可，可以列舉例如在為了維持單核細胞及抗原提呈細胞而利用的培養(yǎng)基 (例如，AIM-V培養(yǎng)基）中在37°C、5 % C02中培養(yǎng)1~7天。此外，該培育時，在培養(yǎng)基中，從對T 細胞進行刺激的觀點出發(fā)，可以將11-2、幾-7、11-15、？擬、抗〇03抗體、正^丫、11-12、抗11-4抗體或這些的組合添加到培養(yǎng)基中。進而，從通過產(chǎn)生各種細胞因子而強化免疫應(yīng)答的觀 點出發(fā)，可以將？丨(^ &1111(01(-432)、0口6 0嫩等1'〇11樣受體(111〇的激動劑等添加到培養(yǎng)基 中。此外，為了確保被動免疫療法所需要的T細胞數(shù)，可以將該抗原提呈細胞和單核細胞的 培育反復(fù)進行多次。
[0089] 如后述實施例所示，如此制造的T細胞含有對本發(fā)明的融合多肽特異性地產(chǎn)生細 胞因子的CD4+T細胞(抗原特異性CD4+T細胞)和對本發(fā)明的融合多肽特異性產(chǎn)生細胞因子 的CD8+T細胞(抗原特異性CD8+T細胞）。作為純化所涉及的T細胞的方法，例如，可以使用固 定有本發(fā)明的融合多肽的載體等進行分離。進而，還可以以所分泌的細胞因子為指標對所 涉及的T細胞進行純化。即，由于抗原特異性⑶4+T細胞產(chǎn)生IFN-y、IL-2、IL-4等細胞因子， 因此可以通過使用針對這些物質(zhì)的抗體的流式細胞術(shù)、親和色譜、磁珠純化法來進行純化。
[0090] 另一方面，由于抗原特異性⑶8+T細胞產(chǎn)生IFN-Y、TNF-a等細胞因子，因此可以通 過使用針對這些的抗體的流式細胞術(shù)、親和色譜、磁珠純化法來進行純化。
[0091] 此外，所涉及的T細胞可以通過使用抗在各T細胞的細胞表面表達的蛋白質(zhì)的抗體 的流式細胞術(shù)、親和色譜、磁珠純化法來進行純化。作為在抗原特異性CD4+T細胞的細胞表 面表達的蛋白質(zhì)，可以列舉⑶29、⑶45RA、⑶45R0等，作為在抗原特異性⑶8+T細胞的細胞表 面表達的蛋白質(zhì)，可以列舉⑶107a、⑶107b、⑶63、⑶69等。
[0092]此外，如前所述，為了將單核細胞誘導(dǎo)為抗原特異性T細胞，本發(fā)明的融合多肽及 抗原提呈細胞是有用的。因此，作為用于通過被動免疫療法治療或預(yù)防癌癥的藥劑，還能夠 提供一種以本發(fā)明的融合多肽及抗原提呈細胞為有效成分抗腫瘤劑。
[0093] 此外，本發(fā)明的抗腫瘤劑中所含有的T細胞及抗原提呈細胞、以及在該T細胞的制 造中使用的單核細胞及抗原提呈細胞可以是分別獨立地來自施與本發(fā)明的抗腫瘤劑的對 象的細胞（自體），也可以是與前述對象同種不同系的關(guān)系，此外還可以是HLA類型與前述對 象一致的同種不同系的關(guān)系。
[0094] 本發(fā)明的抗腫瘤劑中，可以在不妨礙本發(fā)明的融合多肽、T細胞或樹突狀細胞的作 用的范圍內(nèi)含有為了藥物的制劑化而一般使用的各種賦形劑、其它藥物活性成分等。本發(fā) 明的抗腫瘤劑特別優(yōu)選處于能夠使本發(fā)明的融合多肽、T細胞及樹突狀細胞保持穩(wěn)定的緩 沖液或液體培養(yǎng)基的形態(tài)。
[0095]作為緩沖液的非限定性例子，可舉出中性的緩沖生理鹽水或磷酸緩沖生理鹽水 等。此外，還可以進一步含有例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖醇等糖質(zhì)，蛋白質(zhì)、 氨基酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑（例如、EDTA或谷胱甘肽）、佐劑（例如、氫氧化鋁、KLH、 QS21、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、磷酸鋁、BCG、明礬、CpG DNA等TLR激動劑）、滲透壓調(diào) 節(jié)劑、懸浮劑、增粘劑和/或防腐劑等。
[0096] 此外，本發(fā)明的抗腫瘤劑優(yōu)選處于本發(fā)明的融合多肽及T細胞、以及本發(fā)明的融合 多肽及樹突狀細胞分別混合的形態(tài)，但也可以是本發(fā)明的融合多肽和T細胞或樹突狀細胞 分別保存、并能夠在使用時混合并施與的所謂試劑盒形態(tài)。
[0097] 本發(fā)明的抗腫瘤劑還可以與癌癥的治療或預(yù)防中使用的公知的藥物組成物組合 使用。此外，本發(fā)明的抗腫瘤劑可以以包括人在內(nèi)的動物為使用對象。對人以外的動物沒有 特別限制，可以以各種家畜、家禽、寵物、實驗用動物等為對象。此外，對施與本發(fā)明的抗腫 瘤劑的對象沒有特別限制，不僅可以是罹患表達WT1蛋白質(zhì)的腫瘤的動物，也可以是尚未罹 患的動物。例如，從預(yù)防癌癥復(fù)發(fā)的觀點出發(fā)，可以是通過外科手術(shù)、化療方法、放療方法等 治療過癌癥的動物。
[0098] 對本發(fā)明的抗腫瘤劑的施與形態(tài)沒有特別限制，可以列舉例如皮下注射、靜脈注 射、皮內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、向腫瘤組織部位的局部注射。在施與本發(fā)明的抗腫瘤劑時，其施 與量可以根據(jù)對象的年齡、體重、癥狀、健康狀態(tài)等適當選擇，例如，本發(fā)明的抗腫瘤劑的施 與量(有效成分換算量)根據(jù)有效成分的種類而不同，例如，在有效成分為多肽時，通常為 0.01~10mg，在有效成分為細胞時，通常為10 6~1012個細胞。
[0099] 本發(fā)明還提供一種用于對對象的癌癥進行治療或預(yù)防的方法，其特征在于，按照 上述方式將本發(fā)明的抗腫瘤劑施與對象。
[0100] 本發(fā)明的抗腫瘤劑的制品或其說明書可以附帶主旨為在癌癥的治療或預(yù)防中使 用的標識。這里，"制品或說明書附帶標識"是指:在制品的主體、容器、包裝等中附帶標識、 或者在用于公開制品信息的說明書、所附文件、宣傳物、其他印刷物等中附帶標識。在主旨 為在癌癥的治療或預(yù)防中使用的標識中，可以含有:通過施與本發(fā)明的融合多肽、該融合多 肽和使用該融合多肽制造的對表達WT1蛋白質(zhì)的腫瘤細胞產(chǎn)生細胞因子的T細胞、或者該融 合多肽及樹突狀細胞，從而抑制腫瘤細胞的增殖、和/或誘導(dǎo)該腫瘤細胞死亡的機理的相關(guān) fg息。
[0101] 實施例
[0102] 以下基于實施例及比較例對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明不受以下實施例 限定。
[0103] <樹突狀細胞的調(diào)制>
[0104] 從6名健康志愿者提供的血液中，使用F i c〇 11 -Paque (安瑪西亞（Amer sham Bioscience)公司制）分離人末梢血單核細胞(PBMC)。將所分離的PBMC用無血清的A頂-V在 細胞培養(yǎng)燒瓶(BD生物科學公司制）中在37°C、C0 2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1小時后，除去非粘附性細 胞。然后，將殘留在燒瓶上的粘附性細胞在重組GM-CSF(10ng/ml、和光公司制）及重組IL-4 (10ng/ml、Wako公司制）存在下開始用AM-V培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)起3天后，交換為 添加有GM-CSF和IL-4的AIM-V培養(yǎng)基，在開始培養(yǎng)起7天后用胰蛋白酶回收樹突狀細胞 (DC)。將該DC作為抗原特異性T細胞的誘導(dǎo)、或由T細胞產(chǎn)生抗原特異性細胞因子（IFN-y ) 的解析時的抗原提呈細胞(APC: antigen-presenting cel Is)使用。
[0105] <來自WT1蛋白質(zhì)的多肽>
[0106]設(shè)計表6所示的6種來自WT1蛋白質(zhì)的多肽，由株式會社肽研究所（PEPTIDE INSTITUTE，INC.)進行化學合成，以95%以上的純度獲得多肽。
[0107][表 6]
[0109]需要說明的是，輔助/殺傷-嵌合表位長肽(H/K-HELP)1是從N末端側(cè)起介由由5個 甘氨酸構(gòu)成的連接多肽將輔助表位(HE)4和殺傷表位(KE)1鍵合而成的融合多肽。H/K-HELP2是從N末端側(cè)起介由由5個甘氨酸構(gòu)成的連接多肽將HE4和KE1和KE5鍵合而成的融合 多肽。H/K-HELP3是從N末端側(cè)起介由由5個甘氨酸構(gòu)成的連接多肽將KE1和HE4和KE5鍵合而 成的融合多肽。
[0110] 此外，后述PBMC向培養(yǎng)培養(yǎng)基中的添加以下述4個方式來進行。
[0111] 混合物(比較例1):將各5yM的HE4、KE1及KE5混合而成的物質(zhì)添加到培養(yǎng)基中
[0112] H/K-HELP1(比較例2):將5處的H/K-HELP1添加到培養(yǎng)基中
[0113] H/K-HELP2(實施例1):將5處的H/K-HELP2添加到培養(yǎng)基中
[0114] H/K-HELP3(實施例2):將5處的H/K-HELP3添加到培養(yǎng)基中。
[0115] 〈抗原特異性Th細胞(⑶4陽性T細胞)及CTL(⑶8陽性T細胞)的誘導(dǎo)〉
[0116]將由健康志愿者分離的前述PBMC按照2 X106個細胞/孔的方式播種在24孔平板 (BD生物科學公司制）中。然后，用lml/孔的、添加前述來自WT1蛋白質(zhì)的用于誘導(dǎo)抗原特異 性T細胞的各多肽(5yM)及血清的A頂-V培養(yǎng)基，在37 °C、C02培養(yǎng)箱內(nèi)開始進行培養(yǎng)。
[0117] 在開始培養(yǎng)起7天后，將前述DC(自體DC)添加到相同來源的TOMC中。此外，將培養(yǎng) 基交換為添加〇K_432(0.1KE/ml、商品名:Picibanil、中外制藥株式會社制）的無血清A頂-V 培養(yǎng)基（生命科技(Life Technologies)公司制），培養(yǎng)2小時。需要說明的是，溶鏈菌(0K-432)是用青霉素對A群溶血性鏈球菌的弱毒性自然變異株(Su株)進行處理而得的制劑，通 過產(chǎn)生各種細胞因子(免疫因子)而激發(fā)免疫增強作用，這是已知的。
[0118] 然后，在前述2小時的培養(yǎng)后，加入絲裂霉素 C(MMC、協(xié)和發(fā)酵麒麟株式會社制)處 理50分鐘。進而，在前述用于誘導(dǎo)抗原特異性T細胞的各多肽(5yM)存在下，將自體DC和T細 胞在含有非活化的5%人AB血清(北海道紅十字中心）的AM-V培養(yǎng)基中進行共培養(yǎng)，進行T 細胞的再刺激。2天后按照最終濃度達到10U/ml的方式添加重組IL-2(Shionogi Pharmaceutical Institute Co .Ltd制）。從共培養(yǎng)開始14天后，將前述用于誘導(dǎo)抗原特異 性T細胞的各多肽(5yM)對自體DC脈沖2小時，將進行了 MMC處理的產(chǎn)物作為APC，進行T細胞 的再刺激。此外，從共培養(yǎng)開始14天后，此后將重組IL-2的添加濃度設(shè)為20U/ml而進行培 養(yǎng)。然后，通過離心分離等將共培養(yǎng)第21天的T細胞回收，供于以下所示的抗原特異性反應(yīng) 性的解析。
[0119] <利用細胞內(nèi)染色法(ICS)進行的T細胞的抗原特異性細胞因子產(chǎn)生的解析>
[0120] 將按照前述那樣誘導(dǎo)的T細胞(前述共培養(yǎng)第21天的T細胞)按照達到5 X104個細 胞/孔的方式，此外將自體DC按照達到5 X 103個細胞/孔的方式播種在96孔平板(BD生物科 學公司制）的同一孔內(nèi)。然后，在存在5yM的用于抗原特異性反應(yīng)性的解析的各多肽(HE4、 KE1、KE5、H/K-HELP1、H/K-HELP2或H/K-HELP3)的條件下進行培養(yǎng)。此外，制備不加多肽的組 作為對照組。
[0121] 細胞內(nèi)細胞因子染色法按照常規(guī)方法進行，首先在培養(yǎng)開始時加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制 劑(Brefeldin A)(西格瑪公司制)來抑制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運，使細胞因子在細胞內(nèi)蓄積。然 后，對于培養(yǎng)了 15~20小時的細胞，為了檢測CD4陽性T細胞，用抗CD4抗體和抗細胞因子抗 體進行染色，此外，為了檢測CD8陽性T細胞，用抗CD8抗體和抗細胞因子抗體進行染色，通過 流式細胞術(shù)進行解析。需要說明的是，使用FITC標記小鼠抗人CD4mAb作為抗CD4抗體，使用 PerCP-Cy7標記小鼠抗人IFN-ymAb作為抗細胞因子抗體，使用APC標記小鼠抗人⑶8mAb作 為抗CD8抗體。此外，測定中使用FACSCanto?II，解析中使用FACSDiva?6.1(均為BD生物科 學公司制）。
[0122] 然后，測定CD4陽性T細胞(Th細胞）中的抗原特異性IFN- y產(chǎn)生細胞的比率，在用 于解析抗原特異性反應(yīng)性的各多肽存在下的測定值中，選擇最高的比率。然后，將該比率為 對照組（多肽非添加組）的比率的2.5倍以上、且其差為2%以上的情況，評價為通過前述用 于誘導(dǎo)抗原特異性T細胞的多肽誘導(dǎo)出誘導(dǎo)了細胞因子產(chǎn)生的T細胞(抗原特異性T細胞）。 此外，還測定了CD8陽性T細胞(CTL)中的抗原特異性IFN- y產(chǎn)生細胞的比率，與前述CD4陽 性T細胞同樣地評價抗原特異性T細胞的誘導(dǎo)。獲得的結(jié)果示于表7。表7中，"+"表示確認誘 導(dǎo)出抗原特異性T細胞，表示未確認到抗原特異性T細胞的誘導(dǎo)。"誘導(dǎo)效率（％ )"表示能 夠由所提供的供體不同的6種PBMC誘導(dǎo)出抗原特異性T細胞的比率。此外，"最優(yōu)肽"是指各 PBMC中抗原特異性IFN-y產(chǎn)生細胞的比率最高(多肽添加組和多肽非添加組的抗原特異性 IFN-y產(chǎn)生細胞的比率之差最大）的用于誘導(dǎo)抗原特異性T細胞的多肽。進而，"最優(yōu)肽 (% )"表示在6種PBMC中被評價為前述最優(yōu)肽的比率。
[0123] [表 7]
[0125]如表7所示的結(jié)果所闡釋的，使用本發(fā)明的融合多肽的情況(實施例1~2)下，與將 構(gòu)成本發(fā)明的融合多肽的表位混合使用的情況(比較例1)相比，能夠?qū)碓床煌母喾N 的CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞進行刺激，誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞因子（IFN-y )的Thl細胞及CTL (參照表7 "誘導(dǎo)效率（％ )"的"CD4"及"CD8"）。進而，使用在輔助表位的兩側(cè)鍵合有殺傷表位 的本發(fā)明的融合多肽的情況(實施例2)下，與實施例1相比可知，能夠?qū)碓床煌母喾N 的CD4陽性T細胞進行刺激，誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞因子（IFN- y )的Th 1細胞（參照表7 "誘導(dǎo)效率 (% )"的"CD4"）。另一方面，使用鍵合有殺傷肽和輔助表位各1個的融合多肽的情況(比較例 2)下，誘導(dǎo)CD4陽性T細胞及CD8陽性T細胞中的抗原特異性T細胞的活性與比較例1沒有發(fā)生 變化(參照表7 "誘導(dǎo)效率（％ )"的"CD4"及"CD8"）。
[0126] 此外，如表7所示，可知使用本發(fā)明的融合多肽的情況(實施例1~2)下，與比較例1 及2相比，產(chǎn)生細胞因子的Thl細胞及CTL的誘導(dǎo)效率高，即強烈誘導(dǎo)了免疫應(yīng)答（參照表7 "最優(yōu)肽"）。進而可知:使用在輔助表位的兩側(cè)鍵合有殺傷表位的本發(fā)明的融合多肽的情況 (實施例2)下，與實施例1相比，也能夠?qū)碓床煌母喾N的CD4陽性T細胞及CD8陽性T細 胞進行刺激，誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞因子(IFN- y )的Thl細胞及CTL(參照表7"最優(yōu)肽（％ )"）。
[0127] 產(chǎn)業(yè)實用性
[0128] 如以上所說明，根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)碓床煌亩喾NT細胞進行刺激，對多種癌癥 強烈誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
[0129] 因此，通過將本發(fā)明的融合多肽、以及該融合多肽和樹突狀細胞施與對象，能夠?qū)?對象內(nèi)的T細胞進行刺激，強烈活化免疫應(yīng)答，因此作為癌癥的主動免疫療法用藥劑有用。 此外，由該融合多肽誘導(dǎo)的抗原特異性T細胞、及利用該融合多肽脈沖的抗原提呈細胞作為 被動免疫療法用藥劑或抗腫瘤劑有用。這些細胞優(yōu)選與該融合多肽一起使用。
[0130] 序列號：1
[0131] <223>人町1蛋白質(zhì)
[0132] 序列號:2
[0133] <223>輔助表位 1(HE1)
[0134] 序列號:3
[0135] <223>輔助表位 2(HE2)
[0136] 序列號:4
[0137] <223>輔助表位 3(HE3)
[0138] 序列號:5
[0139] <223>輔助表位 4(HE4)
[0140] 序列號:6
[0141] <223>輔助表位 5(HE5)
[0142] 序列號:7
[0143] <223>輔助表位 6(HE6)
[0144] 序列號:8
[0145] <223>輔助表位 7(HE7)
[0146] 序列號:9
[0147] <223>由在WT1蛋白質(zhì)的180~208位中、194位的精氨酸被置換為酪氨酸的氨基 酸序列構(gòu)成的輔助表位8(HE8)
[0148] 序列號：1〇
[0149] <223>輔助表位 9(HE9)
[0150] 序列號：11
[0151] <223>輔助表位 10(HE10)
[0152] 序列號：12
[0153] <223>輔助表位 ll(HEll)
[0154] 序列號:13
[0155] <223>輔助表位 12(HE12)
[0156] 序列號：14
[0157] <223>輔助表位 13(HE13) [0158] 序列號：15
[0159] <223>輔助表位 14(HE14)
[0160] 序列號：16
[0161] <223>輔助表位 15(HE15) [0162] 序列號：17
[0163] <223>輔助表位 16(HE16)
[0164] 序列號：18
[0165] <223>輔助表位 17(HE17)
[0166] 序列號：19
[0167] <223>輔助表位 18(HE18)
[0168] 序列號：20
[0169] <223>輔助表位 19(HE19) [0170] 序列號:21
[0171] <223>輔助表位 20(HE20)
[0172] 序列號:22
[0173] <223>輔助表位 21(HE21)
[0174] 序列號:23
[0175] <223>輔助表位 22(HE22)
[0176] 序列號：24
[0177] <223>輔助表位 23(HE23)
[0178] 序列號：25
[0179] <223>輔助表位 24(HE24)
[0180] 序列號：26
[0181] <223>輔助表位 25(HE25) [0182] 序列號:27
[0183] <223>輔助表位 26(HE26)
[0184] 序列號：28
[0185] <223>輔助表位 27(HE27)
[0186] 序列號:29
[0187] <223>輔助表位 28(HE28)
[0188] 序列號:30
[0189] <223>輔助表位 29(HE29) [0190] 序列號：31
[0191] <223>輔助表位 30(HE30)
[0192] 序列號:32
[0193] <223>輔助表位 31(HE：31)
[0194] 序列號：33
[0195] <223>輔助表位 32(HE32)
[0196] 序列號：34
[0197] <223>輔助表位 33(HE33)
[0198] 序列號：35
[0199] <223>輔助表位 34(HE34)
[0200] 序列號：36
[0201] <223>輔助表位 35(HE35)
[0202] 序列號：37
[0203] <223>輔助表位 36(HE36)
[0204] 序列號：38
[0205] <223>輔助表位 37(HE37)
[0206] 序列號：39
[0207] <223>輔助表位 38(HE38)
[0208] 序列號:40
[0209] <223>殺傷表位 1(KE1)
[0210] 序列號:41
[0211] <223>殺傷表位 2(KE2)
[0212] 序列號:42
[0213] <223>由在WT1蛋白質(zhì)的194~202位中、194位的精氨酸被置換為酪氨酸的氨基 酸序列構(gòu)成的殺傷表位3(KE3)
[0214] 序列號:43
[0215] <223>殺傷表位 4(KE4)
[0216] 序列號：44
[0217] <223>由在WT1蛋白質(zhì)的303~311位中、304位的甲硫氨酸被置換為酪氨酸的氨 基酸序列構(gòu)成的殺傷表位5(KE5)
[0218] 序列號：45
[0219] <223>殺傷表位 6(KE6)
[0220] 序列號:46
[0221] <223>WN末端起依次鍵合有HE4、由5個甘氨酸構(gòu)成的連接子和KE1的融合多肽
[0222] 序列號:47
[0223] <223>WN末端起依次鍵合有HE4、由5個甘氨酸構(gòu)成的連接子、KE1、由5個甘氨酸 構(gòu)成的連接多肽和KE5的融合多肽 [0224] 序列號：48
[0225] <223>WN末端起依次鍵合有KE1、由5個甘氨酸構(gòu)成的連接子、HE4、由5個甘氨酸 構(gòu)成的連接多肽和KE5的融合多肽
【主權(quán)項】
1. 一種多肽，其為含有來自WT1蛋白質(zhì)的輔助表位及來自WT1蛋白質(zhì)的殺傷表位的融合 多肽，在每1分子的該融合多肽中含有總計3~6個的所述輔助表位和所述殺傷表位。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中，在每1分子所述融合多肽中含有1個所述輔助表位 和2個所述殺傷表位。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其中，所述殺傷表位鍵合在所述輔助表位的兩側(cè)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的多肽，其中，所述輔助表位的氨基酸序列為選自 序列號:2~39中記載的氨基酸序列中的至少一種氨基酸序列，且所述殺傷表位的氨基酸序 列為選自序列號:40~45中記載的氨基酸序列中的至少一種氨基酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其中，所述輔助表位的氨基酸序列為序列號:5中記載的 氨基酸序列，且所述殺傷表位的氨基酸序列為序列號:40和/或44中記載的氨基酸序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽，所述輔助表位的氨基酸序列為序列號：5中記載的氨基 酸序列，鍵合在所述輔助表位的氨基末端側(cè)的所述殺傷表位的氨基酸序列為序列號:40中 記載的氨基酸序列，且鍵合在所述輔助表位的羧基末端側(cè)的所述殺傷表位的氨基酸序列為 序列號:44中記載的氨基酸序列。7. -種抗腫瘤劑，其含有權(quán)利要求1~6中任一項所述的多肽作為有效成分。8. 在體外制造針對表達WT1蛋白質(zhì)的腫瘤細胞而產(chǎn)生細胞因子的T細胞的方法，含有如 下工序： 培育權(quán)利要求1~6中任一項所述的多肽和單核細胞的工序、以及 培育所述所培育的單核細胞和抗原提呈細胞的工序。9. 一種抗腫瘤劑，其含有利用權(quán)利要求8所述的制造方法制造的T細胞作為有效成分。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗腫瘤劑，其還含有權(quán)利要求1~6中任一項所述的多肽。11. 一種抗腫瘤劑，其以權(quán)利要求1~6中任一項所述的多肽及抗原提呈細胞為有效成 分。12. -種抗腫瘤劑，其以通過權(quán)利要求1~6中任一項所述的多肽脈沖的抗原提呈細胞 為有效成分。
【文檔編號】C07K14/82GK106029699SQ201580010582
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年2月26日
【發(fā)明人】西村孝司, 平家勇司, 富樫裕二
【申請人】泰來有限公司