尿生物標志物群、基因表達特征及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明一般地涉及生物標志物分析領(lǐng)域，特別是測定來自尿樣品的基因表達特征。本公開內(nèi)容提供用于診斷男性受試者中的前列腺病癥例如前列腺癌的組合物、試劑盒和方法。
【專利說明】尿生物標志物群、基因表達特征及其使用方法
[0001] 相關(guān)申請 本申請要求于2013年8月6日提交的美國臨時申請?zhí)?1 /862，630的權(quán)益，所述臨時申請 的內(nèi)容通過引用以其整體結(jié)合到本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明一般地涉及生物標志物分析領(lǐng)域，特別是測定尿樣品的基因表達特征。 [0003] 背景 不斷增加的出現(xiàn)在癌細胞中的遺傳和表觀遺傳變化的知識提供了通過分析腫瘤相關(guān) 的核酸序列和概況來檢測、表征和監(jiān)測腫瘤的機會。這些變化可通過檢測多種癌相關(guān)生物 標志物中的任一個來觀察。多種分子診斷測定被用于檢測這些生物標志物并產(chǎn)生對患者、 醫(yī)生、臨床醫(yī)生和研究者有價值的信息。迄今為止，這些測定主要在衍生自外科手術(shù)切除的 腫瘤組織或通過活組織檢查獲得的組織的癌細胞上進行。
[0004] 然而，使用體液樣品進行這些檢驗的能力時常比使用患者組織樣品更合乎需要。 使用體液樣品的較小創(chuàng)傷方法在患者福利、進行縱向疾病監(jiān)測的能力和甚至在組織細胞不 易接近時獲得表達概況的能力方面具有廣泛的影響，例如，在前列腺中。對于這些樣品，先 前公開的采集方法常常需要直腸指檢(DRE)或前列腺按摩以使得足夠的前列腺衍生的細胞 液能夠進入尿。無DRE或前列腺按摩采集的樣品顯示對這些生物標志物較低的檢測率。
[0005] 因此，存在對新的、無創(chuàng)傷性的檢測生物標志物，例如，尿微泡中生物標志物的方 法的需求以幫助對前列腺疾病或其他醫(yī)療病況的診斷、預(yù)后、監(jiān)測或治療選擇。特別地，存 在對在尿樣品采集之前不需要DRE或前列腺按摩和不需要涉及從尿樣品分離細胞沉淀的樣 品制備步驟的非創(chuàng)傷性方法的需求。
[0006] 發(fā)明概述 本發(fā)明提供檢測尿微泡中的一種或多種生物標志物以幫助對受試者中的疾病，例如， 癌癥，特別是前列腺疾病或其他醫(yī)療病況的診斷、預(yù)后、監(jiān)測或治療選擇的方法。所述方法 包括從受試者獲得隨機尿樣品；從樣品中提取mRNA，檢測PCA3和ERG的mRNA表達水平;和將 PCA3和ERG的mRNA表達水平歸一化至KLK3或SPDEF。所述方法進一步包括使用預(yù)定的式計算 歸一化的PCA3和ERG的mRNA表達水平的輸出值;和比較輸出值與使用基于PCA3和ERG的組合 產(chǎn)生的R0C曲線測定的預(yù)定截斷值以區(qū)分處于高癌癥風險的受試者與具有低癌癥風險的受 試者。此外，這些方法允許鑒定相對于處于高GS前列腺癌的低風險的受試者，處于高 Gleason分數(shù)(GS)前列腺癌(例如，Gleason分數(shù)(GS) > 6)的高風險的受試者。例如，具有大 于，或在一些實施方案中等于用基于PCA3和ERG的組合產(chǎn)生的R0C曲線測定的預(yù)定截斷值的 輸出值的受試者處于高GS前列腺癌的高風險，而具有低于預(yù)定截斷值的輸出值的受試者處 于高GS前列腺癌的低風險。因此，這些方法可用于區(qū)分處于高GS前列腺癌的高風險的受試 者與處于高GS前列腺癌的低風險的受試者。
[0007] 本發(fā)明提供用于在有需要受試者中診斷、預(yù)后、監(jiān)測或治療選擇的方法，所述方法 由以下步驟組成：從受試者獲得隨機尿樣品；從樣品中提取一種或多種mRNA;檢測PCA3和 ERG的mRNA表達水平;和將PCA3和ERG的mRNA表達水平歸一化至參考基因；通過將歸一化的 PCA3和ERG的mRNA表達水平應(yīng)用到預(yù)定式計算輸出值;和比較輸出值與使用基于PCA3 mRNA 和ERG mRNA的組合產(chǎn)生的ROC曲線測定的預(yù)定截斷值以區(qū)分具有高癌癥復發(fā)風險的受試者 與具有低癌癥復發(fā)風險的受試者。
[0008] 本公開內(nèi)容的方法使用來自男性受試者的尿樣品，例如，在首段尿(first catch urine)的25-40 mL之間的樣品。本公開內(nèi)容的方法不需要直腸指檢(DRE)，并且優(yōu)選地，這 些方法中使用的尿樣品為來自未經(jīng)受DRE的患者的樣品。
[0009] 在一些實施方案中，檢測患者的PSA水平。在一些實施方案中，所述方法用于分析 來自處于具有在2-10 ng/mL之間的PSA水平的PSA"灰區(qū)（gray zone)"的患者的樣品。在一 些實施方案中，所述患者為至少50歲的人類男性受試者。
[0010] 在一些實施方案中，患者樣品使用以下算法分析：
在一些實施方案中，EX0106分數(shù)用于預(yù)測患者是否處于低前列腺癌風險或高前列腺癌 風險。例如，具有如使用上述算法所計算的小于10的EX0106分數(shù)的患者被鑒定為具有低前 列腺癌風險，具有為10或更高的EX0106分數(shù)的患者被鑒定為具有較高的前列腺癌風險。
[0011] 在一些實施方案中，EX0106分數(shù)用于預(yù)測患者是否處于高Gleason分數(shù)(GS)前列 腺癌的低風險或高GS前列腺癌的高風險。例如，具有如使用上述算法所計算的小于10的 EX0106分數(shù)的患者被鑒定為具有高GS前列腺癌的低風險，具有為10或更高的EX0106分數(shù)的 患者被鑒定為具有較高的高GS前列腺癌風險。
[0012] 在一些實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括從隨機尿樣品分離微泡部分和從微 泡部分提取核酸。
[0013] 在一些實施方案中，所述方法進一步包括檢測AMACR、BIRC5、H0XC6和/或SPARCL1 的表達水平。在一些實施方案中，所述方法進一步包括檢測六1^^811^5、11(^06和/或 SPARCL1的表達水平和計算基于PCA3、ERG和AMACR、BIRC5、H0XC6和/或SPARCL1組合的輸出 值。
[0014] 在任何前述的方法中，在核酸提取之前向尿樣品加入已知量的Q-P顆粒。檢測Q-0 靶基因的表達水平，并將檢測到的表達水平與已知的Q-0顆粒量比較。
[0015] 本發(fā)明提供用于受試者中醫(yī)療病況的診斷、預(yù)后、監(jiān)測或治療選擇的方法，所述方 法包括以下步驟：（a)從受試者尿樣品中獲得微泡部分；（b)從微泡部分提取一種或多種 核酸;和(c)分析所提取的核酸以檢測PCA3和ERG的存在、不存在或表達水平。這些標志物 在新鮮尿樣品以及先前冷凍并解凍的尿樣品中以穩(wěn)定水平可檢測。優(yōu)選地，尿樣品為40 mL 或20 mL。更優(yōu)選地，尿樣品為從膀胱排出的第一個40 mL或從膀胱排出的第一個20 mL。這 些標志物的檢測在來自相同患者的樣品中和來自不同患者的樣品中可重現(xiàn)。
[0016] 本發(fā)明還提供一種方法，其進一步包括檢測參考基因的表達水平和測定生物標志 物的歸一化的相對表達水平的步驟，其中所述生物標志物的相對表達水平為生物標志物表 達水平與參考基因表達水平的比率，并且其中當生物標志物的相對表達水平大于生物標志 物表達的截斷水平時，受試者被鑒定為患有或處于增加的醫(yī)療病況，例如癌癥的風險中。在 一些實施方案中，所述生物標志物為至少ERG和PCA3。在一些實施方案中，所述生物標志物 為至少ERG和PCA3以及至少一種選自六1^〇?、81此5、11(^06、3?41?(^1和其組合的其他生物標 志物。在一些實施方案中，所述參考基因為前列腺特異性基因。在一些實施方案中，所述參 考基因為KLK3或SPDEF，或其組合。在一些實施方案中，所述參考基因為KLK3。在一些實施方 案中，所述參考基因為管家基因，例如GAPDH。
[0017] 在一些實施方案中，衍生自每一生物標志物水平的受試者工作特征（Receiver Operator Characteristic，ROC)曲線或通過生物標志物組合所建立的分數(shù)的曲線下面積 (AUC)使用來自對照和疾病患者二者的生物標志物結(jié)果計算。在一些優(yōu)選的實施方案中，衍 生自每一生物標志物水平的R0C曲線或通過生物標志物組合所建立的分數(shù)的AUC值大于 0.5、0.6、0.7或0.8。優(yōu)選地，AUC值大于0.7。通過實施考慮臨床應(yīng)用所必需的靈敏度、特異 性、陰性預(yù)測值(NPV)、陽性預(yù)測值(PPV)、陽性似然比（PLR)和陰性似然比（NLR)的截斷分 析，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地能夠最大化生物標志物水平或生物標志物組合的診斷準確 度。生物標志物結(jié)果或生物標志物結(jié)果的組合以多種方法中的任一種分析。在一些實施方 案中，結(jié)果使用單變化的或單變量分析(SV)分析。在一些實施方案中，結(jié)果使用多變量分析 (MV)分析。生物標志物和/或生物標志物群的SV和MV分析的實例在下表中示出。
[0018] 在一些實施方案中，所述參考基因為前列腺特異性基因。在一些實施方案中，參考 基因為KLK3或SPDEF，或其組合。在一些實施方案中，參考基因為管家基因，例如GAPDH。
[0019] 生物標志物和生物標志物組合(本文中也稱為生物標志物群）可用于醫(yī)療病況例 如，癌癥，包括侵襲性癌癥的診斷、預(yù)后、監(jiān)測或治療選擇的方法中。在一些實施方案中，生 物標志物和生物標志物組合可用于基于所檢測的表達水平和/或表達模式，關(guān)聯(lián)生物標志 物和/或群表達與受試者患有侵襲性癌癥或處于患侵襲性癌癥風險中的可能性。在一些實 施方案中，生物標志物和生物標志物組合可用于基于所檢測的表達水平和/或表達模式，關(guān) 聯(lián)生物標志物和/或群表達與受試者患有癌癥復發(fā)或處于患癌癥復發(fā)風險中的可能性。在 一些實施方案中，生物標志物和生物標志物組合可用于基于所檢測的表達水平和/或表達 模式，關(guān)聯(lián)生物標志物和/或群表達與受試者患有侵襲性前列腺癌或處于患侵襲性前列腺 癌風險中的可能性。生物標志物和生物標志物組合可用于關(guān)聯(lián)生物標志物和/或群表達與 受試者的Gleason分數(shù)。例如，生物標志物和/或群表達水平可用于基于所檢測的表達水平 和/或表達模式鑒定受試者的Gleason分數(shù)。例如，PCA3和ERG的表達水平可用于鑒定受試者 的Gleason分數(shù)大于6。生物標志物和生物標志物組合可用于基于所檢測的表達水平和/或 表達模式，關(guān)聯(lián)生物標志物和/或群表達與受試者將需要根治性前列腺切除術(shù)的可能性。
[0020] 在一些實施方案中，所述醫(yī)療病況為癌癥。例如，所述癌癥為前列腺癌。在一些實 施方案中，所述癌癥為泌尿生殖器癌癥，例如，前列腺癌、腎癌、膀胱癌或擴散到泌尿生殖器 的轉(zhuǎn)移性癌癥。在一些實施方案中，所述癌癥為侵襲性癌癥。例如，在一些實施方案中，所述 醫(yī)療病況為侵襲性前列腺癌、侵襲性腎癌或侵襲性膀胱癌。
[0021] 有需要的受試者患有癌癥例如，侵襲性癌癥或處于患癌癥，例如，侵襲性癌癥的風 險中。在一些實施方案中，所述受試者患有前列腺癌或處于患前列腺癌的風險中。在一些實 施方案中，所述受試者沒有患前列腺癌的風險。在一些實施方案中，所述受試者具有前列腺 癌并且已被指定具體的Gleason分數(shù)。例如，在一些實施方案中，受試者已被指定大于或等 于7的Gleason分數(shù)。在一些實施方案中，所述受試者已被指定大于或等于1、2、3、4、5、6、7、8 或9的Gleason分數(shù)。在一些實施方案中，受試者已被指定在1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1_ 4、1-3、卜2、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-10、 4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-10、6-9、6-8、6-7、7-10、7-9、7-8、8-10、 8-9或9-10范圍內(nèi)的Gleason分數(shù)。在一些實施方案中，受試者已經(jīng)歷前列腺切除術(shù)，例如， 根治性前列腺切除術(shù)或處于必須經(jīng)歷前列腺切除術(shù)，例如，根治性前列腺切除術(shù)的風險中。
[0022] 所述受試者為，例如，基于PSA檢驗結(jié)果和/或可疑DRE，例如，臨床疑似前列腺癌的 男性人類受試者。在一些實施方案中，受試者具有陰性活組織檢查的臨床史。在一些實施方 案中，受試者無陰性活組織檢查的臨床史。在一些實施方案中，受試者已被建議進行重復活 組織檢查。在一些實施方案中，受試者已被建議進行初次或第一次活組織檢查。
[0023] 在一些實施方案中，受試者已被建議或安排前列腺切除術(shù)。在一些實施方案中，所 述受試者已在組織學上證實腺泡型（即典型的）前列腺癌。在一些實施方案中，前列腺癌為 局部的。在一些實施方案中，前列腺癌為局部晚期。
[0024] 在一些實施方案中，所述受試者未患和/或不疑似患有諸如傳染性疾病的疾病，例 如，肝炎(所有類型)和/或HIV。在一些實施方案中，受試者無并發(fā)性腎和/或膀胱腫瘤史。在 一些實施方案中，受試者先前沒有接受或沒有同時接受任何形式的對前列腺癌的新輔助或 定向治療(focal therapy)。在一些實施方案中，所述受試者在提供尿樣品的六個月內(nèi)先前 沒有接受或沒有同時接受任何形式的新輔助或定向治療，包括雄激素衍生治療(androgen derivation therapy)〇
[0025] 本文所述的標志物和/或標志物組合可用于多種試劑盒，例如，可用于檢驗來自各 種患者的尿樣品的診斷試劑盒。在一些實施方案中，在用試劑盒檢驗樣品之前，例如使用過 濾濃縮步驟，濃縮尿樣品。結(jié)果可使用多種方法的任一種處理，包括快速qPCR讀出裝置。
[0026] 附圖簡述 圖1A和1B為描繪患者群7樣品分析的實驗室工作流程第一天（圖1A)和第二天（圖1B)的 一系列示意圖。
[0027]圖2A為描繪對于258個群7樣品檢測的郎Ct值的密度分布的圖。Y軸代表密度，X軸 代表Ct值。
[0028]圖2B為描繪對于258個群7樣品檢測的卯Ct值的密度分布的盒形圖。X軸代表Ct 值。
[0029] 圖3A和3B為描繪對于群7中每一患者當歸一化至KLK3時PCA3 AUC值與樣品體積的 相關(guān)性的兩個圖。在圖3A中，Y軸代表AUC值并且X軸代表群7中的每一樣品。在圖3B中，Y軸顯 示樣品體積并且X軸代表群7中的每一樣品。圖例指示每一樣品來自的臨床地點。圖3A和3B 表明當將供給體積限制于僅20 mL時，PCA3 AUC (歸一化至KLK3)從〈0.65提高至>0.7。這些 圖表明AUC高度依賴于樣品體積。
[0030]圖4A和4B為描繪對于來自患者群7的其中樣品體積小于或等于100 mL的樣品（N= 236)，基于歸一化至KLK3的ERG表達分析(非估算的，圖4A)和歸一化至KLK3的PCA3表達分析 (圖4B)的R0C曲線的兩個圖。在兩個圖中，X軸代表特異性;Y軸代表靈敏度。
[0031]圖5A和5B為描繪對于來自患者群7的其中樣品體積小于或等于40 mL的樣品（N= 189)，基于歸一化至KLK3的ERG表達分析(非估算的，圖5A)和歸一化至KLK3的PCA3表達分析 (圖5B)的R0C曲線的兩個圖。在兩個圖中，X軸代表特異性;Y軸代表靈敏度。
[0032]圖6A和6B為描繪對于來自患者群7的其中樣品體積小于或等于20 mL的樣品（N= 122)，基于歸一化至KLK3的ERG表達分析(非估算的，圖6A)和歸一化至KLK3的PCA3表達分析 (圖6B)的ROC曲線的兩個圖。在兩個圖中，X軸代表特異性;Y軸代表靈敏度。
[0033]圖7為描繪對于來自患者群7的其中樣品體積小于或等于100 mL的樣品（N=236)， 基于歸一化至KLK3的ERG和PCA3表達分析的ROC曲線的圖。ERG表達分析為估算的。X軸代表 特異性;Y軸代表靈敏度。
[0034]圖8為描繪對于來自患者群7的其中樣品體積小于或等于40 mL的樣品(N=189)，基 于歸一化至KLK3的ERG和PCA3表達分析的R0C曲線的圖。ERG表達分析為估算的。X軸代表特 異性;Y軸代表靈敏度。
[0035]圖9為描繪對于來自患者群7的其中樣品體積小于或等于20 mL的樣品(N=122)，基 于歸一化至KLK3的ERG和PCA3表達分析的R0C曲線的圖。ERG表達分析為估算的。X軸代表特 異性;Y軸代表靈敏度。
[0036]圖10為一系列顯示使用應(yīng)用于先前的群5數(shù)據(jù)的預(yù)定公式和模型截斷閾值的群7 數(shù)據(jù)的2x2分析的四個表。（Sens =靈敏度;Spec =特異性;NPV =陰性預(yù)測值;PPV =陽性預(yù) 測值;C5 =群5; C7 =群7)。盡管C5與C7之間，例如，提取方案方法和探針化學有一些變化，當 應(yīng)用于C7時擬合至C5數(shù)據(jù)的權(quán)重(Weights)表現(xiàn)良好。C5群體積一般小于C6中的，具有更多 的40 mL體積樣品。
[0037] 圖11為顯示每一樣品組(German池=對照池樣品，患者=群7患者，參考=參考對照 和RT-對照=反轉(zhuǎn)錄對照）中所檢測基因（AMACR、BIRC5、ERG、H0XC6、KLK3、PCA4、QBETA、 SPARCL1和SPDEF)的Ct值分布的盒形圖。
[0038] 圖12為比較通過小體積（20 mL)樣品中每一指示基因（PCA3、ERG、AMACR、BIRC5、 H0XC6、SPARCL1和SPDEF)的單變量分析產(chǎn)生的AUC值和所有樣品的AUC值的圖。CI所有和CI 20 mL分別指示對于"所有樣品"和"20 mL樣品"的AUC的95%置信區(qū)間。Y軸代表AUC值;X軸代 表每一檢驗基因。
[0039] 圖 13為顯示通過每一指示基因（AMACR、BIRC5、ERG、HOXC6、KLK3、PCA3、SPARCL0P SPDEF)的單變量分析產(chǎn)生的AUC值和比較下列亞群之間的AUC值的圖：歸一化至SPDEF或 KLK3;估算并歸一化至SPDEF或KLK3;所有樣品體積與小體積樣品；和拷貝數(shù)與Ct值。
[0040] 圖14為顯示通過三基因分析比較群5 (C5)和群7 (C7)的分析的兩個圖。左圖顯示 對于所有樣品C5和C7的比較。右圖顯示C5和C7小體積樣品的比較。FT0 =不使用PCA3的3基 因模型。FT0指不使用PCA3的3基因模型。
[0041]圖15為顯示通過下列基因的指定組合的三基因模型分析產(chǎn)生的AUC值:AMACR、 BIRC5、ERG、H0XC6、KLK3、PCA3、SPARCL1和SPDEF;和比較下列亞群之間的AUC值的圖：歸一化 至SPDEF或KLK3;估算并歸一化至SPDEF或KLK3;所有樣品體積與小體積樣品；和拷貝數(shù)與Ct 值。
[0042] 圖16為描繪其中n = 453個樣品，PSA中值=5.3 ng/mL和80%的樣品2〈 PSA〈 10 ng/mL的患者群中示例性EX0106分數(shù)分布的圖。
[0043]圖17為描繪與護理標準（S0C)治療的AUC相比具有任何Gleason分數(shù)的患者的 EX0106表現(xiàn)的AUC的圖。
[0044] 圖18A和18B為通過四分位數(shù)描繪EX0106表現(xiàn)，即通過EX0106分數(shù)四分位數(shù)通過活 組織檢查鑒定為陽性的樣品百分數(shù)的一系列圖。
[0045]圖19為描繪EX0106分數(shù)對于高級別前列腺癌，例如，Gleason分數(shù)大于6的表現(xiàn)的 圖。
[0046]圖20為描繪基于Gleason分數(shù)亞群的EX0106分數(shù)表現(xiàn)的統(tǒng)計分析的圖。
[0047]發(fā)明詳述 癌-相關(guān)的生物標志物包括，例如，基因序列中的特異性突變(Cortez和Cal in, 2009; Diehl等人，2008; Network, 2008; Parsons等人，2008)，mRNA和miRNA表達的上調(diào)和下 調(diào)（Cortez和Calin, 2009; Itadani等人，2008; Novakova等人，2009)，mRNA剪接變異， DNA甲基化模式中的變化(Cadieux等人，2006; Kristensen和Hansen, 2009)，基因組區(qū)的 擴增和缺失(Cowell和Lo, 2009)，以及重復DNA序列的異常表達(Ting等人，2011)。各種分 子診斷測定例如突變分析，基因組DNA甲基化狀態(tài)和基因表達分析可檢測這些生物標志物 并產(chǎn)生對患者、醫(yī)生、臨床醫(yī)生和研究者有價值的信息。迄今為止，這些測定主要在衍生自 外科手術(shù)切除的腫瘤組織或活組織檢查獲得的組織的癌細胞上實施。例如，PCA3、TMPRSS2: ERG和ERG先前已通過活組織檢查分析顯示與正常前列腺組織相比在前列腺癌中差異表達 (Bussemakers等人，1999; Petrovics等人，2005; Tomlins等人，2005)。
[0048]然而，使用體液樣品進行這些檢驗的能力時常比使用患者組織樣品更合乎需要。 使用體液樣品的較小創(chuàng)傷方法在患者福利、進行縱向疾病監(jiān)測的能力和甚至當組織細胞不 易接觸時獲得表達概況的能力方面具有廣泛的影響，例如，在前列腺中。
[0049] 使用尿樣品檢測前列腺癌標志物例如PSA (也稱為KLK3)、PCA3、TMPRSS2:ERG和 ERG先前已有研究（Hessels等人，2007; Laxman等人，2008; Laxman等人，2006; Nguyen 等人，2011; Rice等人，2010; Rostad等人，2009; Salami等人，2011; Tomlins等人， 2005)。然而，先前公開的樣品采集方法需要直腸指檢(DRE)或前列腺按摩以使得足夠的前 列腺衍生的細胞液能夠進入尿。無DRE或前列腺按摩采集的樣品顯示對這些生物標志物較 低的檢測率。例如，用D R E時對T M P R S S 2 : E R G的檢測率為約6 9 %，但無D R E時僅為約2 4 % (Rostad等人，2009)。
[0050]實際上，目前用于前列腺癌生物標志物的尿分析的樣品采集方法需要使用DRE，并 在前列腺的整個觸診表面系統(tǒng)應(yīng)用輕微指壓，伴隨每一側(cè)葉3次掃描的指壓前列腺，從每葉 的底部到頂部和從側(cè)面到中線用力擠壓前列腺，或從每葉的底部到頂部和從側(cè)面到中線 (其中前列腺表面的凹陷在0.5到1 cm之間）用力擠壓前列腺三次（Deras等人，2008; Hessels等人，2007; Laxman等人，2008; Laxman等人，2006; Nguyen等人，2011; Rice 等人，2010; Salami等人，2011)。
[0051]另外，先前公開的樣品制備方法需要通過離心從DRE之后的尿樣品中分離細胞沉 淀（Hessels等人，2007; Laxman等人，2008; Laxman等人，2006; Nguyen等人，2011; Rostad等人，2009; Salami等人，2011)。
[0052]許多先前研究提示在使得能夠采集足夠RNA材料用于無創(chuàng)傷性前列腺基因分析中 DRE為關(guān)鍵步驟(Deras等人，2008; Hessels等人，2007; Laxman等人，2008; Laxman等 人，2006; Nguyen等人，2011; Rice等人，2010; Rostad等人，2009; Salami等人， 2011; Tomlins等人，2011)。在這些研究的一些中，尿樣品需要在采集4小時內(nèi)處理(Deras 等人，2008; Tomlins等人，2011)。
[0053]與這些先前的樣品采集和尿生物標志物檢測方法相比，本文提供的方法在尿樣品 采集之前不需要DRE或前列腺按摩，這些方法也不需要涉及從尿樣品中分離細胞沉淀的樣 品制備步驟。這些新的、非創(chuàng)傷性方法使用尿微泡檢測生物標志物以幫助前列腺疾病或其 他醫(yī)療病況的診斷、預(yù)后、監(jiān)測或治療選擇。腫瘤細胞釋放的微泡可用于測定腫瘤的基因狀 態(tài)（Skog等人，2008)。還參見WO 2009/100029、W0 2011/009104、W0 2011/031892和W0 2011/031877。
[0054]微泡從真核細胞脫落或從質(zhì)膜出芽，至細胞外。這些膜囊泡大小不均一，直徑范圍 從約10 nm到約5000 nm。細胞脫落的直徑小于0.8 ym的所有膜囊泡在本文中共同稱為"微 泡"。
[0055] 本發(fā)明基于尿微泡包含受試者前列腺疾病或其他醫(yī)療病況的生物標志物這一出 乎意料的發(fā)現(xiàn)。因此，可測定患者尿樣品用于檢測受試者中前列腺疾病或其他醫(yī)療病況的 生物標志物。
[0056] 在本文所提供的方法中，采集受試者的隨機尿樣品而在尿采集之前不使用直腸指 檢(DRE)或前列腺按摩。所述尿樣品為60 mL、50 mL、40 mL、30 mL、20 mL、15 mL或10 mL。在 一些優(yōu)選的實施方案中，所述尿樣品為40 mL或20 mL。在一些實施方案中，所述尿樣品可為 1- 40 mL、l_35 mL、l_30 mL、l_25 mL、1_20 mL、1_15 mL、1_10 mL、1_5 mL、5_40 mL、5_35 mL、5_30 mL、5_25 mL、5_20 mL、5_15 mL、5_10 mL、10_40 mL、10_35 mL、10_30 mL、10_25 mL、10_20 mL、10_15 mL、15_40 mL、15_35 mL、15_30 mL、15_25 mL、15_20 mL、20_40 mL、 20-35 mL、20_30 mL、20_25 mL、25_40 mL、25_35 mL、25_30 mL、30_40 mL、30_35 mL或35-40 mL〇
[0057] 在一個優(yōu)選的實施方案中，所述尿樣品為第一次從膀胱中排出的尿，也被稱為"首 段(first catch)"尿。第一次排出的尿包含最高濃度的前列腺-衍生微泡，因此分析第一次 排出的尿提供更高的前列腺生物標志物信號。如本文所示，可用于前列腺癌診斷和預(yù)后的 生物標志物的診斷準確度隨著第一次排出的尿樣品的樣品體積的減小而增加。本文所述的 發(fā)現(xiàn)表明第一次排出的40 mL或20 mL尿顯示較高的診斷準確度（即AUC值）。因此，在一個優(yōu) 選的實施方案中，所述尿樣品為從膀胱排出的第一個40 mL或更少。例如，尿樣品為從膀胱 排出的第一個20 mL。
[0058] 不適合用于本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法的尿樣品包括其中樣品沒有恰當?shù)乇?存和/或運送的樣品。例如，試樣不應(yīng)長時間保持在室溫(例如，15-25 °C)。在一些實施方案 中，試樣不應(yīng)保持在室溫(例如，15-25 °C )超過24小時。在一些實施方案中，試樣不應(yīng)保持 在室溫(例如，15-25 °C)超過36小時。在一些實施方案中，試樣不應(yīng)保持在室溫(例如，15-25 °C )超過48小時。試樣不應(yīng)長時間保持在冷藏溫度(例如，2-8 °C )。例如，試樣不應(yīng)保持 在冷藏溫度(例如，2-8 °C)超過21天。在一些實施方案中，試樣不應(yīng)保持在冷藏溫度(例如， 2- 8 °C)超過30天。通常，試樣可無限期地冷凍（例如，< 70 °C)。如果試樣是冷凍的，則試 樣應(yīng)該在冰袋或干冰上運送。
[0059] 不適合用于本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法的尿樣品包括嚴重染血的試樣。
[0060] 采集尿樣品的時間選擇也可根據(jù)不同的應(yīng)用而不同。樣品可作為現(xiàn)場尿樣品 (spot urine sample)在任何時間采集。當微泡中待分析的生物標志物的量在一天中無太 大波動時，現(xiàn)場尿可足以用于生物標志物分析。在其他情況下，當微泡中待分析的生物標志 物的量存在波動時，米集24-小時尿樣品，并且24-小時米集可減輕波動效應(yīng)。在又進一步的 情況下，采集一系列尿樣品以研究微泡中生物標志物的量的波動。采集系列可以以一定的 時間間隔，例如，每六小時，或以情景間隔，例如，在治療干預(yù)之前和之后進行。
[0061]在本文提供的方法中，尿樣品首先通過使用包括至少一個過濾步驟的方法進行預(yù) 處理。例如，利用粗過濾器(0.8微米)去除細胞和細胞碎片。此過濾可隨后是超濾步驟以去 除溶劑和小分子分析物而保留微泡。初次過濾中使用的濾器可為足以去除細胞和細胞碎片 的任何尺寸，例如，大于0.22微米的任何尺寸。為了分離尿微泡，預(yù)處理的樣品接著經(jīng)受過 濾濃縮步驟，其中利用具有截留分子量的濾器以保留和濃縮直徑大于10 nm的微泡。例如， 樣品接著濃縮至小于1 mL，優(yōu)選100-200 yL的體積。例如，截留分子量至少為100 kDa。 [0062] 在一些實施方案中，用于預(yù)處理和處理尿樣品的方法包括下列步驟。首先，使用 0.8 ym濾器處理一部分尿樣品，例如，至少20 mL。例如，當樣品體積< 50 mL時，將至少20 mL吸入附著在0.8 ym濾器上的注射器中，然后擠壓入干凈容器，例如，干凈的50 mL管中。當 樣品尿體積多50 mL，樣品使用0.8 ym瓶式濾器單元過濾，并且在一些實施方案中，使用抽 吸裝置吸取樣品通過瓶式濾器單元。然后，不管初始樣品體積如何，干凈容器中的過濾尿隨 后經(jīng)受脈沖渦旋幾秒鐘，例如，1-2秒。然后存儲過濾尿直至準準備好開始過濾濃縮。
[0063] 一部分過濾的尿，例如，15 mL，然后使用過濾濃縮器(FC)處理。一旦將過濾的尿吸 入FC室（即FC容器頂部的室）中，可以合適的濃度加入內(nèi)部對照，例如，Q0噬菌體內(nèi)部對照 (Attostar，Catalog #BAC200)。然后，例如，在吊桶式轉(zhuǎn)頭離心機中離心FC容器，并且在室 溫(例如，20-25 °C)以4,500 x g離心5分鐘。如果樣品過濾不完全(在FC中剩余>500 yL保 留物），然后FC應(yīng)該再次離心2-5分鐘。顯示最小過濾跡象(在FC中剩余>10 mL保留物）的樣 品應(yīng)丟棄。
[0064]然后從離心機中移走樣品，并丟棄濾液（即FC容器底部的液體）。然后用5 mL剩余 的過濾尿和10 mL IX PBS重懸保留物。例如，通過將FC容器倒轉(zhuǎn)3-4次將樣品混合均勻。然 后，例如，在吊桶式轉(zhuǎn)頭離心機中離心FC容器，并且在室溫(例如，20-25 °C)以4,500 x g離 心5分鐘。然后從離心機中移走樣品，并丟棄濾液。
[0065]在第一個洗滌步驟中，將保留物重懸在15 mL IX PBS中。例如，通過將FC容器倒轉(zhuǎn) 3-4次將樣品混合均勻。然后，例如，在吊桶式轉(zhuǎn)頭離心機中離心FC容器，并且在室溫(例如， 20-25 °C)以4,500 x g離心5分鐘。
[0066]在第二個洗滌步驟中，將保留物重懸在15 mL IX PBS中。例如，通過將FC容器倒轉(zhuǎn) 3-4次將樣品混合均勻。然后，例如，在吊桶式轉(zhuǎn)頭離心機中離心FC容器，并且在室溫(例如， 20-25 °C)以4,500 x g離心7分鐘。預(yù)期的保留體積為100-200 yL。如果樣品體積大于250 yL，然后將FC容器在RT下以4,500 x g另外離心5分鐘。
[0067] 分離和濃縮尿微泡之后，樣品用RNA酶抑制劑預(yù)處理，然后提取核酸，以防止消化 提取的RNA并提高提取的質(zhì)量。任選地，樣品可使用合適的緩沖液洗滌至少一次以進一步富 集或純化微泡部分。在一些實施方案中，樣品使用合適的緩沖液洗滌兩次以進一步富集或 純化微泡部分。通過包括裂解微泡、處理裂解物通過RNA-結(jié)合柱和從RNA-結(jié)合柱上洗脫RNA 的方法在設(shè)計為獲得高質(zhì)量的RNA制備物的適當條件下從微泡中提取RNA。任選地，在預(yù)處 理步驟中使用的濾器上裂解濃縮的微泡。這些高質(zhì)量的RNA制備物為前列腺癌和其他前列 腺病癥提供基于尿的分子診斷。
[0068] 在一些實施方案中，向FC容器的上室中加入4 yL RNA酶抑制劑。然后橫向振動容 器以確保RNA酶抑制劑懸浮良好。然后樣品用RNA酶抑制劑室溫(例如，15-25 °C)孵育2-3分 鐘。然后以250 y 1的體積向每個樣品中加入RNA裂解緩沖液，例如，包含2% 1-硫代甘油的 Promega RNA Lysis Buffer (Catalog #Z3051)。然后短暫禍旋樣品，并在室溫下孵育1分 鐘。
[0069] 然后將移液器置于FC容器底部(注意不要接觸或刮擦到容器或濾器的側(cè)面），并將 150 yl溶液（即樣品+RNA酶抑制劑)轉(zhuǎn)移到2 mL無RNA酶的管中。重復這一步驟直到所有的 樣品移走并轉(zhuǎn)移到2 mL無RNA酶的管中。分離的微泡部分然后可供核酸提取，例如，RNA提 取。
[0070] 然后向2 mL管中加入150 yl體積的異丙醇，并通過移液器混合溶液。將裂解物轉(zhuǎn) 移至提取柱，并將提取柱以13,000 x g離心30秒。然后將提取柱轉(zhuǎn)移至新的收集管中，以 13,000 x g離心30秒并重復從提取柱轉(zhuǎn)移至新的收集管直到所有的裂解物已轉(zhuǎn)移。然后向 收集管中加入5〇〇 yl體積的來自Promega的RNA Wash Solution (RWA Buffer) (Catalog #Z309B-C)，并以13,000 x g將管離心30秒。然后將樣品轉(zhuǎn)移至新的收集管，向收集管中加 入300 yl RWA Buffer，然后將收集管以13,000 x g離心2分鐘。接著將樣品轉(zhuǎn)移至新的收 集管，然后以13，000 x g離心收集管2分鐘。接著將收集管的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到無RNA酶DNA酶的 1.5 mL Eppendorf? 管中。然后使用 16 yl無核酸酶水，例如，Promega Nuclease-Free Water (Catalog #P119E)洗脫管的內(nèi)含物，并以13,000 x g離心1分鐘。
[0071] 從微泡部分中提取的RNA然后可在超低溫冰箱中< -70 °C保存。
[0072] 本文所述方法可包括使用對照顆粒以測定或評估微泡分離和/或微泡核酸提取的 品質(zhì)。對照顆粒統(tǒng)一指在微泡分離或核酸提取過程期間某一時刻加入的微泡大小范圍的顆 粒，其中所述顆粒包含對照核酸，例如DNA或RNA。特別地，對照核酸包含至少一種用于在分 離或提取過程期間測定對照顆粒回收的量的待測定或測量的靶基因。
[0073] 優(yōu)選地，對照顆粒為Q-0噬菌體，本文中稱為"Q-0顆粒"。本文所述方法中使用的Q-0顆?？蔀樘烊淮嬖诘牟《绢w?；蚩蔀槠渲胁《绢w粒的至少一個組分(例如，基因組或外殼 蛋白部分)通過本領(lǐng)域已知的重組DNA或分子生物學技術(shù)合成的重組或經(jīng)工程改造的病毒。 Q-0為光滑病毒科家族的成員，特征在于由編碼四種病毒蛋白：外殼蛋白、成熟蛋白、裂解蛋 白和RNA復制酶的3種基因組成的線性、單鏈RNA基因組。由于其與平均微泡大小相似，Q-P可 使用用于分離微泡的同種純化方法從生物樣品中容易地純化，如本文所描述的。此外，Q-0 病毒單鏈基因結(jié)構(gòu)的低復雜性有利于其在基于擴增的核酸測定中用作對照。Q-0顆粒包含 用于定量樣品中Q-0顆粒的量的待檢測或測量的對照靶基因或?qū)φ瞻行蛄?。例如，對照靶?因為Q-0外殼蛋白基因。將Q-0顆粒加入尿樣品或分離的尿-衍生微泡后，Q-0顆粒的核酸與 來自微泡和/或尿樣品的核酸使用本文所述提取方法一起提取。Q-0對照靶基因的檢測可通 過RT-PCR分析，例如，與目的生物標志物（即BIRC5、ERG和SPARCL1)同時測定。對照靶基因10 倍稀釋的至少2、3或4個已知濃度的標準曲線可用于測定拷貝數(shù)?？杀容^所檢測到的拷貝數(shù) 和所加入Q-0顆粒的量以測定分離和/或提取過程的品質(zhì)。
[0074]在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法使用包括SEQ ID NO: 1的核 酸序列的至少一部分例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個 核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250 個核苷酸、至少300個核苷酸、至少350個核苷酸、至少400個核苷酸、至少450個核苷酸和/或 至少500個核苷酸或更多的Q-f3顆粒： 在一些實施方案中，Q-0顆粒在核酸提取之前加入尿樣品中。例如，Q-0顆粒在超濾之前 和/或預(yù)過濾步驟之后加入尿樣品中。
[0075]在一些實施方案中，向尿樣品中加入50、100、150、200、250、300、350、400、450、 500、1，000或5，000拷貝的Q-f3顆粒。在一些實施方案中，向尿樣品中加入100拷貝的Q-f3顆 粒。Q-0顆粒的拷貝數(shù)可基于Q-0噬菌體感染靶細胞的能力來計算。因此，Q-0顆粒的拷貝數(shù) 與Q-0噬菌體的集落形成單位有關(guān)。
[0076]本文所提供方法可用于，例如，由于升高的PSA、可疑的DRE或任何其他本領(lǐng)域公認 的前列腺癌診斷技術(shù)而疑似具有前列腺癌的受試者。在一些實施方案中，本文所提供的方 法可用于無任何先前診斷檢驗，例如，PSA檢驗、DRE或任何其他本領(lǐng)域公認的前列腺癌診斷 技術(shù)的受試者。
[0077]本文所提供的方法證明了尿微泡中生物標志物與如通過前列腺活組織檢查測定 的前列腺癌的發(fā)現(xiàn)的關(guān)聯(lián)。前列腺活組織檢查為用于前列腺癌診斷的現(xiàn)行標準，但是與前 列腺活組織檢查相關(guān)的風險是顯著的，特別是當考慮到在美國每年實施一百萬次活組織檢 查。疼痛、出血、尿潴留和尿路感染并非不常見，并且還可出現(xiàn)嚴重威脅生命的感染。
[0078] 本文所述的方法提供尿樣品或尿微泡中癌癥-相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的RNA表達水平的非創(chuàng) 傷性分析的方法。特別地，所述方法用于檢測尿樣品中至少PCA3和ERG的mRNA表達。ERG mRNA可包括一種或多種ERG同種型，包括ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG7、ERG8、 ERG9、ERG前列腺癌特異性同種型1 (EPC1)和ERG前列腺癌特異性同種型2 (EPC2)。如本文 所證明的，檢測尿微泡中PCA3和ERG的表達水平在先前經(jīng)受前列腺活組織檢查的受試者(本 文中稱為活組織檢查群或患者群）中作為前列腺癌和其他前列腺-相關(guān)病癥的生物標志物 提供極好的靈敏度和特異性。在一些實施方案中，組合檢測2、3、4、5、6、7、8、9或10種或更多 種生物標志物。
[0079] 在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測具有下列核酸序列 的至少一部分例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、 至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸和/或至少250個 核苷酸或更多的ERG mRNA:
(SEQ ID NO: 2) 如本文所顯示的，PCA3和ERG通過單變量分析來分析，并且表明每一基因單獨（當歸一 化至參考基因例如KLK3)具有高診斷準確度(AUC值大于0.6)。本文所公開的分析顯示當一 起測定二者的歸一化表達水平時，PCA3和ERG具有比單獨測定時更大的診斷價值。
[0080]在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測具有以下核酸序列 的至少一部分例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、 至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷 酸、至少300個核苷酸、至少350個核苷酸、至少400個核苷酸和/或至少450個核苷酸或更多 的PCA3 mRNA:
在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測具有SEQ ID NO: 2的核 酸序列的至少一部分，例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個 核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸和/或至 少250個核苷酸或更多的ERG mRNA，以及具有SEQ ID N0: 3的核酸序列的至少一部分，例 如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷 酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個 核苷酸、至少350個核苷酸、至少400個核苷酸和/或至少450個核苷酸或更多的PCA3 mRNA。 [00811在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測具有SEQ ID NO: 2 的全長核酸序列的ERG mRNA和具有SEQ ID NO: 3的全長核酸序列的PCA3 mRNA。
[0082] 額外的生物標志物組合可與PCA3和ERG-起使用，其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或 更多個額外的基因作為癌癥，例如侵襲性癌癥或前列腺癌的生物標志物可具有高診斷價 值。這些額外基因的實例包括AMACR、BIRC5、H0XC6和SPARCL1。
[0083]在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測具有SEQ ID N0: 4、 SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38的核酸序列的至少一部分，例如，至少10個核苷酸、至少20 個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150 個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個核苷酸、至少350個核苷酸、至少 400個核苷酸、至少450個核苷酸和/或至少500個核苷酸或更多的AMACR mRNA: 人AMACR，轉(zhuǎn)錄物變體l，mRNA (SEQ ID N0: 4)
NO: 38) 在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測具有SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40的核酸序列的至少一部分，例如，至少10個核苷酸、至少20個核 苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核 苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個核苷酸、至少350個核苷酸、至少400 個核苷酸、至少450個核苷酸和/或至少500個核苷酸或更多的BIRC5 mRNA: 人BIRC5,轉(zhuǎn)錄物變體l，mRNA (SEQ ID NO: 5)
在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 41的核酸序列的至少一部分，例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核 苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個 核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個核苷酸、至少350個核苷酸、至少400個核苷酸、至少 450個核苷酸和/或至少500個核苷酸或更多的HOXC6 mRNA: 人HOXC6,轉(zhuǎn)錄物變體l，mRNA (SEQ ID NO: 6)
人H0XC6,轉(zhuǎn)錄物變體2，mRNA (SEQ ID NO: 41)
在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測具有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44的核酸序列的至少一部分，例如，至少10個核 苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核 苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個核苷酸、至少350 個核苷酸、至少400個核苷酸、至少450個核苷酸和/或至少500個核苷酸或更多的SPARCL1 mRNA： 人SPARCL1，轉(zhuǎn)錄物變體l，mRNA (SEQ ID NO: 7)
人SPARCL1，轉(zhuǎn)錄物變體2，mRNA (SEQ ID NO: 42)
在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測（i)具有SEQ ID NO: 2的 核酸序列的至少一部分，例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40 個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸和/或 至少250個核苷酸或更多的ERG mRNA，（ii)具有SEQ ID NO: 3的核酸序列的至少一部分， 例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷 酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個 核苷酸、至少350個核苷酸、至少400個核苷酸和/或至少450個核苷酸或更多的PCA3 mRNA， 和（iii)至少一種選自以下的其他mRNA的至少一部分：（1)具有SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 37或SEQ ID NO: 38的核酸序列的至少一部分例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至 少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至 少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個核苷酸、至少350個核苷酸、至少400個核苷 酸、至少450個核苷酸和/或至少500個核苷酸或更多的AMACR mRNA; (2)具有SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40的核酸序列的至少一部分，例如，至少10個核苷酸、至少20 個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150 個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個核苷酸、至少350個核苷酸、至少 400個核苷酸、至少450個核苷酸和/或至少500個核苷酸或更多的BIRC5 mRNA; (3)具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 41的核酸序列的至少一部分，例如，至少10個核苷酸、至少20個核 苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核 苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個核苷酸、至少350個核苷酸、至少400 個核苷酸、至少450個核苷酸和/或至少500個核苷酸或更多的H0XC6 mRNA;和(4)具有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44的核酸序列的至少一部分，例 如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷 酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、至少300個 核苷酸、至少350個核苷酸、至少400個核苷酸、至少450個核苷酸和/或至少500個核苷酸或 更多的SPARCL1。
[0084]在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法用于檢測具有SEQ ID N0: 2 的全長核酸序列的ERG mRNA、具有SEQ ID NO: 3的全長核酸序列的PCA3 mRNA和至少一種 選自以下的其他mRNA:具有SEQ ID NO: 4、SEQ ID N0: 37或SEQ ID N0: 38的全長核酸序 列的AMACR mRNA、具有SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 39或SEQ ID NO: 40的全長核酸序列的 BIRC5 mRNA、具有SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 41的全長核酸序列的H0XC6 mRNA和具有SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44的全長核酸序列的SPARCL1 mRNA。
[0085] mRNA表達水平使用各種本領(lǐng)域公認的技術(shù)中的任一種檢測。例如，尿微泡中每個 生物標志物的Ct (循環(huán)閾值)值通過RT-qPCR分析測定。在實時PCR測定中，陽性反應(yīng)通過熒 光信號的累積檢測。Ct值定義為熒光信號越過閾值(即，超過背景水平)所需要的循環(huán)數(shù)目。 Ct水平與樣品中靶核酸的量成反比（即，Ct水平越低，樣品中靶核酸的量越大）。
[0086] 在一些實施方案中，計算所檢測基因（即，PCA3和ERG)的拷貝數(shù)?？截悢?shù)也可使用 從尿微泡中提取的一種或多種核酸的RT-qPCR分析定量。使用本領(lǐng)域已知的方法，例如通過 使用校準曲線，技術(shù)人員可容易地測定拷貝數(shù)。
[0087] 為了生成校準曲線，在同一板上分析已知拷貝數(shù)的與檢測基因同一的合成RNA序 列的cDNA的稀釋系列，如同分析那些相同基因的樣品。通過比較樣品的Ct值與校準曲線的 Ct值，可測定所分析樣品中序列的精確拷貝數(shù)。通過關(guān)聯(lián)樣品Ct值與相同板上的校準曲線， 該方法"歸一化"由于移液器不精確性的變化、測定組分表現(xiàn)（例如，酶、探針、引物、dNTP 等）、qPCR熱循環(huán)儀儀器性能(例如，濾波器、溫度，等)和其他可能發(fā)生的板間變化引起的測 定性能差異。
[0088] 在本文所提供的方法中，其表達水平用于計算相對表達水平的那些基因統(tǒng)一稱為 "參考基因"。用于確定尿樣品對微泡-衍生RNA的充分性的參考基因為通常存在于尿微泡中 的基因，例如管家基因或前列腺特異性基因。這些參考基因的表達水平用于將所檢測信號 的量歸一化以控制樣品之間所分離微泡的量的變異性。例如，在本文所提供的方法中，用于 歸一化PCA3和ERG表達的參考基因可為KLK3、編碼前列腺特異性抗原的基因（PSA)或SPDEF。 參考基因可為前列腺特異性基因。在一些實施方案中，參考基因可為非組織特異性管家基 因，例如GATOH。在本文所提供的方法中，相對表達分析或歸一化通過從對于PCA3和ERG所獲 得的Ct值減去前列腺特異性標志基因（例如，KLK3)的Ct值完成，所得的結(jié)果稱為A Ct?？截?數(shù)通過擬合下式的曲線 Ct = b + a*loglO(校準_拷貝數(shù)） 至板上的稀釋系列上已知的校準點以得到"校準曲線"而計算。然后通過式： 樣品_拷貝數(shù)=1〇~((以_樣品-b)/a) 計算樣品的拷貝數(shù)。
[0089] 拷貝數(shù)計算對于每個標志基因（例如PCA3和/或ERG)以及對于參考基因（例如KLK3 或SPDEF)獨立進行。然后通過將基因標志拷貝數(shù)除以參考基因拷貝數(shù)（例如ERG/SPDEF、 ERG/KLK3、PCA3/SPDEF和ERG/SPDEF)實現(xiàn)標志基因（例如PCA3和/或ERG)的所得信號的"歸 一化"。
[0090]在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法使用包含具有下列核酸序列 的至少一部分，例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷 酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸和/或至少250 個核苷酸或更多的KLK3 mRNA的參考基因：
在一些實施方案中，本公開內(nèi)容的試劑盒和/或方法使用包含具有下列核酸序列的至 少一部分，例如，至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至 少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少150個核苷酸、至少200個核苷酸、至少250個核苷酸、 至少300個核苷酸、至少350個核苷酸、至少400個核苷酸、至少450個核苷酸和/或至少500個 核苷酸或更多核酸序列的SPDEF mRNA的參考基因：
PCA3和ERG的相對或歸一化表達水平與參考基因也可使用各種本領(lǐng)域公認的技術(shù)中的 任一種進行分析和比較。例如，可對PCA3和ERG以及任選地至少一種其他生物標志物進行受 試者工作特征(R0C)分析，其中對于所測量的每個生物標志物所測量的生物標志物的表達 水平產(chǎn)生曲線下面積(AUC)值。生物標志物的R0C分析可逐個運行，即作為個體生物標志物， 或組合用于線性回歸分析。具有高診斷價值的生物標志物的組合(作為如本文所述的具有 高診斷能力的生物標志物)具有大于0.5、0.6、0.7或0.8的衍生自R0C曲線的AUC值。優(yōu)選地， 生物標志物或生物標志物的組合具有大于0.7的AUC值。例如，PCA3和ERG的組合產(chǎn)生大于 0.7的厶1](：值。
[0091] R0C曲線為一種廣泛使用的用于評估生物標志物的識別和診斷能力的工具。當對 于一些觀察，生物標志物值漏測時，由于樣品大小減少僅基于完整情況的R0C分析失去有效 性，并且更為重要地，其常遭受潛在偏倚。因此，在生物標志物值漏測的情況下，應(yīng)用估算方 法。
[0092]對于生物標志物的每個水平衍生自受試者工作特征（R0C)曲線的曲線下面積 (AUC)或通過生物標志物的組合創(chuàng)建的分數(shù)使用來自對照和疾病患者二者的生物標志物的 結(jié)果計算。通過考慮臨床應(yīng)用所必需的靈敏度、特異性、陰性預(yù)測值(NPV)、陽性預(yù)測值 (PPV)、陽性似然比(PLR)和陰性似然比(NLR)的截斷值分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地能夠 最大化生物標志物水平或生物標志物組合的診斷準確度。
[0093] R0C曲線產(chǎn)生和樣品群分析用于建立用于區(qū)分不同受試者亞群的截斷值。例如，截 斷值可區(qū)分具有高癌癥復發(fā)風險與低癌癥復發(fā)風險的受試者。在一些實施方案中，截斷值 可區(qū)分具有癌癥的受試者與無癌癥的受試者。在一些實施方案中，截斷值可區(qū)分具有非侵 襲性癌癥與侵襲性癌癥的受試者。在一些實施方案中，截斷值可區(qū)分具有高Gleason分數(shù) (例如，GS > 6)前列腺癌與低Gleason分數(shù)癌癥的受試者。
[0094] 如本文所述，將從受試者尿樣品測定的歸一化的的PCA3和ERG的表達水平計算為 與截斷值比較的輸出值以區(qū)分受試者亞群。在一些實施方案中，歸一化的PCA3和ERG的表達 水平使用KLK3作為參考基因測定，如下： ACtERG = CtERG ~ CtKLK3 ACtpCA3 = CtpCA3 ~ CtKLK3 然后將ERG和PCA3的ACt值應(yīng)用到數(shù)學式中以產(chǎn)生輸出值。產(chǎn)生輸出值的實例公式如 下： 輸出值=(ACtERG X 0.233) + (ACtpcA3 X 0.446) 在拷貝數(shù)的情況下，檢驗的輸出值如下計算： 輸出值=拷貝PCA3/拷貝KLK3鄉(xiāng)PDEF X C〇eff + 拷貝ERG/拷貝KLK3鄉(xiāng)PDEF X C〇eff， 其中系數(shù)可都相等，例如1 (一）。在其中系數(shù)相等的情況下，所有基因?qū)敵鲋稻哂邢?同的相對貢獻。在一些實施方案中，對于每個標志基因系數(shù)不同，表明每個標志基因?qū)敵?值并因此對陽性活組織檢查的可能性具有不同的貢獻。在一種方法中，系數(shù)可通過經(jīng)由線 性回歸將等式輸出值=拷貝PCA3/拷貝KLK3鄉(xiāng)PDEF X C〇eff +拷貝ERG/拷貝KLK3鄉(xiāng)PDEF X C〇eff 擬合至現(xiàn)有數(shù)據(jù)集確定。
[0095]如本文所提供的實施例中顯示的，PCA3和ERG的組合能夠以77.8%的靈敏度和 61.8%的特異性明確區(qū)分活組織檢查陰性和活組織檢查陽性的受試者。這些值證明了本文 所公開的生物標志物基因組合作為癌癥，例如前列腺癌的靈敏和特異性診斷生物標志物的 效力。
[0096]術(shù)語"受試者"意在包括顯示或預(yù)期在尿中具有包含核酸的微泡和/或循環(huán)核酸的 所有動物。在具體的實施方案中，所述受試者為哺乳動物;例如，人類或非人靈長類、狗、貓、 馬、?；蚱渌r(nóng)場動物，或嚙齒類(例如小鼠、大鼠、豚鼠等）。
[0097] 從尿樣品中獲得微泡部分 用于從尿樣品中獲得微泡部分的方法在本申請以及在科學出版物和專利申請(Chen等 人，2010; Miranda 等人，2010; Skog 等人，2008)中描述。還參見 WO 2009/100029、W0 2011/009104、W0 2011/031892和W0 2011/031877。這些出版物對于它們關(guān)于微泡分離或部 分獲取的方法和技術(shù)的公開內(nèi)容，通過引用結(jié)合到本文中。這些方法可包括，例如，通過檢 測該部分內(nèi)18S和28S RNA表達水平而評估所分離微泡部分的RNA完整性的步驟。
[0098]例如，通過差速離心獲得微泡的方法在Raposo等人的論文(Raposo等人，1996)、 Skog等人(Skog等人，2008)的論文和Nilsson等人的論文(Nilsson等人，2009)中描述。陰 離子交換和/或凝膠滲透色譜的方法在美國專利號6，899，863和6，812，023中描述。蔗糖密 度梯度或細胞器電泳的方法在美國專利號7,198,923中描述。磁活化細胞分選(MACS)的方 法在Taylor和Gercel-Taylor的論文(Taylor和Gercel-Taylor，2008)中描述。納米膜超濾 濃縮的方法在Cheruvanky等人的論文中（Cheruvanky等人，2007)描述。此外，微泡可通過 使用微流體平臺以分離腫瘤衍生微泡的微芯片技術(shù)從受試者體液鑒定和分離(Chen等人， 2010)。對于這些方法的教導，前述各參考文獻均通過引用結(jié)合到本文中。
[0099] 在本文所述方法的一個實施方案中，對于源自前列腺或腫瘤細胞的那些，富集從 尿中分離的微泡。由于微泡經(jīng)常攜帶表面分子，例如來自其供體細胞的抗原，表面分子可用 于鑒定、分離和/或富集來自特異性的供體細胞類型的微泡（Al-Nedawi等人，2008; Taylor和Gercel-Taylor, 2008)。這樣，可對源自不同細胞群的微泡的核酸內(nèi)含物進行分 析。例如，腫瘤(惡性的和非惡性的)微泡攜帶腫瘤-相關(guān)表面抗原并且可經(jīng)由這些特異性的 腫瘤-相關(guān)表面抗原進行檢測、分離和/或富集。在一個實例中，表面抗原為上皮細胞黏附分 子(EpCAM)，其對來自肺、結(jié)腸直腸、乳腺、前列腺、頭和頸部以及肝臟源而不是血液學細胞 源的癌的微泡特異(Balzar等人，1999; Went等人，2004)。
[0100] 另外，腫瘤特異性微泡可表征為缺乏表面標志，例如⑶80和⑶86。在這些情況下， 對于腫瘤特異性標志的進一步分析，具有標志，例如⑶80和⑶86的微泡可排除。排除可通過 各種方法實現(xiàn)，例如親和力排除。
[0101] 從前列腺獲得微泡部分可，例如，通過使用抗體、適體、適體類似物或?qū)ζ谛璞砻?抗原特異的分子印跡聚合物實現(xiàn)。在一些實施方案中，表面抗原對癌癥類型特異。在一些實 施方案中，表面抗原對細胞類型(不一定是癌性)特異。
[0102] 基于細胞表面抗原的微泡分離方法的一個實例在美國專利號7,198,923中提供。 如，例如美國專利號5，840，867和5，582，981、W0/2003/050290及Johnson等人的出版物 (Johnson等人，2008)中所描述的，適體及其類似物特異性結(jié)合表面分子并且可用作用于 回收細胞類型特異性微泡的分離工具。分子印跡聚合物也特異性識別表面分子，如在，例如 美國專利號6,525，154、7,332,553和7,384,589以及8〇881等人的出版物（8〇88丨等人， 2007)中所描述的，并且為用于回收和分離細胞類型特異性微泡的工具。對于這些方法的教 導，前述各參考文獻均結(jié)合到本文中。
[0103] 在本文所述的方法中，尿樣品可通過一個或多個過濾或濃縮步驟預(yù)處理以去除細 胞碎片和其他非微泡物質(zhì)。例如，尿樣品可過濾通過〇 ? 8 um濾器。任選地，從0 ? 8 um濾器獲 得的濾液可進一步過濾通過0.22 um濾器。為了分離尿微泡，然后使用過濾濃縮步驟濃縮預(yù) 處理的樣品。該步驟包括使用具有分子截留以保留和濃縮直徑大于10 nm的微泡的濾器。例 如，然后將樣品濃縮至小于1 mL，優(yōu)選地100-200 yL的體積。例如，分子量截留為至少100 kDa。優(yōu)選地，分子量截留為100 kDa。
[0104] 從微泡提取核酸 用于核酸提取的方法一般基于本領(lǐng)域所熟知的程序。技術(shù)人員將選擇一種適合具體生 物樣品的具體提取程序。提取程序的實例在專利出版物WO 2009/100029、US 201/ 00196426、US 2011/0003704、US 2011/0053157、W0 2011/009104和TO 2011/031892中提 供。這些出版物對于其關(guān)于微泡核酸提取方法和技術(shù)的公開內(nèi)容，通過引用結(jié)合到本文中。
[0105] 在本文所述的方法中，為了防止提取后不期需的核酸降解的目的，在微泡分離和 純化后但在微泡裂解和核酸提取之前向樣品中加入RNA酶抑制劑。微泡在RNA酶抑制劑的存 在下裂解。然后在本領(lǐng)域所已知的使得微泡RNA與柱結(jié)合的條件下將裂解物加入RNA-結(jié)合 柱中。任選地，洗滌柱以增加RNA的品質(zhì)和收率。然后在本領(lǐng)域所已知的使得高品質(zhì)RNA被收 集的條件下洗脫RNA。
[0106] 在一些實施方案中，所提取核酸的品質(zhì)可通過檢測18S和28S核糖體RNA并測定比 率評估。18S: 28S rRNA的比率優(yōu)選為約1:1-約1:2;更優(yōu)選地約1:2。
[0107] 在一些實施方案中，核酸可從尿樣品中提取而不分離或純化微泡部分。
[0108] 核酸生物標志物的檢測 生物標志物檢測可以以許多不同方式對提取的核酸進行，并構(gòu)成許多方面。在一些實 施方案中，從一個或多個尿樣品檢測核酸生物標志物是為了獲得所有或部分提取核酸的概 況。
[0109] 本文所使用的術(shù)語概況(prof i 1 e)是指核酸收集物的具體特征的表現(xiàn)，其可通過 微泡或從受試者尿樣品分離的微泡部分所包含的一種或多種核酸的定量或定性分析測定。 在此將參考概況定義為從獨立受試者或一群受試者，或從不同時間點的相同受試者獲得的 概況。
[0110] 微泡中的核酸可為一種或多種類型的核酸，其實例在本文中提供。
[0111] 核酸可為RNA ANA可為編碼RNA，例如，可編碼蛋白質(zhì)的信使RNA ANA也可為非編碼 RNA (ncRNA)，例如，核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA、微小RNA和可源自基因組DNA的其他非編碼轉(zhuǎn)錄 物。這些非編碼RNA轉(zhuǎn)錄物可包括從衛(wèi)星重復轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄物和可為DNA轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座 子的轉(zhuǎn)座子。優(yōu)選地，核酸為mRNA。
[0112] 核酸可為DNA ANA可為從RNA反轉(zhuǎn)錄的單鏈DNA，例如，cDNA。反轉(zhuǎn)錄通常由細胞中 的反轉(zhuǎn)錄酶基因編碼的反轉(zhuǎn)錄酶介導。DNA也可為DNA復制期間產(chǎn)生的單鏈DNA。當細胞分裂 時基因組DNA在細胞核中復制。一些復制的DNA可脫離其模板，輸出細胞核，并包裝入微泡 中。DNA可進一步為雙鏈DNA的片段。
[0113] 另外，DNA可為非編碼DNA (ncDNA)。人類基因組僅包含約20,000個蛋白質(zhì)編碼基 因，代表小于2%的基因組。非編碼與蛋白質(zhì)編碼DNA序列的比率隨著發(fā)育復雜性的變化而增 加(Mattick，2004)。原核生物具有小于25%的ncDNA，簡單的真核生物具有25-50%，更復雜 的多細胞生物如植物和動物具有超過50%的ncDNA，而人類具有約98.5%的ncDNA (Mattick， 2004)〇
[0114] 來自基因組的一些ncDNA轉(zhuǎn)錄為ncRNA AcRNA涉及細胞中的許多重要過程，例如， 酶(核酶)與蛋白質(zhì)(適體)特異性結(jié)合以及在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平二者調(diào)芐基因活性。
[0115] 核酸的概況可通過根據(jù)本領(lǐng)域標準方案分析從分離的微泡獲得的核酸獲得。例 如，DNA的分析可通過本領(lǐng)域已知的一種或多種不同方法進行，包括用于測定提取物中的核 酸種類的微陣列分析、用于測量基因表達水平的定量PCR、用于檢測基因突變的DNA測序和 用于檢測基因甲基化模式的亞硫酸氫鹽甲基化測定。
[0116] 在某些情況下，為了獲得概況，可進行數(shù)據(jù)分析。這種數(shù)據(jù)分析可例如，通過聚類 分析、主要成分分析、線性判別分析、受試者工作特征曲線分析、二元分析、Cox比例風險分 析（Cox Proportional Hazards Analysis)、支持向量機（Support Vector Machine)和遞 歸特征消除（SVM-RFE)、近質(zhì)心分類（Classification to Nearest Centroid)、循證分析 (Evidence-based Analysis)或任何前述分析技術(shù)的組合進行。
[0117] 對于另一個實例，RNA的分析可使用數(shù)字基因表達(DGE)分析方法進行(Lipson等 人，2009)。對于RNA分析的又一個實例，可將RNA消化并轉(zhuǎn)化為單鏈cDNA，單鏈cDNA可然后 在DNA測序機器，例如，如Ting等人的出版物（Ting等人，2011)中所描述的來自Helicos BioSciences的HeliScope?單分子測序儀上經(jīng)受測序分析。
[0118] 在其他情況下，RNA可在進一步擴增前反轉(zhuǎn)錄為互補DNA (cDNA)。這種反轉(zhuǎn)錄可單 獨或與擴增步驟組合進行。組合反轉(zhuǎn)錄和擴增步驟的方法的一個實例為反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反 應(yīng)(RT-PCR)，其可進一步改進為定量的，例如，如美國專利號5,639,606中所描述的定量RT-PCR，所述專利通過引用結(jié)合到本文中用于該教導。該方法的另一個實例包括兩個分開的步 驟:第一個反轉(zhuǎn)錄步驟以使RNA轉(zhuǎn)換為cDNA和第二個使用定量PCR定量cDNA的量的步驟。
[0119] 核酸擴增方法包括，但不限于，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(美國專利號5，219，727)和其 變體例如原位聚合酶鏈反應(yīng)(美國專利號5,538，871)、定量聚合酶鏈反應(yīng)(美國專利號5， 219,727)、巢式聚合酶鏈反應(yīng)(美國專利號5,556,773)、自主序列復制及其變體(6皿仏111 等人，1990)、轉(zhuǎn)錄擴增系統(tǒng)及其變體(Kwoh等人，1989)、Qb復制酶及其變體(Miele等人， 1983)、cold-PCR (Li等人，2008)、BEAMing (Li等人，2006)或任何其他核酸擴增方法，隨 后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)檢測擴增分子。如果這些分子以非常低的數(shù)目存在， 特別有用的為那些為檢測核酸分子設(shè)計的檢測方案。前述參考文獻結(jié)合到本文中，用于其 對這些方法的教導。
[0120] 在一些實施方案中，不進行核酸擴增步驟。未擴增的核酸可通過定量PCR (RT-PCR)分析，或例如通過下一代測序或nanostring技術(shù)直接分析。
[0121 ]所分離微泡中存在的核酸的分析可為定量的和/或定性的。對于定量分析，用本領(lǐng) 域已知的和本文所述的方法測量所分離微泡內(nèi)的特異性目的核酸的表達水平，相對的或絕 對的表達水平。對于定性分析，用本領(lǐng)域已知的方法鑒定所分離微泡內(nèi)的目的核酸的種類， 無論是野生型還是變體。
[0122]在一些實施方案中，核酸生物標志物的檢測涉及檢測一種或一批基因畸變的存在 或不存在。術(shù)語"基因畸變"在本文中用于指包含核酸的微泡內(nèi)核酸的量以及核酸變體。特 別地，基因畸變包括，但不限于，一個基因（例如，致癌基因）或一組基因的過表達、一個基因 (例如，腫瘤抑制基因例如P53或RB)或一組基因的低表達、一個基因或一組基因的剪接變體 的選擇性產(chǎn)生、基因拷貝數(shù)變體(CNV)(例如，DNA雙微體）（Hahn，1993)、核酸修飾(例如， 甲基化、乙?；土姿峄?、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)(例如，Alu元件中的多態(tài)性）、染色體重 排(例如，倒置、缺失和重復)和一個基因或一組基因的突變(插入、缺失、重復、錯義、無義、 同義或任何其他核苷酸變化），這些突變，在許多情況下，最終影響基因產(chǎn)物的活性和功能， 導致選擇性轉(zhuǎn)錄剪接變體和/或基因表達水平的改變，或任何前述的組合。
[0123] 基因畸變可存在于許多類型的核酸中。這種基因畸變的測定可通過技術(shù)人員已知 的多種技術(shù)進行。例如，核酸的表達水平、選擇性剪接變體、染色體重排和基因拷貝數(shù)可通 過微陣列分析(參見，例如，美國專利號6,913,879、7,364,848、7,378,245、6,893,837和6， 004,755)和定量?0?測定?？截悢?shù)變化可例如，用111111^的111行1^1111111全基因組基因分型 測定或Agilent人基因組CGH微陣列（Steemers等人，2006)檢測。
[0124] 核酸修飾可通過，例如，美國專利號7，186，512和專利出版物W0/2003/023065中描 述的方法測定。甲基化概況可，例如，通過Illumina DNA Methylation 0MA003 Cancer Panel測定。
[0125] SNP和突變可通過以下檢測：與等位基因特異性探針雜交、酶突變檢測、錯配異源 雙鏈體的化學切割(Cotton等人，1988)、配錯堿基的核糖核酸酶切割(Myers等人，1985)、 質(zhì)譜分析法(美國專利號6,994,960、7,074,563和7，198,893)、核酸測序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (SSCP) (Orita等人，1989)、變性梯度凝膠電泳（DGGE) (Fischer和Lerman, 1979a; Fischer和Lerman, 1979b)、溫度梯度凝膠電泳（TGGE) (Fischer和Lerman, 1979a; Fischer和Lerman, 1979b)、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP) (Kan和Dozy, 1978a; Kan和 Dozy，1978b)、寡核苷酸連接測定（OLA)、等位基因特異性PCR (ASPCR)(美國專利號5， 639,611)、連接鏈反應(yīng)（LCR)及其變體（Abravaya等人，1995; Landegren等人，1988; Nakazawa等人，1994)、流式細胞異源雙鏈體分析(W0/2006/113590)及其組合/改良。
[0126] 在一些實施方案中，突變的檢測通過使用僅消化生物標志物的一種變體而不消化 生物標志物的其他變體的限制酶進行。如本領(lǐng)域已知的，限制酶忠實地識別多核苷酸的特 定段并且該多核苷酸段中的一個或多個核苷酸的變化將很有可能使該多核苷酸不能被酶 識別和消化。正因如此，可通過消化掉一些或所有其他可被酶識別的變體而幫助檢測生物 標志物的一種變體。待檢測的變體可為野生型變體或突變體變體。
[0127] 基因表達水平可通過基因表達系列分析(SAGE)技術(shù)(Velculescu等人，1995)、定 量PCR、定量反轉(zhuǎn)錄PCR、微陣列分析和下一代DNA測序測定，如本領(lǐng)域所已知的。
[0128] -般而言，用于分析基因畸變的方法在許多出版物中報道，不限于本文引用的那 些，并且可為技術(shù)人員獲得。適當?shù)姆治龇椒▽⑷Q于分析的具體目標、患者的病況/病史 和待檢測、監(jiān)測或治療的具體癌癥、疾病或其他醫(yī)療病況。
[0129] 與疾病或其他醫(yī)療病況相關(guān)的生物標志物 許多生物標志物可與受試者中疾病或其他醫(yī)療病況的存在或不存在情況有關(guān)。因此， 根據(jù)本文公開的方法，在自分離的微泡的核酸提取中檢測這樣的生物標志物的存在或不存 在情況可幫助診斷、預(yù)后或監(jiān)測受試者中疾病或其他醫(yī)療病況的進展或復發(fā)。
[0130] ERG，如本文所使用的，指也稱為v-ets成紅細胞增多癥病毒E26癌基因同源物的基 因和任何鑒定的同種型。例如，ERG同種型包括ERG1、ERG2、ERG3、ERG4、ERG5、ERG6、ERG7、 ERG8和ERGLERG也可指ERG前列腺癌特異性同種型1 (EPC1)和ERG前列腺癌特異性同種型2 (EPC2) ARG或任何一種ERG同種型可用作前列腺癌的生物標志物。
[0131] 如本文所使用的PCA3也指還稱為DD3的基因和任何鑒定的同種型，并可用作前列 腺癌的生物標志物。
[0132] 還發(fā)現(xiàn)許多生物標志物影響對特定患者的治療選擇。根據(jù)本文公開的方法，在自 分離的微泡的核酸提取中檢測這樣的生物標志物的存在或不存在情況可幫助給定患者中 的治療選擇。
[0133] 患者亞群 本發(fā)明提供檢測受試者尿樣品中的一種或多種生物標志物的方法以幫助疾病，例如， 癌癥，特別是侵襲性癌癥的診斷、預(yù)后、監(jiān)測或治療選擇。
[0134] 從其分離微泡的個體的選擇由技術(shù)人員基于多種因素中的一個或多個的分析進 行。要考慮的這種因素為受試者是否具有特定疾病(例如，癌癥)的家族史、是否具有這種疾 病的遺傳傾向、是否具有這種疾病的增加的風險、是否具有指示某種傾向的身體癥狀或環(huán) 境原因。環(huán)境原因包括生活方式、暴露于引起或促成疾病的媒介物例如空氣、土地、水或飲 食。選擇個體用于進行本文所公開方法的其他原因包括疾病的既往史、治療前或治療后目 前正診斷為該疾病、當前正治療該疾病(處于治療中）或處于疾病減輕或恢復中。
[0135] 用本發(fā)明方法診斷、監(jiān)測或其他方式評估的癌癥可為任何種類的癌癥或癌前病 況。這包括，但不限于，上皮細胞癌例如肺癌、卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、腦癌、結(jié) 腸癌和前列腺癌。還包括胃腸癌、頭和頸部癌、非小細胞肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌、視網(wǎng)膜癌、皮膚 癌、肝癌、胰腺癌、腎癌、生殖器癌及膀胱癌、黑色素瘤和白血病。另外，本發(fā)明的方法和組合 同樣可適用于個體非惡性腫瘤（例如，纖維神經(jīng)瘤、腦膜瘤和神經(jīng)鞘瘤）的檢測、診斷和預(yù) 后。癌癥可為任何侵襲性癌癥。在一些實施方案中，癌癥為泌尿生殖器癌，例如前列腺癌、膀 胱癌、腎癌和已擴散至泌尿生殖道的轉(zhuǎn)移性癌癥。
[0136] 本發(fā)明提供在不同患者亞群中具有顯著診斷和預(yù)后價值的生物標志物。所述患者 患有癌癥，例如，前列腺癌。在一些實施方案中，所述一種或多種生物標志物在已經(jīng)經(jīng)受根 治性前列腺切除術(shù)的患者中檢測。在一些實施方案中，所述一種或多種生物標志物在已指 定具體Gleason分數(shù)的患者中檢測。在一些實施方案中，所述一種或多種生物標志物在表達 ERG的患者或其癌癥經(jīng)測定受ERG表達驅(qū)動的患者中檢測。這些患者在本文中稱為"ERG表達 者(Expr esser)'ERG的存在或ERG表達超過某個預(yù)定閾值決定受ERG表達驅(qū)動的癌癥。在一 些實施方案中，所述一種或多種生物標志物在不表達ERG的患者或其癌癥經(jīng)測定不受ERG表 達驅(qū)動的患者中進行檢測。這些患者在本文中稱為"ERG非表達者"。
[0137] Gleason分級系統(tǒng)通常在本領(lǐng)域用作前列腺癌預(yù)后參數(shù)，經(jīng)常與其他預(yù)后因素或 檢驗組合使用。前列腺活組織檢查樣品例如，通過顯微鏡檢查，并且Gleason分數(shù)通過病理 學家基于前列腺腫瘤的架構(gòu)模式確定。Gleason分數(shù)基于正常腺組織架構(gòu)（即腺體的形狀、 大小和分化)的喪失程度。樣品被賦予最常見腫瘤模式的一個級別和下一最常見腫瘤模式 的第二個級別?？纱嬖诳设b定的主要或最常見模式，然后次要或第二最常見模式;或者，可 僅存在單個級別。Gleason模式與下列特征相關(guān)： 模式1-癌性前列腺與正常前列腺組織極為相似。腺體小、良好成形，并且緊密堆積。
[0138] 模式2-組織仍具有良好成形的腺體，但是它們較大并且其間具有較多組織。
[0139] 模式3-組織仍具有可識別的腺體，但細胞較暗。在高放大倍數(shù)下，這些細胞中的一 些已離開腺體并開始侵入周圍組織。
[0140] 模式4-組織幾乎無可識別的腺體。許多細胞正在侵入周圍組織。
[0141] 模式5-組織不具有可識別的腺體。往往僅有細胞片層遍及整個周圍組織。
[0142] 將兩個級別加在一起以得到Gleason分數(shù)，也稱為Gleason總和。2-4分為非常低的 癌癥侵襲標度。5-6分為輕微侵襲的。7分表明癌癥為中等侵襲的。8-10分表明癌癥為高度侵 襲的。
[0143] 對于其他癌癥，例如膀胱癌或腎癌，將非侵襲性癌癥與侵襲性癌癥分層的其他分 級系統(tǒng)為本領(lǐng)域所知。 實施例
[0144] 實施例1:材料和方法: 引物/探針序列：用于檢測尿生物標志物群的試劑盒和方法使用以下引物/探針序列。 下列縮略語用于下表1中：來自Integrated DNA Technologies的探針指定為"IDT"、5'-FAM 指5 '報告染料、"3IABkFQ"指3 ' -IowaBlack猝滅劑和"ZEN"指來自IDT的序列內(nèi)ZEN ?猝滅 劑。
[0145] 表1.引物/探針序列
實施例2:患者群7樣品制備 患者群樣品用于鑒定生物標志物，其可用于自從尿-衍生微泡提取的核酸檢測前列腺 癌。258個受試者的患者群，本實施例中稱為"群7"，參加了該研究。258個受試者中，196個接 受他們的第一次活組織檢查，并且59個接受重復活組織檢查。初次活組織檢查患者中，87個 具有陽性活組織檢查結(jié)果，109個具有陰性活組織檢查結(jié)果。重復活組織檢查的患者中，15 個具有陽性活組織檢查結(jié)果，44個具有陰性活組織檢查結(jié)果。
[0146] 尿樣品體積為20-100 mL。患者尿樣品的初始體積分布如下：樣品體積(V)等于20 mL (即V = 20 mL)，21%的患者（n=55);樣品體積大于20 mL但小于或等于40 mL (即20 mL 〈V彡40 mL)，27%的患者(n=70);或樣品體積大于40 mL (即V > 40 mL)，52%的患者(n= 133)〇
[0147] 如圖1A和1B所描繪的分析群7的尿樣品。例如，收集尿樣品并過濾通過0.8 wii濾器 以分離細胞與微泡中的其他細胞碎片，并將微泡-富集的部分冷凍在-80 °C。將每一樣品的 第一個等分試樣（S1)進一步處理。額外的處理步驟可包括離心、通過過濾濃縮器濃縮、1-2 個洗滌步驟和/或加入RNA酶抑制劑。任選地，可在微泡分離或核酸提取之前向樣品中加入 對照顆粒，例如Q-0顆粒，以測定分離或核酸提取的品質(zhì)。例如，由于Q-0對照失效，18個受試 者從研究中移除。
[0148] 特別地，首先過濾尿樣品，并將濾液丟棄。Q-0對照以合適的濃度(例如，100拷貝） 加入過濾尿樣品的等分試樣(例如，15 mL)中。然后通過過濾濃縮器處理等分試樣，并將濾 液丟棄。保留物用過濾尿樣品的第二個等分試樣(例如，5 mL過濾尿)重懸并通過過濾濃縮 器處理。然后將保留物至少洗滌一次(例如兩次），并在過濾濃縮器中重新旋轉(zhuǎn)。向位于過濾 濃縮器上室的保留物中加入RNA酶抑制劑，并在室溫下孵育，例如2-3分鐘。然后直接向樣品 中加入裂解緩沖液并孵育1分鐘。然后將裂解物轉(zhuǎn)移至到另一個容器中以繼續(xù)核酸提取。
[0149] 然后樣品使用本領(lǐng)域熟知的方法和適于產(chǎn)生高品質(zhì)RNA的條件經(jīng)受核酸提取。通 過BioAnalyzer Profile分析 12 yl提取的RNA。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA (SUPERSCRIPT ? VILO cDNA Synthesis Kit, Life Technologies)。在cDNA樣品上進行定量實時PCR以 測定PCA3、ERG、KLK3和郎（每基因2 yl)的基因表達。每一qPCR板上均存在校準標準曲線。
[0150] 引物和探針序列可參見表1。
[0151] 實施例3: PCA3和ERG基因表達分析 多重分析使用來自qPCR實驗的基因表達結(jié)果進行。R0C曲線基于相對于歸一化基因 KLK3的ACt或拷貝數(shù)產(chǎn)生。估算可用于獲得漏測值。PCA3的R0C分析，使用KLK3作為歸一化 基因，產(chǎn)生0.727的AUC值（圖3) WCA3和ERG的R0C曲線分析產(chǎn)生增加的AUC值0.756 (圖4)。 在其他實驗中，使用的歸一化基因為SPDEF (圖13)，并且使用SPDEF歸一化的分析所產(chǎn)生的 AUC值顯示KLK3和SH)EF表現(xiàn)相當。
[0152] 對于每個樣品，PCA3和ERG基因表達的模型或輸出值也使用下式計算，其從不同的 患者群(群5)的數(shù)據(jù)分析確定： 模型值=(ACtERG x 0.233) + (ACtpCA3 x 0.446) 其中 ACtERG = CtERG - CtKLK3; ACtpCA3 = CtpCA3 - CtKLK3 選擇模型截斷值，例如，本實施例中使用的截斷值為4.7，并且通過2x2分析和Gleason 分析測定使用PCA3和ERG的組合與截斷模型值4.7的診斷準確度(圖10)。
[0153] 對于群7的每個樣品體積亞群，使用PCA3和ERG基因表達的2x2分析結(jié)果在表2a、3a 和4a中概括。對于鑒定已通過活組織檢查鑒定為陽性的樣品中的前列腺癌，PCA3和ERG的組 合靈敏度大于84%。特別地，數(shù)據(jù)證明20 mL的尿樣品體積產(chǎn)生更好的診斷準確度，具有 83.6%的靈敏度和58.7%的特異性。該方法還具有79.4%的高陰性預(yù)測值和53.4%的陽性預(yù)測 值。
[01 M] 進一步分析包括通過其Gleason分數(shù)，如表2b、3b和4b所示，以及四分位數(shù)分析，如 表2d、2e、3d、3e、4d和4e所示對樣品分層。特別地，具有Gleason分數(shù)6或更高的患者的樣品 正確地鑒定了 70%的樣品。
[0155] 實施例4:包含PCA3的三基因模型 多變量分析使用包含PCA3的基因集進行。如圖15中所示，包含PCA3的模型（即，PCA3和 ERG與額外的基因，例如AMACR、BIRC5、H0XC6和SPARCL1)始終勝過不包含PCA3的FT0三基因 模型。使用的參考基因可為KLK3或SPDEF，如圖15中通過使用任一基因歸一化的一致的AUC 值所示。
[0156] 三基因模型還顯示當使用小體積樣品（即20 mL)時與所有樣品相比具有改善的 AUC值（圖 15)。
[0157] 實施例5:最佳尿樣品體積 患者群7的尿樣品為20-100 mL。群7中具有20 mL或更小、40 mL或更小但大于20 mL和 大于40 mL體積的樣品分布在圖1中不出。
[0158] 如實施例1和2中所述分離微泡、提取RNA和測定生物標志基因表達。群7中生物標 志物（即，PCA3、ERG)的生物統(tǒng)計學分析通過基于群中所有樣品的拷貝數(shù)和KLK3歸一化基因 表達產(chǎn)生AUC和R0C圖進行。圖3顯示從PCA3表達分析產(chǎn)生的AUC高度依賴樣品體積。例如，產(chǎn) 生大于0.7的AUC的樣品來自樣品體積小于40 mL的樣品。相反地，產(chǎn)生0.60-0.65范圍的AUC 的樣品具有40 mL或更大的樣品體積。圖12顯示每個指定基因（PCA3、ERG、AMACR、BIRC5、 H0XC6、SPARCL1和SPDEF)的單變量分析和與對于所有樣品產(chǎn)生的AUC相比對于20 mL或更少 的樣品產(chǎn)生的AUC。這些結(jié)果顯示20 mL或更少的樣品導致增加的AUC值，表明單基因的診斷 能力在小體積尿樣品中增加。STOEF為用于歸一化的參考基因，因此，對于較小樣品體積AUC 值沒有提尚。
[0159] 生物標志物表達的拷貝數(shù)而非Ct值的分析也顯示當與所有樣品比較時，具有較小 體積(20 mL)的樣品產(chǎn)生提高的AUC值(圖13)。
[0160] 實施例6:患者樣品評分及其統(tǒng)計驗證 在本文所述的研究中，若滿足下列標準則使用樣品：（i)僅第一次活組織檢查；（ii) 患者年齡彡50歲；（iii) PSA"灰區(qū)"水平在2-10 ng/mL的范圍內(nèi)；和（iv)尿供給體積在 20-49 mL之間。選擇PSA灰區(qū)中的患者樣品，因為具有高PSA水平的患者將幾乎總是進行活 組織檢查，并且具有低PSA水平的患者由于其他非PSA驅(qū)動的原因通常僅推薦進行活組織檢 查。
[0161] 根據(jù)實驗室開發(fā)的檢驗(LDT)分數(shù)(本文稱為EX0106分數(shù))使用下列算法：
為患者樣品評分，其中拷貝數(shù)對于每個基因使用板上校準曲線用RGQ軟件(Qiagen)計 算，并且其中截斷值為10。小于10的EX0106分數(shù)為與低前列腺癌風險關(guān)聯(lián)的分數(shù)。大于或等 于10的EX0106分數(shù)為與較高前列腺癌風險關(guān)聯(lián)的分數(shù)。
[0162] 應(yīng)注意的是，分數(shù)通過乘以1.83按比例調(diào)節(jié)并通過加上16.92補償以將EX0106分 數(shù)轉(zhuǎn)換為更吸引人和易讀的范圍。然而，這種按比例調(diào)節(jié)和補償對檢驗的表現(xiàn)無影響。 EX0106分數(shù)的轉(zhuǎn)換將大部分數(shù)據(jù)置于0-30的范圍，但任一端的分數(shù)均無上限（即，個體樣品 可評分落在該范圍外）。配置EX0106分數(shù)的算法以致截斷為10時EX0106分數(shù)的陰性預(yù)測值 (NPV)大于前列腺癌預(yù)防性試驗風險計算表(PCPTRC)的NPV，其中選擇NPV pcptrc截斷值以致 其將至少30%的患者預(yù)測為陰性。EX0106分數(shù)的算法還設(shè)計為使得預(yù)測為陰性（即EX0106分 數(shù)小于10)的患者部分為至少30%。
[0163] 本文中稱為群8 (即C8，n = 453個樣品，PSA中值=5.3 ng/mL，并且80%的樣品2〈 PSA〈 10 ng/mL)的患者群中的示例性EX0106分數(shù)分布在圖16中示出。具有任何Gleason分 數(shù)的患者的EX0106表現(xiàn)的AUC與護理標準(S0C)療法的AUC的比較在圖17中示出，其中S0C的 AUC = 0.595;EX0106 的 AUC = 0.738;并且 EX0106 + SOC 的 AUC = 0.764。圖 17 中使用的患 者群具有下列特征:所有樣品均在PSA灰區(qū)，僅來自第一次活組織檢查，并且來自小體積尿 樣品。依據(jù)四分位數(shù)，即按照EX0106分數(shù)四分位數(shù)通過活組織檢查鑒定為陽性的樣品百分 數(shù)的EX0106表現(xiàn)在圖18A和18B中示出。再次，這些樣品來自具有任何G1 eason分數(shù)的患者。
[0164] EX0106分數(shù)對于高級別前列腺癌，例如，大于6的Gleason分數(shù)的表現(xiàn)在圖19中示 出，并且基于Gleason分數(shù)亞群的EX0106分數(shù)表現(xiàn)的統(tǒng)計分析在圖20中示出。
[0165] 因此，EX0106分數(shù)可用于確定高級別前列腺疾病，例如，具有大于6的Gleason分數(shù) 的疾病的預(yù)測。通常，來自首次活組織檢查和來自重復活組織檢查群體的樣品是十分不同 的，并且應(yīng)該分別分析。
[0166] 雖然本發(fā)明已經(jīng)參考某些實施方案公開，但是不脫離如上文和所附權(quán)利要求中所 述的本發(fā)明精神和范圍的所述實施方案的許多修飾、變更和變化是可能的。因此，本發(fā)明意 在不限于具體描述的實施方案，而是被賦予在法律之下享有的全部范圍。
[0167] 表2a?群7 2x2分析(V 彡 100 mL, N = 236)
表2b.群7 Gleason分數(shù)分析(V 彡 100 mL, N = 236)
表2c.群7分析（V 彡 100 mL, N = 236)
表2d?群7四分位數(shù)分析(V彡100 mL，N = 236)
表2e?群7四分位數(shù)分析(V彡100 mL，N = 236)
表3a?群7 2x2分析(V 彡 40 mL, N = 189)
表3b.群7 Gleason分數(shù)分析(V < 40 mL, N = 189)
表3c.群7分析(V 彡 40 mL, N = 189)
表3d?群7四分位數(shù)分析(V彡40 mL，N = 189)
表3e?群7四分位數(shù)分析(V彡40 mL，N = 189)
表4a?群7 2x2分析(V 彡 20 mL, N = 122)
表4b?群7 Gleason分數(shù)分析(V 彡 20 mL, N = 122)
表4c.群7分析(V < 20 mL，N = 122)_
表4d.群7四分位數(shù)分析（V < 20 mL，N = 122)
表4e.群7四分位數(shù)分析(V < 20 mL，N = 122)
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Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single- strand conformation polymorphisms (通過凝膠電泳檢測人DNA多態(tài)性作為單鏈構(gòu)象多 態(tài)性）? Proc Natl Acad Sci U S A. 86:2766-70. Orozco, A.F?和D.E. Lewis. 2010. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma (血楽中循環(huán)微粒的流式細胞分析）? Cytometry A. 77:502-14. Palanisamy, N., B. Ateeq， S. Kalyana-Sundaram， D. Pflueger， K. Ramnarayanan， S. Shankar, B. Han, Q. Cao， X. Cao， K. Suleman， C. Kumar-Sinha， S. M. Dhanasekaran， Y.B. Chen, R. Esgueva, S. Banerjee， C.J. LaFargue， J. Siddiqui， F. Demichelis， P. Moeller, T.A. Bismar， R. Kuefer， D.R. Fullen， T. M. Johnson, J.K. Greenson， T.J. Giordano, P. Tan, S.A. Tomlins, S. Varambally, M.A. Rubin, C.A. Maher和A.M. Chinnaiyan. 2010. Rearrangements of the RAF kinase pathway in prostate cancer, gastric cancer and melanoma (前列 腺癌、胃癌和黑色素瘤中RAF激酶通路的重排）.Nat Med. 16:793-8. Petrovics, G., A. Liu, S. Shaheduzzaman， B. Furusato， C. Sun, Y. Chen, M. Nau， L. Ravindranath, A. Dobi， V. 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TMPRSS2:ERG fusion transcripts in urine from prostate cancer patients correlate with a less favorable prognosis (前列腺癌患者尿中的TMPRSS2:ERG融合 轉(zhuǎn)錄物與差預(yù)后相關(guān)）.APMIS. 117:575-82. Salami, S.S., F. Schmidt, B. Laxman, M.M. Regan, D.S. Rickman, D. Scherr， G. Bueti， J. Siddiqui， S.A. Tomlins, J.T. Wei, A.M. Chinnaiyan, M.A. Rubin和 M.G. Sanda. 2011. Combining urinary detection of TMPRSS2:ERG and PCA3 with serum PSA to predict diagnosis of prostate cancer (組合TMPRSS2:ERG和PCA3的尿 檢測與血清PSA以預(yù)測前列腺癌途斷）.Urol Oncol. Skog， J., T. ffurdinger, S. van Rijn, D.H. Meijer， L. Gainche， M. Sena-Esteves, ff. T. Curry, Jr. , B. S. Carter, A.M. Krichevsky和X?0? Breakefield. 2008. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers (促進腫瘤生長和提供途斷生物標 志物的惡性膠質(zhì)瘤微泡轉(zhuǎn)運RNA和蛋白）.Nat Cell Biol. 10:1470-6. Steemers， F.J., ff. Chang, G. Lee, D.L. Barker, R. Shen和K.L. Gunderson. 2006. 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Chakravarti. 2005. Survivin mediates resistance to antiandrogen therapy in prostate cancer (存活素介導對
【主權(quán)項】
1. 用于有需要的受試者中前列腺癌的診斷、預(yù)后、監(jiān)測或治療選擇的方法，所述方法包 括以下步驟： a. 從受試者獲得隨機尿樣品； b. 從樣品提取一種或多種mRNA; c. 檢測PCA3和ERG的mRNA表達水平； d. 將PCA3和ERG的mRNA表達水平歸一化至SPDEF; e. 使用式： 't- 計算歸一化的PCA3和ERG的mRNA表達水平的輸出值以產(chǎn)生ΕΧ0106分數(shù);和 f. 比較EX0106分數(shù)與使用基于PCA3和ERG的組合產(chǎn)生的ROC曲線測定的預(yù)定截斷值以 區(qū)分處于高前列腺癌風險的受試者與具有低前列腺癌風險的受試者。2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述隨機尿樣品為從膀胱中排出的第一個40 mL。3. 權(quán)利要求1的方法，其中所述隨機尿樣品為從膀胱中排出的第一個20 mL。4. 權(quán)利要求1的方法，其中所述預(yù)定截斷值為EX0106分數(shù)10,其中10或更高的EX0106分 數(shù)表明受試者處于高前列腺癌風險。5. 權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其中步驟(a)進一步包括從隨機尿樣品分離微泡部分 并從微泡部分提取一種或多種核酸。6. 權(quán)利要求5的方法，其中分離微泡部分的步驟包括處理樣品以去除細胞及細胞碎片 和通過將微泡部分暴露于超濾或過濾濃縮器而濃縮微泡部分，和洗滌微泡部分，然后從微 泡部分提取一種或多種核酸。7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述方法進一步包括從微泡部分提取一種或多種核酸之前 向微泡部分加入RNA酶抑制劑。8. 權(quán)利要求1-7中任一項的方法，進一步包括在步驟（d)中檢測選自AMACR、BIRC5、 H0XC6和SPARCL1的一種或多種基因的表達水平。9. 權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中在步驟(b)之前向尿樣品中加入已知量的Q-β顆 粒，并且其中在步驟(c)中檢測Q-β靶基因的表達水平，并且其中將檢測到的表達水平與已 知量比較。10. 權(quán)利要求1-9中任一項的方法，其中所述癌癥為侵襲性癌癥。11. 用于有需要的受試者中Gleason分數(shù)大于6的高Gleason分數(shù)前列腺癌的診斷、預(yù) 后、監(jiān)測或治療選擇的方法，所述方法包括以下步驟： a. 從受試者獲得隨機尿樣品； b. 從樣品提取一種或多種mRNA; c ·檢測PCA3和ERG的mRNA表達水平； d. 將PCA3和ERG的mRNA表達水平歸一化至SPDEF; e. 使用式： Il ：1 ：) , , ： tissp.： fi? lilt. 5 , ,.,. '' A u 、、、、 'r 、 、 計算歸一化的PCA3和ERG的mRNA表達水平的輸出值以產(chǎn)生EX0106分數(shù);和 f.比較EX0106分數(shù)與使用基于PCA3和ERG的組合產(chǎn)生的ROC曲線測定的預(yù)定截斷值以 區(qū)分處于Gleason分數(shù)大于6的高Gleason分數(shù)前列腺癌的高風險的受試者與具有Gleason 分數(shù)大于6的高Gleason分數(shù)前列腺癌的低風險的受試者。12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述隨機尿樣品為從膀胱中排出的第一個40 mL。13. 權(quán)利要求11的方法，其中所述隨機尿樣品為從膀胱中排出的第一個20 mL。14. 權(quán)利要求11的方法，其中所述預(yù)定截斷值為EX0106分數(shù)10,其中10或更高的EX0106 分數(shù)表明受試者處于Gleason分數(shù)大于6的高Gleason前列腺癌的高風險。15. 權(quán)利要求11-14中任一項的方法，其中步驟(a)進一步包括從隨機尿樣品分離微泡 部分并從微泡部分提取一種或多種核酸。16. 權(quán)利要求15的方法，其中所述分離微泡部分的步驟包括處理樣品以去除細胞及細 胞碎片和通過將微泡部分暴露于超濾或過濾濃縮器而濃縮微泡部分，和洗滌微泡部分，然 后從微泡部分提取一種或多種核酸。17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述方法進一步包括從微泡部分提取一種或多種核酸之 前向微泡部分加入RNA酶抑制劑。18. 權(quán)利要求11-17中任一項的方法，進一步包括在步驟(d)中檢測選自AMACR、BIRC5、 H0XC6和SPARCL1的一種或多種基因的表達水平。19. 權(quán)利要求11-18中任一項的方法，其中在步驟(b)之前向尿樣品中加入已知量的Q-β 顆粒，并且其中在步驟(c)中檢測Q-β靶基因的表達水平，并且其中將檢測到的表達水平與 已知量比較。20. 權(quán)利要求11-19中任一項的方法，其中所述癌癥為侵襲性癌癥。
【文檔編號】C12Q1/68GK106029900SQ201480054985
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年8月6日
【發(fā)明人】J.K.O.斯科格, M.諾爾霍爾姆
【申請人】外來體診斷公司