草酸青霉eu2101及其在制備纖維素酶制劑與降解纖維素中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了草酸青霉(Penicillium oxalicum)EU2101及其在制備纖維素酶制劑與降解纖維素中的應用。本發(fā)明公開的草酸青霉EU2101的保藏編號為CGMCC No.12769。本發(fā)明還提供了利用草酸青霉EU2101制備的纖維素酶制劑，其制備方法包括用培養(yǎng)基在28?42℃下培養(yǎng)草酸青霉EU2101，收集發(fā)酵產(chǎn)物，得到纖維素酶制劑。本發(fā)明的實驗證明草酸青霉EU2101經(jīng)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后，其浸提液具有纖維素酶活力，包括濾紙酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力，可以高效水解堿預處理的木薯渣產(chǎn)生葡萄糖，在木薯渣的轉化和利用中具有應用潛力。CGMCC No.1276920160714
【專利說明】
草酸青霉EU2101及其在制備纖維素酶制劑與降解纖維素中的 應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域中草酸青霉EU2101及其在制備纖維素酶制劑與降解纖 維素中的應用。
【背景技術】
[0002] 隨著人口的不斷增加，煤炭、石油等不可再生的化石能源的迅速消耗及化石能源 的使用所帶來的嚴峻環(huán)境問題，使得人們逐漸意識到尋找一種可再生的，對環(huán)境友好的新 能源的重要性。纖維素來源的燃料乙醇比汽油具有更高的辛燒值，帶來更少的尾氣排放，使 得燃料乙醇被廣泛認為是化石能源的替代品或化石能源中的添加劑。
[0003] 木質(zhì)纖維素類物質(zhì)是世界上含量最豐富，分布最廣泛的可再生生物資源化化ad, R.C.,Singh,A.,Eriksson,K.E.L.1997.Microorganisms and enzymes involved in the degradation of plant fiber cell walIs[M]. Springer Berlin Heidelberg)。全球每年 可W產(chǎn)數(shù)千億噸的木質(zhì)纖維素類物質(zhì)。如果可W利用生物轉化技術將運些含量豐富的纖維 素類物質(zhì)轉化為可發(fā)酵的糖，然后再轉化成燃料乙醇，不僅可W解決能源緊張和糧食短缺 等全球性問題，而且在一定程度上緩解化石能源所帶來的一系列環(huán)境問題。第一代燃料乙 醇的生產(chǎn)大都是W玉米淀粉等糧食為原料，但是，其大規(guī)模應用將導致糧食短缺等問題。第 二代燃料乙醇的生產(chǎn)為了避免W上問題，W賴桿、麥教等農(nóng)業(yè)廢棄物、食品加工廢物和城市 固體廢棄物等非糧食類的纖維素類物質(zhì)為原料。第二代燃料乙醇工業(yè)不僅可W變廢為寶， 而且可W有效地避免燃燒賴桿或廢棄物堆積所帶來的環(huán)境污染問題。
[0004] 木質(zhì)纖維素類物質(zhì)轉化為燃料乙醇的生物煉制主要分成3個步驟:木質(zhì)纖維素材 料的預處理、木質(zhì)纖維素被酶解成可發(fā)酵的單糖、微生物發(fā)酵生產(chǎn)酒精（Saini，R.，Saini， J.K.,Adsul,M., Patel,A.K.,Mathur,A.,Tuli,D.,Singhania,R.R.2015. Enhanced cellul曰se production by Penicillium ox曰licum for bio-eth曰nol 曰pplic曰tion[J] .Bioresource Technology, 188:240-246)。木質(zhì)纖維素水解酶包括纖維素酶和半纖維素酶 等的生產(chǎn)成本過高嚴重阻礙了木質(zhì)纖維素生物煉制的商業(yè)化進程（Deswal，D.，Khasa, Y.P.,Kuhad,R.C.2011.Optimization of cellulase production by a brown rot fungus Fomitopsis sp.RCK2010under solid state fermentation[J].Bioresource Technology,102:6065-6072)〇
[0005] 纖維素酶是一種復合酶，根據(jù)催化功能的不同，纖維素酶可分為=類：（1)內(nèi)切葡 聚糖酶(endo-1，4-0-D-glucanase，EC 3.2.1.4)，又稱Cx酶。內(nèi)切葡聚糖酶隨機切割非結晶 區(qū)纖維素分子的e-1,4-糖巧鍵，將纖維素分子長鏈降解成短鏈纖維素分子，同時產(chǎn)生大量 含有非還原性末端的纖維素小分子。（2)外切葡聚糖酶（exo-1，4-0-D-glucanase， EC3.2.1.91)，又稱Cl酶、纖維二糖水解酶。外切葡聚糖酶W纖維二糖為單位從纖維素分子 的末端降解纖維素分子鏈。與內(nèi)切葡聚糖酶不同，外切葡聚糖酶可直接作用于纖維素分子 的結晶區(qū)。（3)0-葡萄糖巧酶(0-glucosidase，EC 3.2.1.21)，簡稱BGLdP-葡萄糖巧酶水解 纖維二糖和纖維寡糖生成葡萄糖(Jutu;ru,V. ,and Wu,J.C.2014.Microbial cellulases: Engineering,production and applications[J].Renewable and Sustainable Energy Reviews ,33:188-203；Wang ,J., Quirk , A.,Lipkowski,J., Butcher ,J.R., Clarke , A.J.2013.Direct in situ observation of synergism between cellulolytic enzymes during the biodegradation of crystalline cellulose fibers[J]. Langmuir,29: 14997-15005)〇
[0006] 纖維素酶廣泛存在于微生物及動植物中，但是主要來源于絲狀真菌，其中木霉屬 (Trichoderma)、曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(PeniciIlium)的菌株產(chǎn)纖維素酶能力強。 目前，木霉屬是研究最多的纖維素酶產(chǎn)生菌，且工業(yè)上的應用也較多。雖然木霉屬的纖維素 酶產(chǎn)量較高且酶系比較完整，但胞外0 -葡萄糖巧酶活力較低（G U S a k 0 V， A.V.2011 .Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production!!J].Trends in Biotechnology，29:419-425)，在生產(chǎn)中需要添加額外的0-葡萄糖巧酶或者和0-葡萄糖 巧酶高產(chǎn)菌株一起發(fā)酵產(chǎn)酶（Dhi lion, G.S.，0beroi H.S.，Dhi lion, K.S.，Brar, S.K.2011.Value-addition of agricultural wastes for augmented cellulase and xylanase production through solid-state tray fermentation employing mixed- culture of fungi[J]. Industrial Crops 曰nd Products,34:1160-1167)〇
[0007] 最近實驗證明青霉屬菌株可w產(chǎn)生完整的纖維素酶系及高活力的e-葡萄糖巧酶 (Gusakov,A.V.2011.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production [J].lYends in Biotechnology,29:419-425;Ng,I.S.,Li,C.W.,Chan,S.P.'Chir'J.L., Chen,P.T. ,Tong,C.G.,Yu,S.M., Ho,T.H.2010.High-level production of a thermoacidophilic beta-glucosidase from Penicillium citrinum YS40-5by solid- state fermentation with rice bran[J].Bioresource Technology,101:1310-1317; Zhang,H.,Sang,Q.2012.Statistical optimization of cellulases production by Penicillium chrysogenum QML-2under solid-state fermentation and primary application to chitosan hydrolysis[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，28:1163-1174)。但是，青霉屬菌株產(chǎn)纖維素酶活力和產(chǎn)量離大規(guī)模的工業(yè) 應用差距還很大。因此，經(jīng)濟可行的制備高活力纖維素酶制劑方法的開發(fā)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明所要解決的技術問題是如何水解纖維素 W及制備纖維素酶制劑。
[0009]為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了草酸青霉（Penicillium oxalicum) 抓 2101。
[0010] 本發(fā)明所提供的草酸青霉抓2101，已于2016年07月14日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保 藏編號為〔61〇：齡.12769，下文稱為草酸青霉抓2101〔61〇：齡.12769。
[0011] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了一種菌劑。
[001^ 本發(fā)明所提供的菌劑的活性成分為草酸青霉抓2101CGMCC No.12769。
[0013] 上述菌劑可為下述1)或2)所述菌劑：
[0014] 1)用于降解纖維素的菌劑；
[0015] 2)用于降解含纖維素物質(zhì)的菌劑。
[0016] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了用于培養(yǎng)草酸青霉抓2101CGMCC No. 12769 的培養(yǎng)基。
[0017] 本發(fā)明所提供的用于培養(yǎng)草酸青霉抓2101CGMCC No. 12769的培養(yǎng)基，由農(nóng)業(yè)有機 廢棄物與鹽溶液組成，其中，所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物與所述鹽溶液的配比為Ig: (0.5-3)血，所 述培養(yǎng)基的抑值為3-8;所述鹽溶液由水、K此P〇4、氮源、MgS化? 7出0、吐溫80和微量元素母 液組成，每升所述鹽溶液含K此P〇4 2.5g、所述氮源5g、MgS化-7出0 2.5g、吐溫80 Ig、所述 微量元素母液〇.111〇^;所述微量元素母液由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶質(zhì)及其 濃度分別為化504*7出0 5邑/1、]?記04*出0 1.6邑/1、211504*7出0 1.4邑/1、(：〇(：12 2.0邑/1。
[0018] 上述培養(yǎng)基中，所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物是指農(nóng)業(yè)加工及農(nóng)民日常生活過程中產(chǎn)生的 有機廢棄物，主要W賴桿、樹葉、雜草和木屑為主，還包括相應的糧食品加工廠、釀造廠、農(nóng) 副產(chǎn)品加工廠的下腳料、力旺殘渣，如慷皮、麥教、糟渣、玉米忍、豆芙、花生殼、棉巧殼等。所 述農(nóng)業(yè)有機廢棄物具體可為麥教、稻桿、米慷、甘薦渣和/或玉米忍。
[0019] 上述培養(yǎng)基中，所述氮源可為酵母提取物、硫酸錠、尿素、蛋白腺、硝酸鋼、硝酸錠 和/或氯化錠。
[0020] 上述培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基的pH值可為4-7,如5-6。
[0021] 上述培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基中所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物與所述鹽溶液的配比可為Ig: (0.5-3)mL。所述培養(yǎng)基中所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物與所述鹽溶液的配比進一步可為Ig: (0.5- 2)mL，如Ig:1.5mL。
[0022] 上述培養(yǎng)基中，所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物顆粒大小可為0.2-0.9mm。所述農(nóng)業(yè)有機廢棄 物顆粒大小具體可為0.3-0.9mm。進一步所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物顆粒大小可為0.3-0.45mm。
[0023] 上述培養(yǎng)基中，所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物為麥教和稻桿，所述培養(yǎng)基中麥教、稻桿與所 述鹽溶液的配比為（2-8)g:(2-8)g:20mL。所述培養(yǎng)基中麥教、稻桿與所述鹽溶液的配比具 體可為（4-6) g: (4-6) g: 20mL，如4g: 6g: 20mL或6g: 4g: 20mL。
[0024] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了下述任一產(chǎn)品：
[00巧]?1)、利用草酸青霉抓2101〔61〇：齡.12769制備的降解纖維素的產(chǎn)品；
[0026] P2)、利用所述菌劑制備的降解纖維素的產(chǎn)品；
[0027] ?3)、利用草酸青霉抓2101〔61〇：齡.12769制備的纖維素酶；
[0028] P4)、利用所述菌劑制備的纖維素酶。
[0029] 上述產(chǎn)品中，P1)所述降解纖維素的產(chǎn)品的活性成分可為草酸青霉抓2101CGMCC No.12769；
[0030] P2)所述降解纖維素的產(chǎn)品的活性成分可為所述菌劑。
[0031] 上述產(chǎn)品中，P1)所述降解纖維素的產(chǎn)品可為纖維素酶制劑，所述纖維素酶制劑的 制備方法，包括:用所述培養(yǎng)基在28-42°C下培養(yǎng)草酸青霉EU2101CGMCC No. 1276則欠集發(fā)酵 產(chǎn)物，得到纖維素酶制劑。
[0032] 上述產(chǎn)品中，培養(yǎng)草酸青霉抓2101CGMCC齡.12769的溫度可為28-37°(：。進一步， 培養(yǎng)草酸青霉抓2101CGMCC齡.12769的溫度可為28-32°(：。
[0033] 上述產(chǎn)品中，培養(yǎng)草酸青霉抓2101CGMCC No. 12769的時間可為3-8天。進一步，培 養(yǎng)草酸青霉抓2101CGMCC No. 12769的時間可為6-8天。
[0034] 上述產(chǎn)品中，所述纖維素酶制劑的制備方法還可包括:浸提所述發(fā)酵產(chǎn)物，得到浸 提產(chǎn)物，將所述浸提產(chǎn)物進行離屯、，收集上清液，該上清液即為得到纖維素酶制劑。
[0035] 其中，浸提所述發(fā)酵產(chǎn)物可用水(如去離子水)進行。
[0036] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了下述Ml)或M2)或M3)的方法：
[0037] Ml)降解纖維素或含纖維素物質(zhì)的方法，包括:將權利要求8中所述纖維素酶制劑 與纖維素或含纖維素物質(zhì)在5(TC下于抑為5的環(huán)境中進行反應來降解纖維素；
[0038] M2)所述纖維素酶制劑的制備方法；
[0039] M3)培養(yǎng)草酸青霉抓2101CGMCC No. 12769的方法，包括用所述培養(yǎng)基在28-42°C下 培養(yǎng)草酸青霉抓2101CGMCC No.12769。
[0040] 上述方法中，所述抑為5的環(huán)境中可為pH為5的化抽P化-巧樣酸緩沖液。所述抑為5 的化油P〇4-巧樣酸緩沖液為用化油P〇4與巧樣酸制備的pH為5的緩沖液。所述pH為5的 NasHP化-巧樣酸緩沖液的制備方法具體可為將0.2M化抽P化水溶液和0.1M巧樣酸水溶液按 10.3 : 9.7的體積比混合得到的溶液，其中化2冊〇4和巧樣酸的濃度分別可為0.103M、 0.0485M。
[0041] 上述方法中，所述含纖維素物質(zhì)具體可為木馨渣、麥教、稻桿、米慷、甘薦渣和/或 玉米忍等含有纖維素的農(nóng)業(yè)有機廢棄物。所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物是指農(nóng)業(yè)加工及農(nóng)民日常生 活過程中產(chǎn)生的有機廢棄物，主要W賴桿、樹葉、雜草和木屑為主，還包括相應的糧食品加 工廠、釀造廠、農(nóng)副產(chǎn)品加工廠的下腳料、加工殘渣，如慷皮、麥教、糟渣、玉米忍、豆芙、花生 殼、棉巧殼等。
[0042] 上述方法中，所述木馨渣具體可為用NaOH與出化處理后的木馨渣。
[0043] 上述方法中，所述含纖維素物質(zhì)（底物）的濃度可為(20-80)g/L反應體系。所述含 纖維素物質(zhì)(底物)的濃度可為(40-80)肖/1反應體系，如60肖/1反應體系。
[0044] 上述方法中，所述纖維素酶制劑的濃度可為l-30FPU/g底物，進一步可為5-30FPU/ g底物，進一步可為10-30FPU/g底物，進一步可為20-30FPU/g底物。
[0045] 上述降解纖維素或含纖維素物質(zhì)的方法中，所述反應時間可為0-96小時(不包括0 小時）。進一步可為3-96小時，進一步可為6-96小時，進一步可為12-96小時，進一步可為24- 96小時，進一步可為48-96小時，進一步可為72-96小時。
[0046] 上述培養(yǎng)草酸青霉抓2101CGMCC齡.12769的溫度可為28-37°(：。進一步，培養(yǎng)草酸 青霉抓2101CGMCC No. 12769的溫度可為28-32°C。
[0047] 為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了下述X1)、X2)或X3):
[004引 XI)草酸青霉抓2101CGMCC齡.12769或所述菌劑在下述曰1)-曰6)中任一種中的應 用：
[0049] al)在降解纖維素或含纖維素物質(zhì)中的應用；
[0050] a2)在制備降解纖維素或含纖維素物質(zhì)產(chǎn)品中的應用；
[0051 ] a3)在制備纖維素酶中的應用；
[0052] a4)在制備生產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)品中的應用；
[0053] a5)在制備葡萄糖、纖維二糖或燃料乙醇中的應用；
[0054] a6)在制備生產(chǎn)葡萄糖、纖維二糖或燃料乙醇產(chǎn)品中的應用；
[0055] X2)所述培養(yǎng)基在上述曰2)、曰4)或曰6)中的應用；
[0056] X3)所述產(chǎn)品在上述al)-a6)中任一種中的應用。
[0057] 上述應用中，所述含纖維素物質(zhì)具體可為木馨渣、麥教、稻桿、米慷、甘薦渣和/或 玉米忍等含有纖維素的農(nóng)業(yè)有機廢棄物。所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物是指農(nóng)業(yè)加工及農(nóng)民日常生 活過程中產(chǎn)生的有機廢棄物，主要W賴桿、樹葉、雜草和木屑為主，還包括相應的糧食品加 工廠、釀造廠、農(nóng)副產(chǎn)品加工廠的下腳料、加工殘渣，如慷皮、麥教、糟渣、玉米忍、豆芙、花生 殼、棉巧殼等。所述木馨渣具體可為用NaOH與出化處理后的木馨渣。
[0058] 本發(fā)明中，纖維素酶酶活力包括內(nèi)切葡聚糖酶酶活力、纖維二糖水解酶酶活力和/ 或e-葡萄糖巧酶酶活力。纖維素酶酶活力具體可體現(xiàn)在濾紙酶活力、簇甲基纖維素酶活力 (CMC酶活力）、結晶纖維素酶活力(Avicel酶活力）、對硝基苯基-0-D-纖維二糖巧纖維素酶 活力(pNPC酶活力)和/或?qū)ο趸交?a-D-化喃葡萄糖巧纖維素酶活力(pNPG酶活力)上。
[0059] 本發(fā)明的實驗證明草酸青霉抓2101經(jīng)固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)后，其浸提液具有纖維素酶活 力，包括濾紙酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力。其浸提液可W 高效水解堿預處理的木馨渣產(chǎn)生葡萄糖，在木馨渣的轉化和利用中具有應用潛力。本發(fā)明 得到的草酸青霉抓2101，可W生產(chǎn)纖維素酶制劑，該制劑可W高效地水解預處理的木馨渣。 該制劑可W用于生產(chǎn)酒精。
[0060] 生物材料保藏說明
[0061] 生物材料的分類命名:草酸青霉(Penicilli皿oxalic皿）
[0062] 生物材料的菌株編號:EU2101
[0063] 生物材料的保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、
[0064] 生物材料的保藏單位簡稱:CGMCC
[0065] 生物材料的保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物 研究所，郵政編碼:100101
[0066] 生物材料的保藏日期:2016年07月14日
[0067] 生物材料的保藏中屯、登記入冊編號:CGMCC No. 12769
【附圖說明】
[006引圖1為草酸青霉抓2101發(fā)酵培養(yǎng)基最適初始抑優(yōu)化實驗結果。
[0069] 圖2為草酸青霉抓2101發(fā)酵最適溫度優(yōu)化實驗結果。
[0070] 圖3為草酸青霉抓2101發(fā)酵培養(yǎng)基最適固液比優(yōu)化實驗結果。
[0071] 圖4為草酸青霉抓2101發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源的優(yōu)化實驗結果。
[0072] 圖5為草酸青霉抓2101發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源顆粒大小的優(yōu)化實驗結果。
[0073] 圖6為草酸青霉抓2101發(fā)酵培養(yǎng)基組合碳源最佳濃度的優(yōu)化實驗結果。
[0074] 圖7為草酸青霉抓2101發(fā)酵培養(yǎng)基最佳氮源的優(yōu)化實驗結果。
[0075] 圖8為草酸青霉抓2101發(fā)酵培養(yǎng)最佳時間的優(yōu)化實驗結果。
[0076] 圖9為不同底物濃度對纖維素酶制劑水解預處理木馨渣的影響。
[0077] 圖10為不同纖維素酶制劑添加量對水解預處理木馨渣的影響。
【具體實施方式】
[0078] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0079] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0080] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0081] 下述實施例中的麥教為小麥教，米慷為水稻米慷，麥教、米慷、稻桿、玉米忍和甘薦 渣的含水量均在5% W下。
[0082] 下文中，pH 5.0的化抽P化-巧樣酸緩沖液為將0.2M化抽P〇4水溶液和0.1M巧樣酸 水溶液按10.3:9.7的體積比混合而的得到的化抽K)4濃度為0.103M、巧樣酸濃度為0.0485M 的溶液。
[0083] 下面的葡萄糖標準曲線的繪制、木糖標準曲線的繪制、對硝基苯酪標準曲線的繪 審IJ、濾紙酶活力的測定、簇甲基纖維素酶活力的測定、Avicel酶活力的測定、木聚糖酶活力 的測定、pNPG酶活力的測定、pNPC酶活力的測定W及木馨渣纖維素的含量均按照如下方法 進行：
[0084] 1.葡萄糖標準曲線的繪制
[0085] 稱取O.lg葡萄糖標準品，用去離子水配制Img/mL濃度的葡萄糖標準溶液。按表1的 配方將試劑加入2mL離屯、管中，混勻，沸水浴10分鐘顯色后，取出樣品冷卻至室溫(DNS試劑 在反應結束后加入，用來終止反應）。在12,000rpm條件下離屯、2分鐘，吸取2(K)化上層溶液至 96孔酶標板中，在540nm波長下測定其吸光值并繪制葡萄糖的標準曲線，得到的線性回歸方 程為 Y = 3.6433X-0.0325，方差 r2 = 0.9993。
[0086] 表1、葡萄糖標準曲線溶液的組分
[0087]
[008引表1中的緩沖液為抑5.0的NasHP化-巧樣酸緩沖液。
[0089] 2.木糖標準曲線的繪制
[0090] 稱取0.1 g木糖標準品，用去離子水配制Img/mL濃度的木糖標準溶液。按表2的配方 將試劑加入2mL離屯、管中混勻，沸水浴10分鐘顯色后，取出樣品冷卻至室溫(DNS試劑在反應 結束后加入，用來終止反應）。待樣品冷卻至室溫，在12,000巧m條件下離屯、2分鐘，吸取20化 L上層溶液至96孔酶標板中，在540nm波長下測定其吸光值并繪制木糖的標準曲線，其線性 回歸方程為Y = 3.739X-0.1503，方差 r2 = 0.9994。
[0091] 表2、木糖標準曲線溶液的組分
[0092]
[0093] 表2中的緩沖液為抑5.0的NasHP化-巧樣酸緩沖液。
[0094] 3.對硝基苯酪標準曲線的繪制
[00M]用去離子水配制lOmM的對硝基苯酪（pNP)標準溶液。按表3的配方將試劑加入 1.5mL離屯、管中混勻（pNP濃度為將pNP標準溶液和緩沖液混合后計算的終濃度。）。在 1200化pm條件下離屯、2分鐘，吸取20化L上層溶液至96孔酶標板中，在410nm波長下測定其吸 光值并繪制對硝基苯酪的標準曲線，標準曲線線性回歸方程為Y = 6.3918x+0.0023,方差R2= 0.9999。
[0096] 表3、pNP標準曲線溶液的組分
[0097]
[009引表3中的緩沖液為抑5.0的NasHP化-巧樣酸緩沖液。
[0099] 4.濾紙酶活力的測定
[0100] 濾紙酶活力的測定參照Ghose的方法（Ghose , T . K . 1959 . Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Qiemistry.59:257-268)進行，具體方法如 下：
[0101] (1)取 1 X6cm大小怖atmani號濾紙(Whatman?,Cat NO. 1001917)，將濾紙折疊放置 于lOmL的離屯、管底，加入ImL pH 5.0的化2冊化-巧樣酸緩沖液，使濾紙完全被緩沖液浸沒， 將樣品置于55°C的恒溫水浴鍋中預熱至溫度恒定。
[0102] (2)向上述lOmL離屯、管中加入500化待測酶液，對照組為滅活的酶液，55°C溫度反 應60分鐘，每10分鐘晃動混勻一次。
[0103] (3)向上述1 OmL離屯、管中加入3mL DNS試劑終止反應，沸水浴10分鐘，取出樣品冷 卻至室溫。
[0104] (4)待樣品冷卻至室溫，吸取2(K)化上層溶液至96孔酶標板中，在540nm波長下測定 吸光值。并根據(jù)葡萄糖標準曲線的線性回歸方程計算出葡萄糖的濃度，再通過葡萄糖的濃 度計算出濾紙酶活力。
[0105] 濾紙酶活力單位化)定義為:在抑5.0,55°C條件下，每分鐘催化生成1皿oL還原糖 所需要的酶量為一個單位，濾紙酶產(chǎn)量化/gds)定義為:在pH 5.0，55°C反應條件下，每克干 基質(zhì)（gram化ied substrate)所含有的濾紙酶活力。
[0106] 5.簇甲基纖維素酶活力的測定
[0107] 簇甲基纖維素酶活力（CMC酶活力）的測定參照Go化ale的方法(Gokhale，D.V.， Puntambekar,U.S.,Deobagkar,D.N.,Peberby,J.F.1988.Production of cellulolytic enzymes by mutants of Aspergillus niger NCIM 1207[J].Enzyme&Microbial Technology, 10:442-445)進行，具體如下：
[010引 （1)向2mL的離屯、管中加入450化的Img/mL的CMC溶液（CMC溶液為用pH 5.0的 NasHPO廣巧樣酸緩沖液溶解CMC得到的溶液），置于60°C的水浴鍋中預熱至溫度恒定。
[0109] (2)向上述2mL的離屯、管中加入50化待測酶液，對照組為滅活的酶液，60°C反應30 分鐘，每10分鐘晃動混勻一次。
[0110] (3)向上述2mL的離屯、管中加入ImL的DNS試劑終止反應，沸水浴10分鐘，取出樣品 冷卻至室溫。
[0111] (4)待樣品冷卻至室溫，12，00化pm離屯、2分鐘。吸取20化L上層溶液至96孔酶標板 中，在54化m波長下測定吸光值。并根據(jù)葡萄糖標準曲線的線性回歸方程計算出還原糖的濃 度，再通過還原糖的濃度計算出簇甲基纖維素酶活力。
[0112] 簇甲基纖維素酶活力單位(U)定義為:在pH 5.0,6(TC反應條件下，每分鐘催化生 成1皿化還原糖所需要的酶量為一個單位。簇甲基纖維素酶產(chǎn)量化/gds)定義為:在抑5.0， 6(TC反應條件下，每克干基質(zhì)所含有的簇甲基纖維素酶活力。
[0113] e.Avicel酶活力的測定
[0114] Avicel酶活力的測定參照加 ose的方法（Ghose ,T.K. 1959 .Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Qiemistry.59:257-268)進行，具體如下：
[0115] (1)向2mL的離屯、管中加入450化的Img/ml的Avicel水溶液(Avicel溶液為用pH 5.0的化抽P〇4-巧樣酸緩沖液溶解Avicel得到的溶液），置于55°C的水浴鍋中預熱至溫度恒 定。
[0116] (2)向上述2mL的離屯、管中加入50化待測酶液，對照組為滅活的酶液，55°C反應60 分鐘，每10分鐘晃動混勻一次。
[0117] (3)向上述2mL的離屯、管中加入ImL的DNS試劑終止反應，沸水浴10分鐘，取出樣品 冷卻至室溫。
[011引 （4)待樣品冷卻至室溫，12，00化pm離屯、2分鐘。吸取20化L上層溶液至96孔酶標板 中，在54化m波長下測定吸光值。并根據(jù)葡萄糖標準曲線的線性回歸方程計算出還原糖的濃 度，再通過還原糖的濃度計算出Avicel酶活力。
[0119] Avicel酶活力單位化)定義為:在抑5.0,55°C反應條件下，每分鐘催化生成1皿〇1 還原糖所需要的酶量為一個單位。Avicel酶產(chǎn)量(U/gds)定義為:在pH 5.0，55°C反應條件 下，每克干基質(zhì)所含有的Avicel酶活力。
[0120] 7.木聚糖酶活力的測定
[0121 ] 木聚糖酶活力的測定參照(ihose等人的方法（Ghose ,T .K. 1959 .Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Qiemistry.59:257-268)進行，具體如下：
[0122] (1)向2mL的離屯、管中加入45化L的Img/ml的木聚糖水溶液(木聚糖溶液為用抑5.0 的NasHPO廣巧樣酸緩沖液溶解木聚糖得到的溶液），置于60°C的水浴鍋中預熱至溫度恒定。
[0123] (2)向上述2mL的離屯、管中加入50化待測酶液，對照組為滅活的酶液，60°C反應10 分鐘，每2分鐘晃動混勻一次。
[0124] (3)向2mL的離屯、管中加入ImL的DNS試劑終止反應，沸水浴10分鐘，取出樣品冷卻 至室溫。
[0125] (4)待樣品冷卻至室溫，12，00化pm離屯、2分鐘。吸取20化L上層溶液至96孔酶標板 中，在540nm波長下測定吸光值。并根據(jù)木糖標準曲線的線性回歸方程計算出還原糖的濃 度，再通過還原糖的濃度計算出木聚糖酶活力。
[0126] 木聚糖酶活力單位化)定義為:在抑5.0,60°C反應條件下，每分鐘催化生成1皿oL 還原糖所需要的酶量為一個單位。木聚糖酶產(chǎn)量(U/gds)定義為:在抑5.0,60°C反應條件 下，每克干基質(zhì)所含有的木聚糖酶活力。
[0127] S.pNPG酶活力的測定
[01 巧]pNPG酶活力的測定參照Goldiale等人的方法（GoWiale ,D. V.,化ntambekar,!]. S., Deobagkar,D.N.,Peberby,J.F.1988.Production of cellulolytic enzymes by mutants of Aspergillus niger NCIM 1207[J].Enzyme&Microbial Technology,10:442-445)進 行，具體如下
[0129] (1)向1.5mL的離屯、管中加入14化25mM pNPG溶液（pNPG溶液為用pH 5.0的 NasHP化-巧樣酸緩沖液溶解pNPG得到的溶液)和11化L pH 5.0的化抽P化-巧樣酸緩沖液，充 分混勻后，將樣品置于70°C恒溫水浴鍋中預熱至溫度恒定。
[0130] (2)向上述1.5mL的離屯、管中加入10化待測酶液，70°C反應15分鐘。
[0131] (3)向上述1.5血的離屯、管中加入70化0.4M化2〇)3溶液終止反應，取出樣品冷卻 至室溫。
[0132] (4)待樣品冷卻至室溫，12，00化pm離屯、2分鐘，吸取20化L上層溶液至96孔酶標板 中，在410nm波長下測定吸光值并根據(jù)pNP濃度標準曲線的線性回歸方程計算出pNP的濃度， 再通過pNP的濃度計算出pNPG酶活力活力。
[0133] pNPG酶活力單位化)定義為:在抑5.0,70°C反應條件下，每分鐘催化生成1皿化的 pNP所需要的酶量為一個單位。pNPG酶產(chǎn)量化/gds)定義為:在pH 5.0，70°C反應條件下，每 克干基質(zhì)所含有的pNPG酶活力。
[0134] 9.PNPC酶活力的測定
[OUS] pNPC酶活力的測定參照Goldiale等人的方法（GoWiale ,D. V.,化ntambekar,!]. S., Deobagkar,D.N.,Peberby,J.F.1988.Production of cellulolytic enzymes by mutants of Aspergillus niger NCIM 1207[J].Enzyme&Microbial Technology,10:442-445)進 行，具體步驟如下：
[0136] (1)向1.5mL離屯、管中加入14化25mM pNPC溶液(pNPC溶液為用抑5.0的化抽P〇4- 巧樣酸緩沖液溶解pNPC得到的溶液)和5祉L pH 5.0的化抽Kk-巧樣酸緩沖液，充分混勻后 置于60°C恒溫水浴鍋中預熱至溫度恒定。
[0137] (2)向上述1.5mL的離屯、管中加入6祉L待測酶液，60°C反應15分鐘。
[013引 （3)向上述1.5血的離屯、管中加入70化0.4M化20)3水溶液終止反應，取出樣品冷 卻至室溫。
[0139] (4)待樣品冷卻至室溫，12，00化pm離屯、2分鐘，用移液槍吸取20化L上層溶液至96 孔酶標板中，在410nm波長下測定吸光值并根據(jù)pNP濃度標準曲線的線性回歸方程計算出 pNP的濃度，再通過pNP的濃度計算出纖維二糖水解酶活力。
[0140] pNPC酶活力單位化)定義為:在抑5.0,60°C反應條件下，每分鐘催化生成1皿化的 pNP所需要的酶量為一個單位。pNPC酶產(chǎn)量化/gds)定義為:在pH 5.0，60°C反應條件下，每 克干基質(zhì)所含有的pNPC酶活力。
[0141] 10.木馨渣中纖維素含量的測定
[0142] 木馨渣中纖維素含量的測定方法W美國國家能源部可再生能源實驗室的方法 (Sluiter,A.,Hames,B.,Ruiz,R.,Scarlata,C.,Sluiter,J.,Templeton,D.,Crocker, D.2012.Determin曰tion of structural carbohydrates and lignin in biomass.Technical .Report NREL/TP-510-42618-revised)，并略微做了一定的修改，具體 步驟如下：
[0143] (1)向加有〇.3g過40目篩的木馨渣的試管中添加3mL 72%(w/w)的硫酸溶液，充分 混勻，每個實驗組設置3個重復。
[0144] (2)將樣品置于30°C恒溫水浴鍋中溫浴60分鐘，每10分鐘充分混勻一次。
[0145] (3)取出樣品并向試管中加入84mL的去離子水，將樣品轉移至250mL的S角瓶中。
[0146] (4)將250mLS角瓶置于滅菌鍋高壓12rC反應60分鐘后，冷卻至室溫。
[0147] (5)用0.22皿的濾膜過濾ImL真空抽濾的濾液。
[014引（6)通過高效液相色譜法化化C)分析濾液中的組分(濃度為Img/mL的葡萄糖和木 糖作為標準品）。
[0149] (7)葡萄糖的測定：W每lOmL樣品加入0.384mL 72% (w/w)的硫酸的比例向標準樣 品中加入72% (w/w)的硫酸，在m°C條件下反應60分鐘，計算糖的回收率（％Rsugar):
[0150] % Rsugar = HPLC(g/L)/已知標準液濃度（g/L)
[0151 ] 標準樣就漸1皿L，標準樣品濃度5mg/mL，實驗組加入0.384mL 72% (w/w)硫酸，對照 組加入0.384mL超純水。甸甸糖損失率為：
[0152] %Rgiuc〇se = 88.71%
[0153] 樣品中單糖的實際濃度：
[0154] C(g/L) =CHPLCxf綱纖/( %Rgiuc〇se/100)
[0155] 通過單糖的實際濃度計算纖維素的含量，葡萄糖的校正系數(shù)為0.9
[0156] 實施例1、草酸青霉抓2101的鑒定
[0157] 草酸青霉抓2101是本申請的發(fā)明人實驗室原有的真菌菌株中，經(jīng)過誘變后篩選得 到產(chǎn)纖維素酶活力更高的菌株。W草酸青霉野生型菌株HP7-UCGMCC No. 10781)為出發(fā)菌 株，采用3輪C〇sD-丫射線福照，得到了一株濾紙酶活力較出發(fā)菌株HP7-1提高的突變株TC07- 4。再將TC07-4及其突變株抓122進行甲基橫酸乙醋化thylmethylsulfone，EMS)與紫外線 (ultraviolet，UV)復合誘變和篩選，最終得到突變株抓2101。
[0158] 具體操作為將菌株冊7-1進行(：〇 6<^-丫射線福照時，選擇致死率為85%左右對應劑 量下的抱子懸浮液對突變株進行大規(guī)模分離與篩選;而EMS與UV復合誘變處理的順序是，先 將突變株TC07-4分別進行EMS處理2地，2她和32h后在紫外線下照射5111111，6111111，7111111。結果 發(fā)現(xiàn)，不論是哪一種組合方案，致死率均達99%。因此，選取24h EMS處理和7min紫外線照射 抱子液進行大規(guī)模誘變、分離與篩選突變株，得到一株突變株EU122。再將突變株EU122用上 述同樣方法進行EMS與UV復合誘變。經(jīng)過分離、篩選，最后得到突變株抓2101。
[0159] 草酸青霉抓2101已于2016年07月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中屯、，保藏中屯、登記入冊編號:CGMCC No. 12769。
[0160] 實施例2、草酸青霉抓2101固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶條件的優(yōu)化 [0161 ]實驗重復=次，每次重復實驗的具體步驟如下：
[0162] -、抱子懸浮液的制備
[0163] 1.將PDA固體培養(yǎng)基115°C滅菌30min，得至帆)A平板。
[0164] 2.用0.1% (v/v，體積百分比濃度)吐溫80水溶液洗下在PDA平板上培養(yǎng)5天的草酸 青霉抓2101抱子，制備濃度為1 X 108個/mL的抱子懸浮液。
[0165] 二、培養(yǎng)基初始抑的優(yōu)化
[0166] 1.配制不同抑的發(fā)酵培養(yǎng)基
[0167] 配制基本培養(yǎng)基:基本培養(yǎng)基由麥教與鹽溶液組成，其中，麥教與鹽溶液的配比為 10.0邑：201111^。鹽溶液由水、1(出口04、（畑4)2504、1邑504?7此0、吐溫80和微量元素母液組成，每 升鹽溶液含1(此?04 2.5邑、（畑4)2504 5.0邑、1邑504.7此0 2.5邑、吐溫80 1.0邑、微量元素母液 0.1 mL。微量元素母液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶劑為水，每升微量元素母液中各溶質(zhì)的含量分 別為化504*7出0 5.0邑、]?記04*出0 1.6邑、211504*7出0 1.4邑、(：〇(：12 2.0邑。
[0168] 用5M HC1水溶液或化0H水溶液調(diào)芐基本培養(yǎng)基的pH，使其抑分別為3、4、5、6、7和 8,121°C高壓滅菌30min，分別得到抑為3的培養(yǎng)基、抑為4的培養(yǎng)基、pH為5的培養(yǎng)基、抑為6 的培養(yǎng)基、pH為7的培養(yǎng)基和pH為8的培養(yǎng)基。
[0169] 2.發(fā)酵培養(yǎng)
[0170] 將步驟一的抱子懸浮液按10% (v/w)分別接種至上述不同抑的培養(yǎng)基中，28°C恒 溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；向發(fā)酵產(chǎn)物中加入無菌去離子水(無菌去離子水與 發(fā)酵產(chǎn)物的體積比為10:1)，在28°C、180rpm浸提化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物離屯、（8， OOOg離屯、15min)，收集上清液，該上清液即為粗酶液。
[0171] 3.酶活力測定
[0172] 收集粗酶液，對不同抑的培養(yǎng)基得到的粗酶液分別進行濾紙酶活力、CMC酶活力、 Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的測定。
[0173] 結果見圖1，結果表明，草酸青霉抓2101產(chǎn)濾紙酶活力（圖1中A)的培養(yǎng)基最適初始 抑為5.0，草酸青霉抓2101產(chǎn)Avicel酶活力（圖1中C)、CMC酶活力（圖1中B)和pNPG酶活力（圖 1中E)的培養(yǎng)基最適初始抑均為6.0，草酸青霉抓2101產(chǎn)木聚糖酶活力的培養(yǎng)基最適初始抑 為3.0(圖1中D)，草酸青霉抓2101產(chǎn)pNPC酶活力的培養(yǎng)基最適初始抑為4.0(圖1中巧。
[0174] =、培養(yǎng)溫度的優(yōu)化
[0175] 1.利用步驟二的pH為5的培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)溫度。
[0176] 2.將步驟一的抱子懸浮液按10%(v/w)接種至上述步驟二的抑為5的培養(yǎng)基中，分 別置于不同溫度(28、32、37和42°C)的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；向發(fā)酵產(chǎn) 物中加入無菌去離子水(無菌去離子水與發(fā)酵產(chǎn)物的體積比為10:1)，在28°C、180rpm浸提 化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物離屯、（8,000g離屯、15min)，收集上清液，該上清液即為粗酶 液。
[0177] 3.收集粗酶液，分別對不同溫度下培養(yǎng)得到的粗酶液進行濾紙酶活力、CMC酶活 力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的測定。
[0178] 結果見圖2,結果表明，草酸青霉抓2101產(chǎn)濾紙酶活力（圖2中A)、CMC酶活力（圖2中 B)、Avicel酶活力（圖帥C)、木聚糖酶活力（圖帥D)、pNPG酶活力（圖帥E)和pNPC酶活力 (圖2中巧的培養(yǎng)最適溫度均為28°C。
[0179] 四、培養(yǎng)基固液比的優(yōu)化
[0180] 1.配制不同固液比的發(fā)酵培養(yǎng)基
[0181 ]不同固液比的培養(yǎng)基均由麥教與步驟二的鹽溶液組成，pH均為5.0，均121°C高壓 滅菌30min，其中，固液比為1:0.5的培養(yǎng)基的麥教與鹽溶液的配比為10旨:5111^固液比為1:1 的培養(yǎng)基的麥教與鹽溶液的配比為lOg: lOmL，固液比為1:1.5的培養(yǎng)基的麥教與鹽溶液的 配比為10g:15mL，固液比為1:2的培養(yǎng)基的麥教與鹽溶液的配比為10g:20mL，固液比為1: 2.5的培養(yǎng)基的麥教與鹽溶液的配比為10g:25mL，固液比為1:3的培養(yǎng)基的麥教與鹽溶液的 配比為10g:30mL。
[0182] 2.發(fā)酵培養(yǎng)
[0183] 將步驟一的抱子懸浮液按10% (v/w)接種至上述不同固液比的培養(yǎng)基中，置于28 °(：靜置培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；向發(fā)酵產(chǎn)物中加入無菌去離子水(無菌去離子水與發(fā)酵產(chǎn) 物的體積比為10:1)，在28°C、180巧m浸提化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物離屯、（8，OOOg離屯、 15min)，收集上清液，該上清液即為粗酶液。
[0184] 3.酶活力測定
[0185] 收集粗酶液，分別對不同固液比的培養(yǎng)基得到的粗酶液進行濾紙酶活力、CMC酶活 力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的測定。
[0186] 結果見圖3,結果表明，草酸青霉抓2101產(chǎn)濾紙酶活力（圖3中A)和pNPG酶活力（圖3 中E)的培養(yǎng)基最適固液比均為1:1.5,草酸青霉抓2101產(chǎn)CMC酶活力（圖3中B)和pNPC酶活力 (圖3中F)的培養(yǎng)基最適固液比均為1:2,草酸青霉抓2101產(chǎn)Avicel酶活力（圖3中C)和木聚 糖酶活力（圖3中D)的培養(yǎng)基最適固液比均為1:0.5。
[0187] 五、培養(yǎng)基最佳碳源的確定
[0188] 1.配制不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基
[0189] 不同碳源的培養(yǎng)基抑均為5.0，12rc高壓滅菌30min，其中，麥教培養(yǎng)基的各組分 及含量與步驟二的基本培養(yǎng)基相同；甘薦渣培養(yǎng)基由甘薦渣與步驟二的鹽溶液組成，其中， 甘薦渣與鹽溶液的配比為10.0g:20mL;K0H處理的甘薦渣培養(yǎng)基由K0H處理的甘薦渣與步驟 二的鹽溶液組成，其中，K0H處理的甘薦渣與鹽溶液的配比為10.0 g: 20mL化細處理的甘薦 渣培養(yǎng)基由化0H處理的甘薦渣與步驟二的鹽溶液組成，其中，化0H處理的甘薦渣與鹽溶液 的配比為10.0 g: 20mM米慷培養(yǎng)基由米慷與步驟二的鹽溶液組成，其中，米慷與鹽溶液的配 比為10.0g:20mL稻桿培養(yǎng)基由稻桿與步驟二的鹽溶液組成，其中，稻桿與鹽溶液的配比為 10.0 g: 20血;玉米忍培養(yǎng)基由玉米忍與步驟二的鹽溶液組成，其中，玉米忍與鹽溶液的配比 為10.0g:20mL。
[0190] 其中，K0H處理的甘薦渣按照如下方式制備:按料液比lg:10mL的比例將甘薦渣與 含質(zhì)量濃度為9.87 %的K0H、質(zhì)量濃度為2.5 %的出化溶液混合后，在50°C下浸泡處理2地，紗 布過濾，濾渣用水洗至中性，50°C烘干。
[0191] 化0H處理的甘薦渣按照如下方式制備：按料液比lg:10mL的比例將甘薦渣與含質(zhì) 量濃度為8.0 %的化0H、質(zhì)量濃度為2.48 %的此化溶液混合后，在40°C下浸泡處理2地，紗布 過濾，濾渣用水洗至中性，50°C烘干。
[0192] 2.發(fā)酵培養(yǎng)
[0193] 將步驟一的抱子懸浮液按10% (v/w)接種至上述各不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置 于28°C靜置培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；向發(fā)酵產(chǎn)物中加入無菌去離子水(無菌去離子水與發(fā) 酵產(chǎn)物的體積比為10:1)，在28°C、180巧m浸提化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物離屯、(8,000g 離屯、15min)，收集上清液，該上清液即為粗酶液。
[0194] 3.酶活力測定
[0195] 收集粗酶液，分別對上述各不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基得到的粗酶液進行濾紙酶活 力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pWG酶活力的測定。
[0196] 結果見圖4,結果表明，麥教是草酸青霉抓2101產(chǎn)濾紙酶活力（圖4中A)、CMC酶活力 (圖4中B)、Avicel酶活力（圖帥C)、木聚糖酶活力（圖帥D)、pNPC酶活力（圖帥E)和pNPG酶 活力（圖4中巧的最佳碳源。
[0197] 六、最佳碳源顆粒大小的確定
[0198] 1.配制不同顆粒大小的最佳碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基
[0199] 不同碳源顆粒大小的培養(yǎng)基抑均為5.0，12rc高壓滅菌30min。其中，碳源顆粒大 小的設置如下：大于0.9mm、0.45-0.9mm(包含0.45mm和0.9mm)、0.3-0.45mm(包含0.3mm，不 包含0.45mm)、0.2-0.3mm(包含0.2mm，不包含0.3mm)、小于0.2mm。不同碳源顆粒大小的培養(yǎng) 基的各組分及含量與步驟二的基本培養(yǎng)基相同（即碳源為麥教）。
[0200] 其中，不同顆粒大小的碳源為將麥教過不同大小篩孔的篩子得到的。
[0201] 2.發(fā)酵培養(yǎng)
[0202] 將步驟一的抱子懸浮液按10 % (v/w)接種至上述各不同碳源顆粒大小的培養(yǎng)基 中，置于28 °C靜置培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；向發(fā)酵產(chǎn)物中加入無菌去離子水(無菌去離子水 與發(fā)酵產(chǎn)物的體積比為10:1)，在28°C、180rpm浸提化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物離屯、(8， OOOg離屯、15min)，收集上清液，該上清液即為粗酶液。
[020引3.酶活力測定
[0204] 收集粗酶液，分別對上述各不同碳源顆粒大小的培養(yǎng)基得到的粗酶液進行濾紙酶 活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pWG酶活力的測定。
[0205] 結果圖5表明，草酸青霉抓2101產(chǎn)濾紙酶活力（圖5中A)、Avicel酶活力（圖5中C)、 木聚糖酶活力（圖5中D)、pNPC酶活力（圖5中F)和pNPG酶活力（圖5中E)的培養(yǎng)基的最佳碳源 顆粒大小均為0.3-0.45mm，草酸青霉抓2101產(chǎn)CMC酶活力（圖5中B)的培養(yǎng)基的最佳碳源顆 粒大小為0.3-0.9mm。
[0206] 屯、培養(yǎng)基組合碳源最佳濃度的確定
[0207] 1.配制各種碳源組合濃度的培養(yǎng)基
[0208] 不同麥教和稻桿質(zhì)量比的培養(yǎng)基均由麥教、稻桿和步驟二的鹽溶液組成，抑均為 5.0，121°C高壓滅菌30min。麥教和稻桿質(zhì)量比設置如下：5:0,4:1，3:2,2:3，1:4,0: 5。麥教 和稻桿質(zhì)量比為5:0的培養(yǎng)基中麥教、稻桿和鹽溶液的配比為麥教1 Og: Og: 20mL，麥教和稻 桿質(zhì)量比為4:1的培養(yǎng)基中麥教、稻桿和鹽溶液的配比為麥教8g: 2g: 20mL，麥教和稻桿質(zhì)量 比為3:2的培養(yǎng)基中麥教、稻桿和鹽溶液的配比為麥教6g:4g:20mL，麥教和稻桿質(zhì)量比為2: 3的培養(yǎng)基中麥教、稻桿和鹽溶液的配比為麥教4g: 6g: 20mL，麥教和稻桿質(zhì)量比為1:4的培 養(yǎng)基中麥教、稻桿和鹽溶液的配比為麥教2g: 8g: 20mL，麥教和稻桿質(zhì)量比為0:5的培養(yǎng)基中 麥教、稻桿和鹽溶液的配比為麥教Og: 10g:20mL。
[0209] 2.發(fā)酵培養(yǎng)
[0210] 將步驟一的抱子懸浮液按10% (v/w)接種至上述不同麥教和稻桿質(zhì)量比的培養(yǎng)基 中，置于28 °C靜置培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；向發(fā)酵產(chǎn)物中加入無菌去離子水(無菌去離子水 與發(fā)酵產(chǎn)物的體積比為10:1)，在28°C、180rpm浸提化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物離屯、(8， OOOg離屯、15min)，收集上清液，該上清液即為粗酶液。
[0別。3.酶活力測定
[0212]收集粗酶液，分別對上述各不同麥教和稻桿質(zhì)量比的培養(yǎng)基得到的粗酶液進行濾 紙酶活力、CMC酶活力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pWG酶活力的測定。
[0213] 結果見圖6,結果表明，麥教：稻桿質(zhì)量比為2:3是草酸青霉EU2101產(chǎn)濾紙酶活力 (圖6中A)、Avicel酶活力（圖6中C)和木聚糖酶活力（圖6中D)培養(yǎng)基的最佳組合碳源濃度， 麥教:稻桿質(zhì)量比為4:1是草酸青霉抓2101產(chǎn)CMC酶活力（圖6中B)和pNPC酶活力（圖6中F)培 養(yǎng)基的最佳組合碳源濃度，麥教:稻桿質(zhì)量比為5:0是草酸青霉EU2101產(chǎn)pNPG酶活力（圖6中 E)培養(yǎng)基的最佳組合碳源濃度。
[0214] 八、培養(yǎng)基最佳氮源的確定
[0215] 1.配制含不同氮源的培養(yǎng)基：
[0216] 不同氮源的培養(yǎng)基抑均為5.0,12TC高壓滅菌30min，其中，硫酸錠培養(yǎng)基的各組 分及含量與步驟二的基本培養(yǎng)基相同；對照培養(yǎng)基為將步驟二的基本培養(yǎng)基中的硫酸錠刪 除得到的培養(yǎng)基；尿素培養(yǎng)基為將步驟二的基本培養(yǎng)基中的（NH4)2S04 5 . Og替換為尿素 5. Og得到的培養(yǎng)基;蛋白腺培養(yǎng)基為將步驟二的基本培養(yǎng)基中的(NH4)2S04 5. Og替換為蛋 白腺5. Og得到的培養(yǎng)基;硝酸鋼培養(yǎng)基為將步驟二的基本培養(yǎng)基中的(NH4)2S化5. Og替換 為硝酸鋼5. Og得到的培養(yǎng)基;硝酸錠培養(yǎng)基為將步驟二的基本培養(yǎng)基中的(NH4)2S04 5 . Og 替換為硝酸錠5 . Og得到的培養(yǎng)基;酵母提取物培養(yǎng)基為將步驟二的基本培養(yǎng)基中的（NH4) 2S化5. Og替換為酵母提取物5. Og得到的培養(yǎng)基;氯化錠培養(yǎng)基為將步驟二的基本培養(yǎng)基中 的(馳)2S〇4 5. Og替換為氯化錠5. Og得到的培養(yǎng)基。
[0217] 2.發(fā)酵培養(yǎng)
[0218] 將步驟一的抱子懸浮液按10% (v/w)接種至上述不同氮源的培養(yǎng)基中，置于28°C 靜置培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；向發(fā)酵產(chǎn)物中加入無菌去離子水(無菌去離子水與發(fā)酵產(chǎn)物 的體積比為10 :1)，在28°C、180巧m浸提化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物離屯、（8，OOOg離屯、 15min)，收集上清液，該上清液即為粗酶液。
[0219] 3.酶活力測定
[0220] 收集粗酶液，分別對各不同氮源的培養(yǎng)基得到的粗酶液進行濾紙酶活力、CMC酶活 力、Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的測定。
[0221] 結果圖7表明，酵母提取物是草酸青霉抓2101產(chǎn)濾紙酶活力、CMC酶活力、Avicel酶 活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的最佳氮源。
[0222] 九、最佳培養(yǎng)時間的確定
[0223] 1.配制最優(yōu)培養(yǎng)基：
[0224] 最優(yōu)培養(yǎng)基由麥教、稻桿與鹽溶液1組成，其中，麥教、稻桿與鹽溶液1的配比為 4.Og:6.Og:20mL。鹽溶液1由水、K此P〇4、酵母提取物、MgS〇4 ? 7此0、吐溫80和微量元素母液 組成，每升鹽溶液含K此K)4 2.5g、酵母提取物5.0g、MgS化.7出0 2.5g、吐溫80 l.Og、步驟二 的微量元素母液0.1 mL。調(diào)節(jié)其抑為5，121°C高壓滅菌30min。
[0。引2.發(fā)酵培養(yǎng)
[02%]將步驟一的抱子懸浮液按10% (v/w)接種至上述最優(yōu)培養(yǎng)基中，分別置于28°C靜 置培養(yǎng)3、4、5、6、7、8天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；向發(fā)酵產(chǎn)物中加入無菌去離子水(無菌去離子水與 發(fā)酵產(chǎn)物的體積比為10:1)，在28°C、180rpm浸提化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物離屯、（8， OOOg離屯、15min)，收集上清液，該上清液即為粗酶液。
[0227] 3.酶活力測定
[0228] 收集粗酶液，分別對培養(yǎng)不同時間得到的粗酶液進行濾紙酶活力、CMC酶活力、 Avicel酶活力、木聚糖酶活力、pNPC酶活力和pNPG酶活力的測定。
[0229] 結果見圖8,結果表明，草酸青霉抓2101產(chǎn)濾紙酶活力（圖8中AKAvicel酶活力（圖 8中C)、木聚糖酶活力（圖8中D)和pNPG酶活力（圖8中E)的最佳培養(yǎng)時間均為6天，在培養(yǎng)3-8 天時，草酸青霉抓2101產(chǎn)CMC酶活力和pNPC酶活力的最佳培養(yǎng)時間均為8天。
[0230] 實施例3、利用草酸青霉抓2101制備纖維素酶制劑
[0231] 1、配制發(fā)酵培養(yǎng)基
[0232] 配制實施例2步驟九的最優(yōu)培養(yǎng)基。
[0233] 2、抱子液的制備
[0234] (1)將PDA固體培養(yǎng)基115°C滅菌30min，得至帆)A平板。
[0235] (2)將草酸青霉抓2101接種到PDA固體平板上，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天。用 0.1 % (體積百分比濃度）吐溫80水溶液洗下在PDA平板上培養(yǎng)5天的草酸青霉抓2101抱子， 轉移至含有數(shù)顆玻璃珠的50mL離屯、管中。在顯微鏡下，血球板計數(shù)并調(diào)節(jié)抱子濃度至1〇8 個/mL，按10%(v/w)的接種量接種至上述最優(yōu)培養(yǎng)基中。
[0236] 3、纖維素酶制劑的制備
[0237] (1)將步驟2已接種了草酸青霉抓2101抱子懸浮液的發(fā)酵培養(yǎng)基置于28°C恒溫培 養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)6天，得到發(fā)酵產(chǎn)物。
[0238] (2)向發(fā)酵產(chǎn)物中加入無菌去離子水(無菌去離子水與發(fā)酵產(chǎn)物的體積比為10: 1)，在28 °C、ISOrpm浸提化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物用4層紗布過濾，得到過濾液體，將過 濾液體1200化pm離屯、10分鐘去除培養(yǎng)物和菌體，收集上清液，該上清液即為纖維素酶制劑， 測定纖維素酶制劑的纖維素酶活力。
[0239] 結果如下:纖維素酶制劑的濾紙酶活力為41.7±1.0U/gds;Avicel酶活力為14.3 ± 0.8U/gds; CMC 酶活力為 267.7 ± 38.6U/gds; pNPG 酶活力為 103.7 ± 4.抓/gds; pNPC 酶活力 為 10.2 ±0.8U/gds;木聚糖酶活力為 1257.1 ± 102. lU/gds。
[0240] 比較已公開的青霉屬與本發(fā)明的草酸青霉抓2101的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力(濾 紙酶活力），結果如表4所示，在碳源為麥教與稻桿時，草酸青霉抓2101的濾紙酶活力為草酸 青霉HP7-1的4.01倍，二者具有顯著差異;在碳源為麥教與Avicel時，草酸青霉抓2101的濾 紙酶活力為草酸青霉抓2106的1.16倍，二者具有顯著差異。表明，與野生型草酸青霉HP7-1 和草酸青霉突變體EU2106相比，本發(fā)明的草酸青霉抓2101產(chǎn)濾紙酶活力最高，即纖維素酶 產(chǎn)量最高。
[0241 ]表4、草酸青霉菌株固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活力對比 [0242]
[0243] 表4中，草酸青霉抓2106為授權公告號為CN 102876590B的中國專利中的草酸青霉 EU2106,草酸青霉HP7-1為草酸青霉(Penicillium oxalicum)野生型菌株HP7-1。碳源為麥 教+稻桿的培養(yǎng)基為實施例2步驟九的最優(yōu)培養(yǎng)基，碳源為麥教+Avicel的培養(yǎng)基將實施例2 步驟九的最優(yōu)培養(yǎng)基中的稻桿替換為Avicel得到的培養(yǎng)基，碳源為麥教+甘薦渣的培養(yǎng)基 將實施例2步驟九的最優(yōu)培養(yǎng)基中的稻桿替換為甘薦渣得到的培養(yǎng)基。各菌株的培養(yǎng)方法 如下：將各菌株的抱子濃度為1 X 108個/mL的抱子懸浮液按10% (v/w)接種至相應培養(yǎng)基 中，置于28 °C靜置培養(yǎng)5天，得到發(fā)酵產(chǎn)物；向發(fā)酵產(chǎn)物中加入無菌去離子水(無菌去離子水 與發(fā)酵產(chǎn)物的體積比為10:1)，在28°C、180rpm浸提化，得到浸提產(chǎn)物，將浸提產(chǎn)物離屯、(8， OOOg離屯、15min)，收集上清液，該上清液即為粗酶液。然后按照上文中濾紙酶活力的測定方 法測定各菌株粗酶液的濾紙酶活力。
[0244] 實施例4、利用纖維素酶制劑水解木馨渣
[0245] 1、預處理的木馨渣的制備:按料液比lg:10mL的比例將木馨渣與溶液甲（溶液甲為 向去離子水中加入化0H和出化得到的化0H質(zhì)量濃度為8.0%、此〇2質(zhì)量濃度為2.48%的溶 液)混合后，在40°C下浸泡處理2地，紗布過濾，濾渣用水洗至中性，50°C烘干，得到預處理的 木馨渣（即化0H與此化處理后的木馨渣）。根據(jù)修改的美國國家可再生能源實驗室的方法測 定得知預處理木馨渣中纖維素的含量為41.95±3.78%。
[0246] 2、不同底物濃度
[0247] 反應體系為lOOmL，底物(預處理的木馨渣)濃度設置為20、40、60和80g/L四個濃度 梯度，纖維素酶上樣量為20U/g底物(具體上樣為纖維素酶制劑，纖維素酶酶活力W濾紙酶 活力來計）。
[024引反應體系具體制備方法為：向抑5.0的化抽Kk-巧樣酸緩沖液中加入預處理的木 馨渣與實施例3的纖維素酶制劑。
[0249] 反應條件為50°C，180巧m，共反應96小時。分別在反應0、3、6、12、24、48、72和96h取 樣，檢測反應體系中還原糖的含量，計算纖維素轉化率，纖維素轉化率=葡萄糖的重量X 0.9/木馨渣中纖維素的重量X 100%。
[0250] 結果見圖9,表明在底物濃度為60g/L時，木馨渣纖維素的轉化率最高，在反應96小 時的轉化率為95.4 ±1.1%。
[0251] 3、不同酶添加量
[0252] 反應體系為lOOmL，底物(預處理的木馨渣)濃度設置為60g/L，纖維素酶上樣量設 置為1、5、10、20和30FPU/g底物五個梯度(具體上樣為纖維素酶制劑，纖維素酶酶活力W濾 紙酶活力來計）。
[0253] 反應體系具體制備方法為：向抑5.0的化抽Kk-巧樣酸緩沖液中加入預處理的木 馨渣與實施例3的纖維素酶制劑。
[0254] 反應條件為50 °C，180rpm，共反應96小時。分別在反應0、3、6、12、24、48、72和96h取 樣，檢測反應體系中葡萄糖的含量，纖維素轉化率，纖維素轉化率=葡萄糖的重量X0.9/木 馨渣中纖維素的重量X 100%。
[0255] 結果見圖10,表明酶添加量為30FPU/g底物時，在反應48小時時，纖維素轉化率達 到了 100%，酶添加量為20FPU/g底物時，在反應96小時時，纖維素轉化率達到了 100%。
[0256] 表5、預處理木馨渣中纖維素轉化率（％ ) rn?57l
【主權項】
1 ·草酸青霉(Penicillium oxalicum)EU2101，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普 通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 12769。2. -種菌劑，其特征在于:所述菌劑的活性成分為權利要求1所述的草酸青霉EU2101。3. 用于培養(yǎng)權利要求1所述的草酸青霉EU2101的培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng)基由農(nóng) 業(yè)有機廢棄物與鹽溶液組成，其中，所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物與所述鹽溶液的配比為lg: (0.5- 3)mL，所述培養(yǎng)基的pH值為3-8;所述鹽溶液由水、KH2P〇4、氮源、MgS〇4 · 7H20、吐溫80和微量 元素母液組成，每升所述鹽溶液含KH2P〇4 2.5g、所述氮源5g、MgS〇4· 7H20 2.5g、吐溫80 lg、所述微量元素母液O.lmL;所述微量元素母液由溶質(zhì)和溶劑組成，所述溶劑為水，所述溶 質(zhì)及其濃度分別為FeS〇4.7H 20 5g/L、MnS〇4*H20 1.6g/L、ZnS〇4.7H20 1.4g/L和CoCl2 2.0g/L〇4. 根據(jù)權利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于:所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物為麥麩、稻桿、米 糠、甘蔗渣和/或玉米芯； 和/或，所述氮源為酵母提取物、硫酸銨、尿素、蛋白胨、硝酸鈉、硝酸銨和/或氯化銨； 和/或，所述培養(yǎng)基的pH值為5-6; 和/或，所述培養(yǎng)基中所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物與所述鹽溶液的配比為bl)、b2)或b3):bl) lg:(0.5_3)mL，b2)lg:(0.5_2)mL，b3)lg:1.5mL; 和/或，所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物顆粒大小為〇. 2-0.9mm; 和/或，所述農(nóng)業(yè)有機廢棄物為麥麩和稻桿，所述培養(yǎng)基中麥麩、稻桿與所述鹽溶液的 配比為（2-8)g:(2-8)g:20mL。5. 下述任一產(chǎn)品： P1)、利用權利要求1所述的草酸青霉EU2101制備的降解纖維素的產(chǎn)品； P2)、利用權利要求2所述的菌劑制備的降解纖維素的產(chǎn)品； P3)、利用權利要求1所述的草酸青霉EU2101制備的纖維素酶； P4)、利用權利要求2所述的菌劑制備的纖維素酶。6. 根據(jù)權利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于:P1)所述降解纖維素的產(chǎn)品的活性成分為 權利要求1所述的草酸青霉EU2101; P2)所述降解纖維素的產(chǎn)品的活性成分為權利要求2所述的菌劑。7. 根據(jù)權利要求5或6所述的產(chǎn)品，其特征在于:P1)所述降解纖維素的產(chǎn)品為纖維素酶 制劑，所述纖維素酶制劑的制備方法，包括:用權利要求3或4所述培養(yǎng)基在28-42 °C下培養(yǎng) 權利要求1所述的草酸青霉EU2101，收集發(fā)酵產(chǎn)物，得到纖維素酶制劑。8. 下述Ml)或M2)或M3)的方法： Ml)降解纖維素或含纖維素物質(zhì)的方法，包括:將權利要求8中所述纖維素酶制劑與纖 維素或含纖維素物質(zhì)在50°C下于pH為5的環(huán)境中進行反應來降解纖維素； M2)權利要求8中所述纖維素酶制劑的制備方法； M3)培養(yǎng)權利要求1所述的草酸青霉EU2101的方法，包括用權利要求4-6中任一所述培 養(yǎng)基在28-42°C下培養(yǎng)權利要求1所述的草酸青霉EU2101。9. 下述 X1)、X2)或 X3): XI)權利要求1所述的草酸青霉EU2101或權利要求2所述菌劑在下述al)-a6)中任一種 中的應用： al)在降解纖維素或含纖維素物質(zhì)中的應用； a2)在制備降解纖維素或含纖維素物質(zhì)產(chǎn)品中的應用； a3)在制備纖維素酶中的應用； a4)在制備生產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)品中的應用； a5)在制備葡萄糖、纖維二糖或燃料乙醇中的應用； a6)在制備生產(chǎn)葡萄糖、纖維二糖或燃料乙醇產(chǎn)品中的應用； X2)權利要求3-5中任一所述培養(yǎng)基在上述a2)、a4)或a6)中的應用； X3)權利要求6-8中任一所述產(chǎn)品在上述al)_a6)中任一種中的應用。10.根據(jù)權利要求8所述的方法或權利要求9所述的應用，其特征在于:所述含纖維素物 質(zhì)為木薯渣、麥麩、稻桿、米糠、甘蔗渣和/或玉米芯。
【文檔編號】C12P19/12GK106047730SQ201610695936
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月19日
【發(fā)明人】馮家勛, 趙帥, 蘇臨輝, 蔣隨新
【申請人】廣西大學