結(jié)直腸癌環(huán)狀rna分子標(biāo)記物及檢測試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物及檢測試劑，該環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物為hsa_circ_002146，hsa_circ_002146RNA在結(jié)直腸癌中明顯低于癌旁組織，可以作為結(jié)直腸癌的分子標(biāo)記物；該分子標(biāo)記物的檢測試劑為一對特異性引物：TGAAGAGCAT TCCAGATC和TCCTTCCTAC ACCCTACT，該檢測試劑可以特異性檢測出結(jié)直腸癌的hsa_circ_002146RNA明顯低于癌旁組織，若hsa_circ_002146基因片段低水平表達(dá)，且表達(dá)倍數(shù)低于0.545，則認(rèn)為結(jié)直腸癌，該基因檢測試劑具有特異、靈敏、快速和檢測簡單方便、針對性強(qiáng)的優(yōu)點。
【專利說明】
結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo)巧物及檢測試劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及結(jié)直腸癌分子標(biāo)記物及檢測試劑，具體設(shè)及結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo) 記物及檢測試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌近年來的發(fā)病率有明顯上升趨勢，結(jié)直腸癌的患者的術(shù)后生存情況有了 較大的改善，但是結(jié)直腸癌患者的五年總體生存率仍舊不高，其中最重要的一個因素就是， 在結(jié)直腸癌患者在疾病發(fā)生的早期沒有得到及時的診斷和治療?，F(xiàn)用于診斷消化系統(tǒng)中惡 性腫瘤的方法主要包括消化內(nèi)鏡檢查，影像學(xué)檢查，生化和免疫學(xué)檢查及基因診斷。免疫學(xué) 檢查結(jié)直腸癌的標(biāo)記物主要有〔419-9、〔64、？53、1(-阿3等，但對早期診斷的價值有限。因此 如授權(quán)公告號為CN103740854R的發(fā)明專利，就公開了結(jié)直腸癌標(biāo)記物CystatinSN、 切statinS和切statinSA蛋白的檢測試劑，該半脫氨酸蛋白酶抑制劑的檢測試劑可W用于 結(jié)直腸癌的早期診斷，癌變組織和癌旁組織的表達(dá)差異非常明顯。但目前結(jié)直腸癌標(biāo)分子 記物基本都是蛋白層面的研究和應(yīng)用，其免疫學(xué)檢測手段繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，成本高，效益低， 且結(jié)果不顯著?；?qū)用娴沫h(huán)形RNA(circRNA)是新近確認(rèn)的一類特殊的非編碼RNA，是RNA 剪接后所形成的一類極穩(wěn)定的保守型產(chǎn)物，circRNA可作為miRNA海綿來影響基因的調(diào)控與 表達(dá)，通過與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。有研究人員發(fā) 現(xiàn)circRNA在動脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)素亂、糖尿病和腫瘤等疾病發(fā)生過程中發(fā)揮著非常 重要的作用。目前，已有研究證實CircRNA在胃癌和非癌組織的表達(dá)量存在顯著差異，是臨 床上具有潛在診斷價值的新型生物標(biāo)志物。但是目前，國內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于利用 circRNA分子作為檢測結(jié)直腸癌預(yù)測或診斷的分子標(biāo)志物來檢查結(jié)直腸癌的相關(guān)研究報 道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物及檢測試 劑，該環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物為hsa_circ_002146，其檢測試劑具有檢測靈活快速，簡單方便， 針對性強(qiáng)的優(yōu)點。
[0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物，該 環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物為hsa_ci;rc_002146。
[0005] 該結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物的檢測試劑為一對特異性引物，該對特異性引物 的核巧酸序列如下： 上游引物的核巧酸序列為:5'- TGAAGAGCAT TCCAGATC -3'， 下游引物的核巧酸序列為:5'- TCCTTCCTAC ACCCTACT -3'。
[0006] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物及檢測試劑，該 環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物為hsa_ci;rc_002146，hsa_ci;rc_002146RNA在結(jié)直腸癌中明顯低于癌旁 組織，可W作為結(jié)直腸癌的分子標(biāo)記物；該分子標(biāo)記物的檢測試劑為一對特異性引物： TGAAGAGCAT TCCAGATC和TCCTTCCTAC ACCCTACT，該檢測試劑可W特異性檢測出結(jié)直腸癌的 hsa_circ_002146RNA明顯低于癌旁組織，若hsa_circ_002146基因片段低水平表達(dá)，且表達(dá) 倍數(shù)低于0.545,則認(rèn)為結(jié)直腸癌，該基因檢測試劑具有特異、靈敏、快速和檢測簡單方便、 針對性強(qiáng)的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0007] W下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[000引實施例1 結(jié)直腸癌環(huán)狀3歴分子標(biāo)記物，該環(huán)狀1?歴分子標(biāo)記物為1133_(3；[1'(3_002146，是在 CircBase 數(shù)據(jù)庫（http: //circbase. org/cgi-bin/simplesearch. cgi)中獲得hsa_circ_ 002146RNA序列，并且利用生物信息學(xué)方法分析和大量病例研究獲得其與結(jié)直腸癌密切相 關(guān)，在結(jié)直腸癌的表達(dá)明顯低于正常組織。該結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物的檢測試劑為一 對特異性引物:5'- TGAAGAGCAT TCCAGATC -3'和5'- TCCTTCCTAC ACCCTACT -3'，該對引 物是通過對環(huán)狀RNA hsa_circ_002146的環(huán)化位點的研究、分析和設(shè)計引物，并通過試驗、 篩選最終獲得該對引物，引物由上海生功生物工程股份有限公司合成。
[0009] 實施例2 利用實施例1的一對引物進(jìn)行病例檢測，具體檢測過程如下： 1、DNA提取:我們從寧波市醫(yī)療中屯、李惠利醫(yī)院采集5例結(jié)直腸癌新鮮組織樣本和對應(yīng) 的癌旁組織樣本，采用TRIZ0L試劑（Invitrogen Life Technologies Co, USA)按照說明 書提取組織總RNA,通過化noDropSOOO超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientif ic， USA)檢測所得RNA的濃度及純度，然后將總RNA用GoScript Reverse lYanscription (RT) System試劑盒（購于美國Promega公司）按照說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA用無酶水稀釋4倍 得到cDNA樣本。
[0010] 2、PCR反應(yīng)：取4ul cDNA樣本溶液加入到lOul Roche lightCycler 480 SYBR GREENIMaster混合液(購于美國Roche公司）中，再加入1.6 ul特異性上、下游引物（上、下 游引物濃度都為l〇pmol/ul)，4.4ul無 RNA酶水，組成20 ul反應(yīng)體系在羅Roche li曲t切cler 480 n儀器上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng);擴(kuò)增步驟包括初始激活在94°C，10分鐘;94°C 20 s，55°C 30 s，72°C 30 S，共進(jìn)行45次循環(huán)的退火反應(yīng);反應(yīng)完成后是95°C Imin，59°C 30s，95°C 30s進(jìn)入烙解曲線分析，判斷產(chǎn)物的特異性。
[OOW 3、完畢后PCR產(chǎn)物測序，結(jié)果比對后為目的片段，該目的片段包含hsa_circ_ 002146環(huán)化位點，為hsa_circ_002146特異性片段。采用方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析結(jié) 果發(fā)現(xiàn):被檢測的患者RNA hsa_circ_002146在結(jié)直腸癌中與配對正常組織中表達(dá)差異下 調(diào)，若hsa_circ_002146基因片段低水平表達(dá)，且表達(dá)倍數(shù)低于0.545(代替特異性上、下游 引物的內(nèi)參基因 GAPDH擴(kuò)增正向引物序列：5 ' -AGTAGAGGCAGGGATGATG-3 '，反向引物序列： 5' -TGGTATCGTGGAAGGACTC-3 '，購于上海生功，檢測方法同上），則認(rèn)為結(jié)直腸癌，如表1結(jié)直 腸癌癌變組織與癌旁組織的hsa_circ_002146RNA表達(dá)存在顯著差異。 「00121 親1 .痛巧巧飯甚巧占痛宰巧飯的Visa
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從表1中可W看出，在結(jié)直腸癌病癥患者中，通過hsa_circ_002146RNA的檢測試劑檢 ，其癌變組織的hsa_circ_002146RNA表達(dá)明顯低于癌旁組織的hsa_circ_002146RNA表 達(dá)。
【主權(quán)項】
1. 結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物，其特征在于該環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物為hsa_circ_ 002146〇2. 權(quán)利要求1所述的結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分子標(biāo)記物的檢測試劑，該結(jié)直腸癌環(huán)狀RNA分 子標(biāo)記物的檢測試劑為一對特異性引物，其特征在于該對特異性引物的核苷酸序列如下： 上游引物的核苷酸序列為:TGAAGAGCAT TCCAGATC， 下游引物的核苷酸序列為:TCCTTCCTAC ACCCTACT。
【文檔編號】C12N15/11GK106048036SQ201610518307
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】周重昌, 李錦蕓, 包天鏈, 高騰蛟
【申請人】周重昌