一種水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑及制備方法，本發(fā)明的微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑是由枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌、保加利亞乳酸菌種子液進(jìn)行混合發(fā)酵培養(yǎng)，然后將混合菌液作為芯材，選擇海藻酸鈉作為壁材，分散有吐溫?80的植物油作為油相，分散有氯化鈣和吐溫?80的植物油作為交聯(lián)劑，氯化鈣溶液作為固化劑，利用乳化法制備而成。發(fā)明的微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑適合添加到水產(chǎn)飼料中攪拌均勻后投喂，不僅提高了益生菌對不良環(huán)境的耐受力及活菌的濃度，延長產(chǎn)品保存期，而且可以使益生效果得以加強(qiáng)。
【專利說明】
一種水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)飼用微生態(tài)制劑，具體說，是一種水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài) 制劑及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水產(chǎn)飼用微生態(tài)制劑作為一種綠色飼料添加劑，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用日益受到重 視。其產(chǎn)品類型由單一菌種逐漸向多菌種組合而成的復(fù)合菌發(fā)展。但是，水產(chǎn)復(fù)合微生態(tài)制 劑的產(chǎn)品配方和生產(chǎn)工藝近年來沒有更大的突破。多數(shù)復(fù)合菌產(chǎn)品只是幾種細(xì)菌的隨意混 合，導(dǎo)致產(chǎn)品不符合使用環(huán)境，菌株的生長、繁殖條件受到影響。
[0003] 另外，不同菌株在應(yīng)用前后都會受到體內(nèi)外各種環(huán)境因素，如pH值、溶氧、光照、有 機(jī)物含量、溫度、氧化、存貯時間、機(jī)械摩擦和擠壓等的影響，導(dǎo)致應(yīng)用后活菌數(shù)量和活力不 夠，最后在腸道內(nèi)無法有效定植，不能形成優(yōu)勢菌群，最終難以起到其應(yīng)有的作用。
[0004] 微膠囊化是指以高分子材料作為致密膜外殼，將分散的固體物質(zhì)、液滴或氣體進(jìn) 行生物包裹，起到保護(hù)活性物質(zhì)的新型技術(shù)。主要方法有乳化法、擠壓法、噴霧冷凝法、噴霧 干燥法、氣溶膠撞擊法等。目前微膠囊技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在食品、化妝品、醫(yī)藥控制釋放、微 生態(tài)制劑等相關(guān)領(lǐng)域中。但關(guān)于水產(chǎn)飼用微生態(tài)制劑微膠囊技術(shù)的應(yīng)用研究，特別是針對 復(fù)合微生態(tài)制劑的微膠囊化研究亟待開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑。該制 劑提高益生菌對不良環(huán)境的耐受力及活菌的濃度，延長產(chǎn)品保存期，而且可以使益生效果 得以加強(qiáng)。另外，提供一種水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合 微生態(tài)制劑的制備方法，將枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌、保加利亞乳酸 菌的種子液進(jìn)行混合發(fā)酵培養(yǎng)，獲得復(fù)合微生態(tài)制劑原液，將復(fù)合微生態(tài)制劑原液作為芯 材，海藻酸鈉作為壁材，分散有吐溫-80的植物油作為油相，分散有氯化鈣和吐溫-80的植物 油作為交聯(lián)劑，氯化鈣溶液作為固化劑，進(jìn)行乳化法反應(yīng)，離心收集沉淀，得到膠狀微膠囊， 真空冷凍、凍干，得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0007] 所述復(fù)合微生態(tài)制劑原液中枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌、保加 利亞乳酸菌的活菌數(shù)分別為1 X l〇^1()CFU/ml、1 X 108_1()CFU/ml、1 X 108_1()CFU/ml，得到微膠 囊化復(fù)合微生態(tài)制劑呈球形或扁球形，粒徑介于26-45μπι之間。
[0008] 具體地，包括以下步驟：
[0009] (1)菌種液體培養(yǎng)，制備活化液
[0010] 沼澤紅假單胞菌:取保存于-80°C的沼澤紅假單胞菌甘油管，解凍后，按1-3%體積 加入裝有Van Niel液體培養(yǎng)基的試管中；用40-100W白熾燈進(jìn)行光照，厭氧培養(yǎng)，溫度25-30 °C，靜置培養(yǎng)24-36h后，得到沼澤紅假單胞菌活化液；
[0011] 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌:分別取保存于-80°c的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌甘油管，解凍后，按1-3%體積分別加入裝有BPY液體培養(yǎng)基的試管中，將試管放置于搖床 上，轉(zhuǎn)速為160-200rpm，溫度為25-30°C，培養(yǎng)12-20h，分別得到枯草芽孢桿菌活化液和地衣 芽孢桿菌活化液；
[0012] 保加利亞乳酸菌:取保存于-80°c的保加利亞乳酸菌甘油管，解凍后，按1-3%體積 加入裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于25-30°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置厭氧培養(yǎng)12-24h，得到保 加利亞乳酸菌活化液；
[0013] (2)制備菌種種子液
[0014] 將步驟(1)中的4個菌種活化液按體積百分比1-3%比例分別加入到裝有對應(yīng)培養(yǎng) 基的三角瓶中，按步驟(1)中的培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽 孢桿菌、保加利亞乳酸菌，使其生長到對數(shù)期，成為菌種種子液；
[0015] (3)制備復(fù)合微生態(tài)制劑種子液
[0016]復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基配方為：1000ml無菌水中含胰蛋白胨2-7g、酵母膏10-20g、 葡萄糖1-38、醋酸鈉1_1.58、氯化氨0.5-1.58、碳酸氫鈉0.3-0.98、硫代硫酸鈉0.2-0.68、氯 化鈉0.1-0.5g、硫酸鎂0.05-0.15g、磷酸二氫鉀0.05-0. lg、吐溫-80 0.5-1.5ml、磷酸氫二 鉀0.1-0.4g、乙酸鈉 2-8g、七水硫酸鎂 0.05-0.1g，pH，6.0-7.0;
[0017] 將步驟(2)得到的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌種子液轉(zhuǎn)接到上述復(fù)合微生態(tài)制 劑培養(yǎng)基中，有氧條件下震蕩培養(yǎng)12_24h，然后轉(zhuǎn)接沼澤紅假單胞菌種子液，厭氧光照靜置 培養(yǎng)36-48h，最后轉(zhuǎn)接保加利亞乳酸菌種子液，厭氧靜置培養(yǎng)48-72h，得到復(fù)合微生態(tài)制劑 種子液;按體積百分比，轉(zhuǎn)接量為復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基:枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌種 子液:沼澤紅假單胞菌種子液:保加利亞乳酸菌種子液=1:(2%-8 %):(2%-6 4%)；
[0018] (4)擴(kuò)大培養(yǎng)
[0019] 按體積百分比2%_8%的比例轉(zhuǎn)接步驟(3)中制備的復(fù)合微生態(tài)制劑種子液到步 驟(3)中制備的培養(yǎng)基中，好氧培養(yǎng)48-72h，厭氧培養(yǎng)48-96h，獲得復(fù)合微生態(tài)制劑原液；
[0020] (5)洗滌
[0021 ] 將復(fù)合微生態(tài)制劑原液于3000-6000rpm條件下，離心10min，棄上清液，獲得菌泥； 用原液1/1〇體積的無菌ros洗滌菌泥，振蕩混均，離心棄上清，隨后用1/1〇體積的無菌ros重 新懸浮菌泥，得到菌懸液；
[0022] (6)菌膠液制備
[0023]取步驟(5)中菌懸液，按體積比1:10-25比例加入到質(zhì)量百分比濃度1.5 %的海藻 酸鈉水溶液中，磁力攪拌器300_600rpm轉(zhuǎn)速下攪拌5-15min，得到海藻酸鈉-菌液的水相，將 水相按體積比1:1.0-2.5比例加入到含有體積比濃度為0.5%的吐溫-80的植物油中，然后 用磁力攪拌器在500-900rpm轉(zhuǎn)速下，攪拌15-30min進(jìn)行乳化，得到海藻酸鈉-菌液油包水乳 劑；
[0024] (7)微膠囊制備
[0025]按10-25%的體積將交聯(lián)劑溶液緩慢地加入到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑中，磁力 攪拌器150-250rpm轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌15-30min，最后以海藻酸鈉-菌液油包水乳劑計，按10-25%的體積加入0.05111〇1/1^03(]12水溶液，攪拌混合均勾，200-50(^離心10-15111；[11，收集沉 淀，得到膠狀微膠囊，用真空冷凍干燥機(jī)在-50°C，凍干24-36h，得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制 劑，所述交聯(lián)劑溶液為每1L植物油中含2-6ml吐溫-80，15-25ml的3.5mol/L CaCl2水溶液。
[0026] 所述植物油指從植物的果實(shí)、種子、胚芽中得到的油脂，為花生油、大豆油、亞麻 油、蓖麻油或菜籽油中的一種或幾種組合。
[0027] 所述的水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法制得的水產(chǎn)飼用微膠囊化 復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0028]本發(fā)明的有益效果是:選擇具有不同生理特性和功能特性的益生菌制備復(fù)合微生 態(tài)制劑，可通過菌株之間協(xié)同互補(bǔ)發(fā)揮更強(qiáng)的益生作用。并且利用乳化法對復(fù)合微生態(tài)制 劑進(jìn)行微膠囊化包埋，不僅提高了益生菌對不良環(huán)境的耐受力及活菌的濃度，延長產(chǎn)品保 存期，而且可以使益生菌在腸道中持續(xù)、靶向釋放，使益生效果得以加強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：
[0030] (一)產(chǎn)品組成
[0031] 水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑菌種包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、沼澤 紅假單胞菌、保加利亞乳酸菌，取四種益生菌的菌種種子液進(jìn)行混合發(fā)酵培養(yǎng)，獲得復(fù)合微 生態(tài)制劑原液。復(fù)合微生態(tài)制劑原液中枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌、保 加利亞乳酸菌的活菌數(shù)分別為1 X 1〇9-1QCFU/ml，1 X 108-1QCFU/ml，1 X 108-1QCFU/ml。將復(fù)合 微生態(tài)制劑菌液作為芯材，選擇海藻酸鈉作為壁材，分散有吐溫-80的植物油作為油相，分 散有氯化鈣和吐溫-80的植物油作為交聯(lián)劑，氯化鈣溶液作為固化劑，利用乳化法制備微膠 囊化復(fù)合微生態(tài)制劑。首先將菌液和海藻酸鈉溶液混合制備水相，然后將水相加入到油相 中，高速攪拌充分乳化，得到海藻酸鈉-菌液的油包水乳劑。然后通過交聯(lián)劑中Ca 2+的交聯(lián)作 用，使得微膠囊表面的海藻酸鈉形成凝膠，最后加入CaCl2溶液作為固化劑，攪拌混合均勻， 離心收集得到膠狀微膠囊，真空冷凍干燥后得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑。形狀主要是球 形或扁球形，粒徑比較均勾，介于26-45μηι之間。
[0032](二)具體制備方法如下：
[0033] 所用菌種均是中華人民共和國農(nóng)業(yè)部允許飼料添加劑使用的微生態(tài)制劑菌種，4 種細(xì)菌購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtil is，ACCC10114)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis，ACCC10146)、沼澤紅假單 抱菌（Rhodopseudmonas Palustris，ACCC 10649)、保加利亞乳酸菌（Lactobaci 1 lus bulgaricus，ACCC10638)。菌株活化后，甘油法保存于實(shí)驗(yàn)室-80°C冰箱中。
[0034] (1)菌種液體培養(yǎng)，制備活化液
[0035] 沼澤紅假單胞菌:取保存于-80°C的沼澤紅假單胞菌甘油管，解凍后，按1-3%體積 加入裝有Van Niel液體培養(yǎng)基的試管中；用40-100W白熾燈進(jìn)行光照，厭氧培養(yǎng)，溫度25-30 °C，靜置培養(yǎng)24-36h后，得到沼澤紅假單胞菌活化液；
[0036] 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌:分別取保存于-80°C的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌甘油管，解凍后，按1-3%體積分別加入裝有BPY液體培養(yǎng)基的試管中，將試管放置于搖床 上，轉(zhuǎn)速為160-200rpm，溫度為25-30°C，培養(yǎng)12-20h，分別得到枯草芽孢桿菌活化液和地衣 芽孢桿菌活化液；
[0037] 保加利亞乳酸菌:取保存于_80°C的保加利亞乳酸菌甘油管，解凍后，按1-3%體積 加入裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于25-30°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置厭氧培養(yǎng)12-24h，得到保 加利亞乳酸菌活化液；
[0038] (2)制備菌種種子液
[0039] 將步驟(1)中的4個菌種活化液按體積百分比1-3 %比例分別加入到裝有對應(yīng)培養(yǎng) 基的三角瓶中，按步驟(1)中的培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽 孢桿菌、保加利亞乳酸菌，使其生長到對數(shù)期，成為菌種種子液；
[0040] (3)制備復(fù)合微生態(tài)制劑種子液
[0041]復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基配方為：l〇〇〇ml無菌水中含胰蛋白胨2-7g、酵母膏10-20g、 葡萄糖1-38、醋酸鈉1_1.58、氯化氨0.5-1.58、碳酸氫鈉0.3-0.98、硫代硫酸鈉0.2-0.68、氯 化鈉0.1-0.5g、硫酸鎂0.05-0.15g、磷酸二氫鉀0.05-0. lg、吐溫-80 0.5-1.5ml、磷酸氫二 鉀0.1-0.4g、乙酸鈉 2-8g、七水硫酸鎂 0.05-0.1g，pH，6.0-7.0;
[0042]將步驟(2)得到的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌種子液轉(zhuǎn)接到上述復(fù)合微生態(tài)制 劑培養(yǎng)基中，有氧條件下震蕩培養(yǎng)12_24h，然后轉(zhuǎn)接沼澤紅假單胞菌種子液，厭氧光照靜置 培養(yǎng)36-48h，最后轉(zhuǎn)接保加利亞乳酸菌種子液，厭氧靜置培養(yǎng)48-72h，得到復(fù)合微生態(tài)制劑 種子液;按體積百分比，轉(zhuǎn)接量為復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基:枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌種 子液:沼澤紅假單胞菌種子液:保加利亞乳酸菌種子液=1:(2%-8 %):(2%-6 4%)；
[0043] (4)擴(kuò)大培養(yǎng)
[0044] 按體積百分比2%_8%的比例轉(zhuǎn)接步驟(3)中制備的復(fù)合微生態(tài)制劑種子液到步 驟(3)中制備的培養(yǎng)基中，好氧培養(yǎng)48-72h，厭氧培養(yǎng)48-96h，獲得復(fù)合微生態(tài)制劑原液；
[0045] (5)洗滌
[0046] 將復(fù)合微生態(tài)制劑原液于3000-6000rpm條件下，離心10min，棄上清液，獲得菌泥； 用原液1/1〇體積的無菌ros洗滌菌泥，振蕩混均，離心棄上清，隨后用1/1〇體積的無菌ros重 新懸浮菌泥，得到菌懸液；
[0047] (6)菌膠液制備
[0048]取步驟(5)中菌懸液，按體積比1:10-25比例加入到質(zhì)量百分比濃度1.5 %的海藻 酸鈉水溶液中，磁力攪拌器300_600rpm轉(zhuǎn)速下攪拌5-15min，得到海藻酸鈉-菌液的水相，將 水相按體積比1:1.0-2.5比例加入到含有體積比濃度為0.5%的吐溫-80的植物油中，然后 用磁力攪拌器在500-900rpm轉(zhuǎn)速下，攪拌15-30min進(jìn)行乳化，得到海藻酸鈉-菌液油包水乳 劑；
[0049] (7)微膠囊制備
[0050]按10-25%的體積將交聯(lián)劑溶液緩慢地加入到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑中，磁力 攪拌器150-250rpm轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌15-30min，最后按1〇-25%的體積（以海藻酸鈉-菌液油 包水乳劑計)加入〇. 〇5mol/L CaCl2水溶液，攪拌混合均勻，200-500g離心10-15min，收集沉 淀，得到膠狀微膠囊，用真空冷凍干燥機(jī)在_50°C，凍干24-36h，得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制 劑，所述交聯(lián)劑溶液為每1L植物油中含2-6ml吐溫-80，15-25ml的3.5mol/L CaCl2水溶液。 [0051]所述植物油指從植物的果實(shí)、種子、胚芽中得到的油脂，為花生油、大豆油、亞麻 油、蓖麻油或菜籽油中的一種或幾種組合。
[0052](三)產(chǎn)品應(yīng)用范圍
[0053]發(fā)明的微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑按0.5-1%重量比例添加到水產(chǎn)飼料中攪拌均勻 后投喂。
[0054] 本發(fā)明沼澤紅假單胞菌很容易在以有機(jī)物為碳源的光養(yǎng)條件下厭氧生長，也可以 在黑暗條件下好氧生長。其本身富含生物素，輔酶Q及類胡蘿卜素等活性物質(zhì)。并且這類光合 細(xì)菌營養(yǎng)類型多樣，可利用脂肪、有機(jī)物或氨基酸、糖、乙醇甚至芳香族化合物作為碳源，但 對大分子有機(jī)物的分解利用能力有限?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌都屬于好氧性革蘭氏 陽性菌，在生長繁殖過程中能夠產(chǎn)生B1、B2、B6等B族維生素和維生素 C、維生素 K2。而且具有 非常強(qiáng)的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶分泌能力，可迅速降解大分子有機(jī)物質(zhì)，并且消耗大量的 氧，維持腸道厭氧環(huán)境，抑制致病菌的生長。保加利亞乳酸菌能分解食物中的蛋白質(zhì)、糖類、 脂肪等，提高食物的消化率和生物價，并產(chǎn)生大量有機(jī)酸使腸道pH值降低，抑制病原菌的生 長和定植，維持腸道微生態(tài)平衡。
[0055] 選取生理特性和功能特性各不相同的三大類益生菌（光合細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸 菌）中的四種細(xì)菌，分別是沼澤紅假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、保加利亞乳酸 菌，進(jìn)行混合培養(yǎng)?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌在消化道內(nèi)生長繁殖能消耗腸道內(nèi)氧氣， 有助于乳酸菌的生長，從而使腸道保持酸性環(huán)境，并與病原菌競爭粘附位點(diǎn)及營養(yǎng)物質(zhì)。芽 孢桿菌分解大分子有機(jī)物能力強(qiáng)，而沼澤紅假單胞菌分解小分子有機(jī)物能力強(qiáng)。所以將四 種細(xì)菌組合配伍，能夠充分發(fā)揮這些益生菌的協(xié)同作用。最后應(yīng)用乳化法微膠囊技術(shù)對微 生態(tài)制劑菌株進(jìn)行包埋，起到屏蔽外界有害因素如酸堿性、高滲透壓、以及高溫環(huán)境等的影 響，以提尚廣品對加工、運(yùn)輸、It存環(huán)節(jié)以及水廣動物內(nèi)環(huán)境等的適應(yīng)力，提尚微生物生存 能力和活性，增強(qiáng)其在腸道中的存活率以及定植能力，增強(qiáng)應(yīng)用效果。
[0056] 實(shí)施例1
[0057](一)制備微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑 [0058] 1.菌種液體培養(yǎng)，制備活化液。
[0059] 沼澤紅假單胞菌:取保存于-80°C的沼澤紅假單胞菌甘油管。解凍后，按2%體積加 入裝有Van Niel液體培養(yǎng)基的試管中。用60W白熾燈進(jìn)行光照，厭氧培養(yǎng)，溫度28°C，靜置培 養(yǎng)30h后，得到沼澤紅假單胞菌活化液。
[0060] 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌:分別取保存于-80°C的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌甘油管。解凍后，按2%體積分別加入裝有BPY液體培養(yǎng)基的試管中。將試管放置于搖床 上，轉(zhuǎn)速為180rpm，溫度為28 °C，培養(yǎng)18h，分別得到枯草芽孢桿菌活化液和地衣芽孢桿菌活 化液。
[0061] 保加利亞乳酸菌:取保存于-80°C的保加利亞乳酸菌甘油管。解凍后，按2 %體積加 入裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置厭氧培養(yǎng)20h，得到保加利亞乳 酸菌活化液。
[0062] 2.制備菌種種子液
[0063] 將步驟1中的4個菌種活化液按2% (體積百分比）比例分別加入到裝有對應(yīng)培養(yǎng)基 的三角瓶中，按步驟1中的培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌、保加利亞乳酸菌，使其生長到對數(shù)期，成為菌種種子液。
[0064] 3.制備復(fù)合微生態(tài)制劑種子液
[0065]復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基配方為：
[0066] 1000ml無菌水中含胰蛋白胨5g、酵母膏15g、葡萄糖2g、醋酸鈉1.2g、氯化氨lg、碳 酸氫鈉〇. 6g、硫代硫酸鈉0.4g、氯化鈉0.3g、硫酸鎂0. lg、磷酸二氫鉀0.05g、吐溫-80 lml、 磷酸氫二鉀〇.22g、乙酸鈉5g、七水硫酸鎂0.078，？!1，6.8。按4%(體積百分比）的接種量轉(zhuǎn)接 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌種子液到上述復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基中，有氧條件下震蕩培 養(yǎng)20h，然后再按3% (體積百分比）接種量轉(zhuǎn)接沼澤紅假單胞菌種子液，厭氧光照靜置培養(yǎng) 36h，最后按2% (體積百分比）的比例轉(zhuǎn)接保加利亞乳酸菌種子液，厭氧靜置培養(yǎng)48h，得到 復(fù)合微生態(tài)制劑種子液。
[0067] 4.擴(kuò)大培養(yǎng)
[0068]按4% (體積百分比）的比例轉(zhuǎn)接步驟3中制備的復(fù)合微生態(tài)制劑種子液，利用步驟 3中的培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)48h，厭氧培養(yǎng)72h，獲得復(fù)合微生態(tài)制劑原液。
[0069] 5.洗滌
[0070] 將復(fù)合微生態(tài)制劑原液于4000rpm條件下，離心10min，棄上清液，獲得菌泥。用原 液1/10體積的無菌PBS洗滌菌泥，振蕩混均，離心棄上清，隨后用1/10體積的無菌PBS重新懸 浮菌泥，得到菌懸液。
[0071] 6.菌膠液制備
[0072]取步驟5中菌懸液，按1: 20比例（體積比）加入至lj 1.5 % (質(zhì)量百分比）海藻酸鈉溶 液，磁力攪拌器400rpm轉(zhuǎn)速下攪拌lOmin，得到海藻酸鈉-菌液的水相。將水相按1:1.2比例 (體積比）加入到含有0.5% (體積比）吐溫-80的菜籽油中，然后用磁力攪拌器在SOOrpm轉(zhuǎn)速 下，攪拌20min進(jìn)行乳化，得到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑。
[0073] 7.微膠囊制備
[0074] 按15%的體積將交聯(lián)劑溶液（1L菜籽油中含4ml吐溫-80，20ml的3.5mol/L CaCl2 水溶液)緩慢地加入到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑中，磁力攪拌器200rpm轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌 20min。最后按20%的體積（以海藻酸鈉 -菌液油包水乳劑計)加入0.05mol/L CaCl2水溶液， 攪拌混合均勻，300g離心10min，收集沉淀，得到膠狀微膠囊，用真空冷凍干燥機(jī)在-50°C，凍 干30h，得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0075](二)光學(xué)顯微鏡觀察以及平板計數(shù)法計算活菌數(shù)。
[0076] 1.取步驟4中復(fù)合微生態(tài)制劑原液梯度稀釋，用Van Niel、BPY、MRS固體培養(yǎng)基進(jìn) 行涂布，挑取所有不同單菌落進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為1株沼澤紅假單胞菌、1株枯草芽孢桿 菌、1株地衣芽孢桿菌、1株保加利亞乳酸菌共4株細(xì)菌在復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基中共存。 [0077] 2.取步驟7中的一小滴膠狀微膠囊懸浮于20μ1 PBS中，涂布于載玻片上，蓋上蓋玻 片，在光學(xué)顯微鏡下觀察微膠囊形態(tài)及大小。結(jié)果顯示主要呈球形或扁球形，粒徑比較均 勾，介于26-45μηι之間。
[0078] 3.取3g微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑，平均分為三份。每份分別進(jìn)行30s，500rpm轉(zhuǎn)速 的勻漿，破壞囊壁，釋放菌體，以平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。平板涂布后，首先好氧培養(yǎng)12h，然 后厭氧光照培養(yǎng)20h。所用培養(yǎng)基配方為：1000ml無菌水中含胰蛋白胨5g、酵母膏15g、葡萄 糖2g、醋酸鈉 1.2g、氯化氨lg、碳酸氫鈉 0.6g、硫代硫酸鈉 0.4g、氯化鈉 0.3g、硫酸鎂0. lg、磷 酸二氫鉀〇.〇5g、吐溫-80 lml、磷酸氫二鉀0.22g、乙酸鈉 5g、七水硫酸鎂0.07g，pH，6.8。 [0079]測得微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑（三份）活菌數(shù)分別為7.96 X 109CFU/g、7.05 X 109CFU/g、6.87 X 109CFU/g。
[0080] 實(shí)施例2
[0081 ]( - )水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑制備 [0082] 1.菌種液體培養(yǎng)，制備活化液。
[0083]沼澤紅假單胞菌:取保存于_80°C的沼澤紅假單胞菌甘油管。解凍后，按1%體積加 入裝有Van Niel液體培養(yǎng)基的試管中。用40W白熾燈進(jìn)行光照，厭氧培養(yǎng)，溫度25°C，靜置培 養(yǎng)36h后，得到沼澤紅假單胞菌活化液。
[0084]枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌:分別取保存于-80°C的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌甘油管。解凍后，按1 %體積分別加入裝有BPY液體培養(yǎng)基的試管中。將試管放置于搖床 上，轉(zhuǎn)速為160rpm，溫度為25°C，培養(yǎng)20h，分別得到枯草芽孢桿菌活化液和地衣芽孢桿菌活 化液。
[0085]保加利亞乳酸菌:取保存于_80°C的保加利亞乳酸菌甘油管。解凍后，按1%體積加 入裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于25°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置厭氧培養(yǎng)24h，得到保加利亞乳 酸菌活化液。
[0086] 2.制備菌種種子液
[0087] 將步驟1中的4個菌種活化液按1 % (體積百分比）比例分別加入到裝有對應(yīng)培養(yǎng)基 的三角瓶中，按步驟1中的培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌、保加利亞乳酸菌，使其生長到對數(shù)期，成為菌種種子液。
[0088] 3.制備復(fù)合微生態(tài)制劑種子液
[0089]復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基配方為：1000ml無菌水中含胰蛋白胨2g、酵母膏10g、葡萄 糖lg、醋酸鈉 lg、氯化氨〇.5g、碳酸氫鈉0.3g、硫代硫酸鈉0.2g、氯化鈉0. lg、硫酸鎂0.05g、 磷酸二氫鉀〇.〇58、吐溫-80 0.51111、磷酸氫二鉀0.]^、乙酸鈉28、七水硫酸鎂0.058 4!1，6.0。 按2 % (體積百分比）的接種量轉(zhuǎn)接枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌種子液到上述復(fù)合微生態(tài) 制劑培養(yǎng)基中，有氧條件下震蕩培養(yǎng)24h，然后再按2% (體積百分比）接種量轉(zhuǎn)接沼澤紅假 單胞菌種子液，厭氧光照靜置培養(yǎng)48h，最后按1% (體積百分比）的比例轉(zhuǎn)接保加利亞乳酸 菌種子液，厭氧靜置培養(yǎng)72h，得到復(fù)合微生態(tài)制劑種子液。
[0090] 4.擴(kuò)大培養(yǎng)
[0091] 按2% (體積百分比）的比例轉(zhuǎn)接步驟3中制備的復(fù)合微生態(tài)制劑種子液，利用步驟 3中的培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)72h，厭氧培養(yǎng)96h，獲得復(fù)合微生態(tài)制劑原液。
[0092] 5.洗滌
[0093] 將復(fù)合微生態(tài)制劑原液于3000rpm條件下，離心10min，棄上清液，獲得菌泥。用原 液1/10體積的無菌PBS洗滌菌泥，振蕩混均，離心棄上清，隨后用1/10體積的無菌PBS重新懸 浮菌泥，得到菌懸液。
[0094] 6.菌膠液制備
[0095]取步驟5中菌懸液，按1:10比例（體積比）加入至lj 1.5 % (質(zhì)量百分比）海藻酸鈉溶 液，磁力攪拌器300rpm轉(zhuǎn)速下攪拌15min，得到海藻酸鈉-菌液的水相。將水相按1:1比例(體 積比）加入到含有0.5% (體積比）吐溫-80的大豆油中，然后用磁力攪拌器在500rpm轉(zhuǎn)速下， 攪拌30min進(jìn)行乳化，得到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑。
[0096] 7.微膠囊制備
[0097] 按10 %的體積將交聯(lián)劑溶液（1L大豆油中含2ml吐溫-80，15ml的3.5mo 1/L CaCl2 水溶液)緩慢地加入到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑中，磁力攪拌器150rpm轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌 30min。最后按10%的體積（以海藻酸鈉-菌液油包水乳劑計)加入0.05mol/L CaCl2溶液，攪 拌混合均勻，500g離心10min，收集沉淀，得到膠狀微膠囊，用真空冷凍干燥機(jī)在-50 °C，凍干 36h，得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0098] (二)儲存時間對復(fù)合微生態(tài)制劑和微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑存活率的影響。
[0099] 1.下面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究儲存時間對復(fù)合微生態(tài)制劑和微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑存 活率的影響。
[0100] 實(shí)驗(yàn)分為2組，分別是復(fù)合微生態(tài)制劑組和微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑組，每組包括 4個平行。
[0101] 具體操作:將步驟5中得到的復(fù)合微生態(tài)制劑(菌泥_50°C凍干36h)和步驟7得到的 微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑分別包裝在4個塑料自封袋(分別對應(yīng)4個平行）中，分別于室溫下 避光保存放置1個月、3個月、6個月，儲存前樣品設(shè)定為儲存0個月，作為對照。所有樣品以平 板計數(shù)法測定活菌數(shù)。平板涂布后，首先好氧培養(yǎng)12h，然后厭氧光照培養(yǎng)20h。其中微膠囊 化復(fù)合微生態(tài)制劑在平板計數(shù)前，進(jìn)行30 s，500rpm轉(zhuǎn)速的勾楽;，破壞囊壁，釋放菌體。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果以每組樣品的存活率表示。存活率=儲存期滿每g樣品活菌數(shù)/對照組每g樣品活菌數(shù) X100%〇
[0102] 實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基配方為：l〇〇〇ml無菌水中含胰蛋白胨2g、酵母膏10g、葡萄糖lg、 醋酸鈉 lg、氯化氨〇. 5g、碳酸氫鈉0.3g、硫代硫酸鈉0.2g、氯化鈉0. lg、硫酸鎂0.05g、磷酸二 氫鉀0.058、吐溫-80 0.51111、磷酸氫二鉀0.]^、乙酸鈉28、七水硫酸鎂0.058 4!1，6.0。
[0103] 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0104] 表1.儲存時間對復(fù)合微生態(tài)制劑和微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑存活率的影響單位： 109CFU/g
[0105]
[0106] 利用生物統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS進(jìn)行配對T檢驗(yàn)分析表明，微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑組 在儲存期為1個月、3個月、6個月時存活率分別顯著高于復(fù)合微生態(tài)制劑儲存期1個月、3個 月、6個月時的存活率(P〈0.05)。實(shí)驗(yàn)說明微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑比復(fù)合微生態(tài)制劑保存 期更長。
[0107] 實(shí)施例3
[0108] ( - )水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑制備
[0109] 1.菌種液體培養(yǎng)，制備活化液。
[0110] 沼澤紅假單胞菌:取保存于-80°c的沼澤紅假單胞菌甘油管。解凍后，按3%體積加 入裝有Van Niel液體培養(yǎng)基的試管中。用100W白熾燈進(jìn)行光照，厭氧培養(yǎng)，溫度30°C，靜置 培養(yǎng)24h后，得到沼澤紅假單胞菌活化液。
[0111] 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌:分別取保存于-80°C的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌甘油管。解凍后，按3%體積分別加入裝有BPY液體培養(yǎng)基的試管中。將試管放置于搖床 上，轉(zhuǎn)速為200rpm，溫度為30 °C，培養(yǎng)12h，分別得到枯草芽孢桿菌活化液和地衣芽孢桿菌活 化液。
[0112]保加利亞乳酸菌:取保存于-80°C的保加利亞乳酸菌甘油管。解凍后，按3%體積加 入裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置厭氧培養(yǎng)12h，得到保加利亞乳 酸菌活化液。
[0113] 2.制備菌種種子液
[0114] 將步驟1中的4個菌種活化液按3% (體積百分比）比例分別加入到裝有對應(yīng)培養(yǎng)基 的三角瓶中，按步驟1中的培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌、保加利亞乳酸菌，使其生長到對數(shù)期，成為菌種種子液。
[0115] 3.制備復(fù)合微生態(tài)制劑種子液
[0116]復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基配方為：1000ml無菌水中含胰蛋白胨7g、酵母膏20g、葡萄 糖3g、醋酸鈉1.5g、氯化氨1.5g、碳酸氫鈉0.9g、硫代硫酸鈉0.6g、氯化鈉0.5g、硫酸鎂 0.15g、磷酸二氫鉀0. lg、吐溫-80 1.5ml、磷酸氫二鉀0.4g、乙酸鈉8g、七水硫酸鎂0. lg，pH， 7.0。按8% (體積百分比）的接種量轉(zhuǎn)接枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌種子液到上述復(fù)合微 生態(tài)制劑培養(yǎng)基中，有氧條件下震蕩培養(yǎng)12h，然后再按6% (體積百分比）接種量轉(zhuǎn)接沼澤 紅假單胞菌種子液，厭氧光照靜置培養(yǎng)36h，最后按4% (體積百分比）的比例轉(zhuǎn)接保加利亞 乳酸菌種子液，厭氧靜置培養(yǎng)48h，得到復(fù)合微生態(tài)制劑種子液。
[0117] 4.擴(kuò)大培養(yǎng)
[0118] 按8% (體積百分比）的比例轉(zhuǎn)接步驟3中制備的復(fù)合微生態(tài)制劑種子液，利用步驟 3中的培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)48h，厭氧培養(yǎng)48h，獲得復(fù)合微生態(tài)制劑原液。
[0119] 5.洗滌
[0120] 將復(fù)合微生態(tài)制劑原液于6000rpm條件下，離心10min，棄上清液，獲得菌泥。用原 液1/10體積的無菌PBS洗滌菌泥，振蕩混均，離心棄上清，隨后用1/10體積的無菌PBS重新懸 浮菌泥，得到菌懸液。
[0121] 6.菌膠液制備
[0122] 取步驟5中菌懸液，按1: 25比例（體積比）加入到1.5 % (質(zhì)量百分比）海藻酸鈉溶 液，磁力攪拌器600rpm轉(zhuǎn)速下攪拌5min，得到海藻酸鈉-菌液的水相。將水相按1: 2.5比例 (體積比）加入到含有0.5% (體積比）吐溫-80的花生油中，然后用磁力攪拌器在900rpm轉(zhuǎn)速 下，攪拌15min進(jìn)行乳化，得到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑。
[0123] 7.微膠囊制備
[0124] 按25%的體積將交聯(lián)劑溶液（11^花生油中含61111吐溫-80,251111的3.5111〇1/10 &(：12 水溶液)緩慢地加入到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑中，磁力攪拌器150rpm轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌 30min。最后按25%的體積（以海藻酸鈉-菌液油包水乳劑計)加入0.05mol/L CaCl2溶液，攪 拌混合均勻，500g離心10min，收集沉淀，得到膠狀微膠囊，用真空冷凍干燥機(jī)在-50°C，凍干 24h，得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0125] (二)高溫對復(fù)合微生態(tài)制劑和微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑存活率的影響
[0126] 1.實(shí)驗(yàn)分兩組，分別是復(fù)合微生態(tài)制劑組和微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑組，每組包 括4個平行。
[0127] 具體操作為:將步驟5中得到的復(fù)合微生態(tài)制劑(菌泥_50°C凍干36h)和步驟7得到 的微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑分別取lg溶解于lml的PBS中，震蕩混勻，得到菌懸液。然后每組 分別取200μ1放入4個EP管中（代表4個平行）。調(diào)整水浴鍋水溫至85°C，裝有菌懸液的EP管在 水浴鍋中放置15min后，以平板計數(shù)法測定各樣品活菌數(shù)。平板涂布后，首先好氧培養(yǎng)12h， 然后厭氧光照培養(yǎng)20h。其中微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑在平板計數(shù)前，進(jìn)行30s，500rpm轉(zhuǎn)速 的勻漿，破壞囊壁，釋放菌體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以每組樣品菌株的存活率表示。存活率=熱處理后 每g樣品活菌數(shù)/熱處理前每g樣品活菌數(shù)X 100%。
[0128] 所用培養(yǎng)基為：1000ml無菌水中含胰蛋白胨7g、酵母膏20g、葡萄糖3g、醋酸鈉 1.5g、氯化氨1.5g、碳酸氫鈉0.9g、硫代硫酸鈉0.6g、氯化鈉0.5g、硫酸鎂0.15g、磷酸二氫鉀 0.18、吐溫_80 1.51111、磷酸氫二鉀0.48、乙酸鈉88、七水硫酸鎂0.18，？!1，7.0。
[0129] 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。
[0130] 表2.熱處理對復(fù)合微生態(tài)制劑和微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑存活率的影響單位： 109CFU/g
[0131]
[0132] 利用生物統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS進(jìn)行配對T檢驗(yàn)分析表明，在熱處理后，微膠囊化復(fù)合微 生態(tài)制劑的存活率顯著高于復(fù)合微生態(tài)制劑的存活率(P〈〇. 05)。說明微膠囊化復(fù)合微生態(tài) 制劑比復(fù)合微生態(tài)制劑更耐熱。
[0133] 實(shí)施例4
[0134] ( - )水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑制備
[0135] 1.菌種液體培養(yǎng)，制備活化液。
[0136] 沼澤紅假單胞菌:取保存于-80°C的沼澤紅假單胞菌甘油管。解凍后，按2%體積加 入裝有Van Niel液體培養(yǎng)基的試管中。用60W白熾燈進(jìn)行光照，厭氧培養(yǎng)，溫度28°C，靜置培 養(yǎng)32h后，得到沼澤紅假單胞菌活化液。
[0137] 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌:分別取保存于-80°C的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌甘油管。解凍后，按2%體積分別加入裝有BPY液體培養(yǎng)基的試管中。將試管放置于搖床 上，轉(zhuǎn)速為160rpm/min，溫度為28 °C，培養(yǎng)18h，分別得到枯草芽孢桿菌活化液和地衣芽孢桿 菌活化液。
[0138] 保加利亞乳酸菌:取保存于-80°C的保加利亞乳酸菌甘油管。解凍后，按2%體積加 入裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置厭氧培養(yǎng)20h，得到保加利亞乳 酸菌活化液。
[0139] 2.制備菌種種子液
[0140] 將步驟1中的4個菌種活化液按2% (體積百分比）比例分別加入到裝有對應(yīng)培養(yǎng)基 的三角瓶中，按步驟1中的培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌、保加利亞乳酸菌，使其生長到對數(shù)期，成為菌種種子液。
[0141 ] 3.制備復(fù)合微生態(tài)制劑種子液
[0142] 復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基配方為：1000ml無菌水中含胰蛋白胨4g、酵母膏12g、葡萄 糖2g、醋酸鈉1.5g、氯化氨1.5g、碳酸氫鈉0.6g、硫代硫酸鈉0.4g、氯化鈉0.4g、硫酸鎂0. lg、 磷酸二氫鉀〇· lg、吐溫-80 1.0ml、磷酸氫二鉀0.3g、乙酸鈉4g、七水硫酸鎂0.05g，pH，6.4。 按3 % (體積百分比）的接種量轉(zhuǎn)接枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌種子液到上述復(fù)合微生態(tài) 制劑培養(yǎng)基中，有氧條件下震蕩培養(yǎng)24h，然后再按3% (體積百分比）接種量轉(zhuǎn)接沼澤紅假 單胞菌種子液，厭氧光照靜置培養(yǎng)48h，最后按3% (體積百分比）的比例轉(zhuǎn)接保加利亞乳酸 菌種子液，厭氧靜置培養(yǎng)72h，得到復(fù)合微生態(tài)制劑種子液。
[0143] 4.擴(kuò)大培養(yǎng)
[0144] 按6% (體積百分比）的比例轉(zhuǎn)接步驟3中制備的復(fù)合微生態(tài)制劑種子液，利用步驟 3中的培養(yǎng)基，好氧培養(yǎng)72h，厭氧培養(yǎng)96h，獲得復(fù)合微生態(tài)制劑原液。
[0145] 5.洗滌
[0146] 將復(fù)合微生態(tài)制劑原液于5000rpm條件下，離心10min，棄上清液，獲得菌泥。用原 液1/10體積的無菌PBS洗滌菌泥，振蕩混均，離心棄上清，隨后用1/10體積的無菌PBS重新懸 浮菌泥，得到菌懸液。
[0147] 6.菌膠液制備
[0148] 取步驟5中菌懸液，按1:15比例（體積比）加入到1.5 % (質(zhì)量百分比）海藻酸鈉溶 液，磁力攪拌器400rpm轉(zhuǎn)速下攪拌15min，得到海藻酸鈉-菌液的水相。將水相按1:1.5比例 (體積比）加入到含有0.5% (體積比）吐溫-80的等量混合的菜籽油和亞麻油中，然后用磁力 攪拌器在SOOrpm轉(zhuǎn)速下，攪拌25min進(jìn)行乳化，得到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑。
[0149] 7.微膠囊制備
[0150] 按15 %的體積將交聯(lián)劑溶液（1L等量混合的菜籽油和亞麻油中含5m 1吐溫-80， 22ml的3.5mol/L CaCl2水溶液)緩慢地加入到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑中，磁力攪拌器 200印111轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌2〇1]1；[11。最后按15%的體積（以海藻酸鈉-菌液油包水乳劑計）加入 0.05mol/L CaCl2溶液，攪拌混合均勻，250g離心15min，收集沉淀，得到膠狀微膠囊，用真空 冷凍干燥機(jī)在_50°C，凍干36h，得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑。
[0151] (二)攻毒試驗(yàn)
[0152] 1.養(yǎng)殖鯽魚144尾(重量45-57g)，分3組，分別是微膠囊復(fù)合組、復(fù)合組和對照組。 每組48尾，每組包括3個平行(分別標(biāo)記為A、B、C)，每個平行16尾。取嗜水氣單胞菌調(diào)整為1 X106CFU/ml濃度的菌液，每尾鯽魚腹腔注射30μ1的嗜水氣單胞菌懸液，飼喂28天后計算累 計死亡率。養(yǎng)殖所用基礎(chǔ)日糧見表3，微膠囊復(fù)合組飼喂在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上按1 % (質(zhì)量百分 比）添加步驟7中的微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑的飼料，復(fù)合組飼喂在基礎(chǔ)日糧基礎(chǔ)上按1 % (質(zhì)量百分比）添加步驟5中的復(fù)合微生態(tài)制劑（菌泥_50°C凍干36h)的飼料，對照組飼喂基 礎(chǔ)日糧。
[0153] 表3.鯽魚基礎(chǔ)日糧和營養(yǎng)水平（％ )
[0154]
[0155] 注：維生素預(yù)混料可為每千克日糧提供VA，1400.0IU; VD，400.0IU; VK，35. Omg; VE， 45.011^;￥(：，45.011^;￥8，12.011^;￥82,30.011^ ;￥86,3.011^;￥812,6.(^8;生物素，0.611^;泛酸， 15 · Omg;煙酸17 · Omg;葉酸，1 · 6mg。每千克日糧中，礦物質(zhì)預(yù)混料提供FeS〇4 · H20，0 · 05g; ZnS〇4H20，0 · 04g; CuS〇4 · 5H20，0 · 05g; MnS〇4 · H2O，0 · 045g; ΚΙ，0 · 045g; Na2Se〇4，0 · 045g; KC1， 0·055g;NaCl，0·055g;MnS〇4· H2O，0·005g。
[0156] 2.攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。
[0157] 表4.攻毒實(shí)驗(yàn)死亡數(shù)及死亡率統(tǒng)計單位(尾）
[0158]
[0159] 結(jié)果表明，攻毒感染后，對照組死亡率最高，其次是復(fù)合組，微膠囊化復(fù)合組死亡 率最低。利用生物統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)分析表明三組之間死亡率具有顯著性差 異(p〈0.05)。實(shí)驗(yàn)表明復(fù)合微生態(tài)制劑和微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑都具有比較明顯的抗病 效果，但微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑的抗病作用更強(qiáng)。
[0160] 以上所述的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi) 的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，不能僅以本實(shí)施例來限定本發(fā)明的專利范 圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于，將枯草芽孢桿菌、 地衣芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌、保加利亞乳酸菌的種子液進(jìn)行混合發(fā)酵培養(yǎng)，獲得復(fù)合微 生態(tài)制劑原液，將復(fù)合微生態(tài)制劑原液作為芯材，海藻酸鈉作為壁材，分散有吐溫-80的植 物油作為油相，分散有氯化鈣和吐溫-80的植物油作為交聯(lián)劑，氯化鈣溶液作為固化劑，進(jìn) 行乳化法反應(yīng)，離心收集沉淀，得到膠狀微膠囊，真空冷凍、凍干，得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài) 制劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于， 所述復(fù)合微生態(tài)制劑原液中枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌、保加利亞乳酸 菌的活菌數(shù)分別為1 X 1〇9-1QCFU/ml、1 X 108-1QCFU/ml、1 X 108-1QCFU/ml，得到微膠囊化復(fù)合 微生態(tài)制劑呈球形或扁球形，粒徑介于26-45μπι之間。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1) 菌種液體培養(yǎng)，制備活化液 沼澤紅假單胞菌:取保存于-80°C的沼澤紅假單胞菌甘油管，解凍后，按1-3 %體積加入 裝有￥&11附61液體培養(yǎng)基的試管中；用40-1001白熾燈進(jìn)行光照，厭氧培養(yǎng)，溫度25-30°(：， 靜置培養(yǎng)24-36h后，得到沼澤紅假單胞菌活化液； 枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌:分別取保存于-80°C的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌甘 油管，解凍后，按1-3%體積分別加入裝有BPY液體培養(yǎng)基的試管中，將試管放置于搖床上， 轉(zhuǎn)速為160-200rpm，溫度為25-30°C，培養(yǎng)12-20h，分別得到枯草芽孢桿菌活化液和地衣芽 孢桿菌活化液； 保加利亞乳酸菌:取保存于-80°C的保加利亞乳酸菌甘油管，解凍后，按1-3 %體積加入 裝有MRS液體培養(yǎng)基的試管中，于25-30°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置厭氧培養(yǎng)12-24h，得到保加利 亞乳酸菌活化液； (2) 制備菌種種子液 將步驟(1)中的4個菌種活化液按體積百分比1-3%比例分別加入到裝有對應(yīng)培養(yǎng)基的 三角瓶中，按步驟(1)中的培養(yǎng)條件，分別培養(yǎng)沼澤紅假單胞菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿 菌、保加利亞乳酸菌，使其生長到對數(shù)期，成為菌種種子液； (3) 制備復(fù)合微生態(tài)制劑種子液 復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基配方為：l〇〇〇ml無菌水中含胰蛋白胨2-7g、酵母膏10-20g、葡萄 糖l-3g、醋酸鈉1-1.5g、氯化氨0.5-1.5g、碳酸氫鈉0.3-0.9g、硫代硫酸鈉0.2-0.6g、氯化鈉 0.1-0.5g、硫酸鎂0.05-0.15g、磷酸二氫鉀0.05-0 .lg、吐溫-80 0.5-1.5ml、磷酸氫二鉀 0.1-0.4g、乙酸鈉2-8g、七水硫酸鎂0.05-0. lg，pH，6.0-7.0; 將步驟(2)得到的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌種子液轉(zhuǎn)接到上述復(fù)合微生態(tài)制劑培 養(yǎng)基中，有氧條件下震蕩培養(yǎng)12_24h，然后轉(zhuǎn)接沼澤紅假單胞菌種子液，厭氧光照靜置培養(yǎng) 36-48h，最后轉(zhuǎn)接保加利亞乳酸菌種子液，厭氧靜置培養(yǎng)48-72h，得到復(fù)合微生態(tài)制劑種子 液;按體積百分比，轉(zhuǎn)接量為復(fù)合微生態(tài)制劑培養(yǎng)基:枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌種子液： 沼澤紅假單胞菌種子液:保加利亞乳酸菌種子液=1: (2 % -8 % ): (2 % -6 % ): (1 % -4 % ); (4) 擴(kuò)大培養(yǎng) 按體積百分比2%_8%的比例轉(zhuǎn)接步驟(3)中制備的復(fù)合微生態(tài)制劑種子液到步驟(3) 中制備的培養(yǎng)基中，好氧培養(yǎng)48-72h，厭氧培養(yǎng)48-96h，獲得復(fù)合微生態(tài)制劑原液； (5) 洗滌 將復(fù)合微生態(tài)制劑原液于3000-6000rpm條件下，離心10min，棄上清液，獲得菌泥；用原 液1/10體積的無菌PBS洗滌菌泥，振蕩混均，離心棄上清，隨后用1/10體積的無菌PBS重新懸 浮菌泥，得到菌懸液； (6) 菌膠液制備 取步驟(5)中菌懸液，按體積比1:10-25比例加入到質(zhì)量百分比濃度1.5 %的海藻酸鈉 水溶液中，磁力攪拌器300_600rpm轉(zhuǎn)速下攪拌5-15min，得到海藻酸鈉-菌液的水相，將水相 按體積比1:1.0-2.5比例加入到含有體積比濃度為0.5%的吐溫-80的植物油中，然后用磁 力攪拌器在500-900rpm轉(zhuǎn)速下，攪拌15-30min進(jìn)行乳化，得到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑； (7) 微膠囊制備 按10-25 %的體積將交聯(lián)劑溶液緩慢地加入到海藻酸鈉-菌液油包水乳劑中，磁力攪拌 器150-250rpm轉(zhuǎn)速下持續(xù)攪拌15-30min，最后以海藻酸鈉-菌液油包水乳劑計，按10-25% 的體積加入〇. 〇5mol/L CaCl2水溶液，攪拌混合均勻，200-500g離心10-15min，收集沉淀，得 到膠狀微膠囊，用真空冷凍干燥機(jī)在_50°C，凍干24-36h，得到微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑，所 述交聯(lián)劑溶液為每1L植物油中含2-6ml吐溫-80，15-25ml的3.5mol/L CaCl2水溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法，其特征在于， 所述植物油指從植物的果實(shí)、種子、胚芽中得到的油脂，為花生油、大豆油、亞麻油、蓖麻油 或菜籽油中的一種或幾種組合。5. 如權(quán)利要求1-4任一項所述的水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑的制備方法制得的 水產(chǎn)飼用微膠囊化復(fù)合微生態(tài)制劑。
【文檔編號】A23K50/80GK106085864SQ201610439286
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】孫敬鋒, 孫金輝, 陳豐, 呂愛軍
【申請人】天津農(nóng)學(xué)院