草酸青霉bam-1及其分離純化方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種菌株草酸青霉（Penicillium?oxalicum）BAM-1。該菌株是從林地有機(jī)材料覆蓋雷竹林土壤、長期堆放的有機(jī)覆蓋物中分離出來的一支純的菌株，該菌株序列與草酸青霉(Penicillium?oxalicum)的26SrRNA基因序列高度同源(99.3%)。本發(fā)明提供了該菌株的培養(yǎng)、產(chǎn)酶、發(fā)酵條件及竹林中應(yīng)用的環(huán)境條件。該菌株能夠有效分解高纖維素含量的林地有機(jī)覆蓋物稻草、礱糠，加速了林地存留有機(jī)覆蓋物的快速生態(tài)腐解，尤其在竹林可持續(xù)經(jīng)營中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】草酸青霉BAM-1及其分離純化方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種草酸青霉BAM-1及其分離純化方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]雷竹是我國優(yōu)良的筍用竹種，筍味鮮美、產(chǎn)量高、效益好，在我國南方的浙江、江西等地有規(guī)模栽培，目前我國雷竹林面積達(dá)20多萬hm_2。以雷竹為主栽竹種的竹筍業(yè)已成為區(qū)域農(nóng)村經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民家庭經(jīng)濟(jì)收入的主要來源。自上世紀(jì)90年代初以來，許多筍用竹產(chǎn)區(qū)大面積推廣應(yīng)用有機(jī)材料(主要為礱糠、稻草)林地覆蓋技術(shù)，利用覆蓋物的發(fā)酵增溫、保溫、保濕作用促使筍芽提早分化、萌發(fā)，在秋冬季、早春有竹筍產(chǎn)出，滿足市場對鮮筍供應(yīng)淡季的大量需求，顯著地提高了筍用竹林的經(jīng)濟(jì)效益，這對雷竹在許多適生區(qū)的大規(guī)模推廣栽培起到了極大的促進(jìn)作用。然而，林地有機(jī)材料覆蓋過程中大量有機(jī)覆蓋物(39 t.hm_2.a-1稻草和54 t.hm_2.a—1礱糠)的輸入對雷竹林生態(tài)系統(tǒng)健康產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，突出表現(xiàn)在覆蓋竹林極易產(chǎn)生立地生產(chǎn)力衰退，僅浙江省臨安市3萬hm2的雷竹林中就有1/2以上竹林出現(xiàn)了不同程度的退化，重度退化竹林幾乎無經(jīng)濟(jì)產(chǎn)出。究其原由，短期內(nèi)難以自然分解的有機(jī)材料覆蓋物的大量林地存留是引起竹林退化的主要原因之一。有機(jī)覆蓋物均為高C/N比材料，特別是礱糠，自然條件下分解需3年以上時間，覆蓋后林地很難清理徹底，多年覆蓋的竹林地存留覆蓋物厚度至少5cm以上，每年竹林出筍成竹后的林地墾復(fù)使大量有機(jī)覆蓋物充斥于土壤中，導(dǎo)致土壤發(fā)生物理、化學(xué)和生物性劣變。目前針對雷竹林覆蓋過程中存留的大量的有機(jī)覆蓋物尚無生態(tài)、環(huán)保的處理方法，竹農(nóng)也多采取深翻林地和加客土的方式來減輕有機(jī)覆蓋物存留所帶來的負(fù)面影響，但仍無法很好地解決有機(jī)覆蓋物短期內(nèi)難以有效分解的現(xiàn)實(shí)問題。因此，分離與篩選高C/N比有機(jī)覆蓋材料高效分解微生物，并掌握其培養(yǎng)條件、產(chǎn)酶特性、發(fā)酵方法及覆蓋雷竹林中的應(yīng)用技術(shù)，有利于雷竹林土壤環(huán)境改善，促進(jìn)退化雷竹林恢復(fù)，保障雷竹林健康可持續(xù)經(jīng)營和竹筍質(zhì)量安全，也是竹農(nóng)生產(chǎn)中迫切需 要的實(shí)用技術(shù)，推廣應(yīng)用前景巨大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種能高效分解有機(jī)覆蓋物的菌種，尤其是對竹林地存留的有機(jī)覆蓋物具有高效分解能力的微生物菌株，并提供該菌株的篩選、分離純化、培養(yǎng)等方法，以及該菌株在分解林地有機(jī)覆蓋物上的應(yīng)用技術(shù)，從而解決竹林地有機(jī)覆蓋物大量存留引起竹林退化的現(xiàn)實(shí)問題。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明提供的具有高效分解有機(jī)覆蓋物能力的微生物菌株為草酸青霉ox37icw?)BAM-l，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日:2013年10月10日，保藏號為CGMCC N0.8315。
[0005]草酸青霉iPeniciIlium oxalicum ) BAM-1的特征為:菌落形態(tài)平坦，質(zhì)地絨狀，菌絲體白色，分生孢子灰綠色，無可溶性色素。顯微鏡下觀察菌株的菌絲體，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，帚狀枝雙輪生，偶有三輪生或單輪生；?；枯?-3個，13-20X3.2-3.7 μ m，彼此通常較緊貼；瓶梗幼齡時為瓶狀至披針狀，充分成熟時近圓柱形，梗頸明顯，分生孢子橢圓形，4.5-5.5X3.0-4.0 μ m，壁平滑。該菌株26S rRNA基因序列遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫,序列與草酸青霉(Penicillium oxalicum) 26S rRNA基因序列高度同源(99.3%)。
[0006]所述的草酸青霉iPeniciIlium oxalicum ) BAM-1,其分離純化方法包括以下步驟:
1)富集培養(yǎng):取土壤和腐爛有機(jī)覆蓋物樣品，在無菌水中振蕩分散后，取懸濁液接種于馬丁氏孟加拉紅富集培養(yǎng)基中，28 1:下120 PmirT1振蕩培養(yǎng)2 d，反復(fù)培養(yǎng)3次；馬丁氏孟加拉紅富集培養(yǎng)基的配方為:KH2PO4 I g、MgSO4.7Η20 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、孟加拉紅3.3 mg、鏈霉素30 μ g、H2O 1000 ml、自然pH值；
2)初篩:取第三次富集培養(yǎng)液，用玻璃涂布棒均勻涂布在剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基上，28 °C下培養(yǎng)，以在平板上出現(xiàn)透明水解圈的時間以及培養(yǎng)4-5 d后水解圈直徑與菌落直徑的比值大小為基準(zhǔn)，篩選水解圈出現(xiàn)早且直徑較大的菌株。將篩選出的菌株保存在PDA平板培養(yǎng)基上；
剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基配方為:CMC-Na 2.1 g、剛果紅0.39 g、(NH4) SO4 2.1 g、MgSO4*7H20 0.5 g, K2HPO4 1.05 g、NaCl 0.5 g、瓊脂 18 g、H2O 1000 ml、自然 pH 值；
3)復(fù)篩:將初篩獲得的透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，用直徑I cm打孔器在菌落生長均勻處取菌塊接種到赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，28 °C下120 r.mirT1振蕩培養(yǎng)5 d，測定發(fā)酵液濾紙酶活力，篩選出酶活力最高的菌株，測序，該菌株的26S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示；赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基配方為:稻草25 g、KH2PO4 1.05 g、NaCl 0.11 g、MgSO4.7Η20 0.29 g,NaNO3 2.51 g,FeCl3 0.01 g、CaCl2 0.10g、H20 1000 ml、pH 值 6.05。
[0007]尊窗著霉^Penicillium οχ3^7----)ΒΑΜ-1的活化方法如下:配制PDA固體培養(yǎng)基，高壓滅菌，冷卻至50 °C左右，倒平板，冷卻后用粘菌株的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上劃線，用封口膜封好培養(yǎng)皿，倒置28 1:靜置培養(yǎng)3-5 d，可重復(fù)復(fù)壯1-2次，整個接種與培養(yǎng)過程在超凈工作臺中無菌條件下進(jìn)行；所述的PDA固體培養(yǎng)基的制作方法為:1)取去皮馬鈴薯200g,切碎,加入500 ml蒸懼水煮沸15 min,過濾,得到馬鈴薯汁；2)在該馬鈴薯汁中加入葡萄糖20 g ;3)然后加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05 ;得到液體PDA液體培養(yǎng)基；4)向PDA液體培養(yǎng)基中加入18 g瓊脂，得到固體PDA培養(yǎng)基。
[0008]尊窗著霉^Penicillium οχ3^7----)ΒΑΜ-1的培養(yǎng)方法如下:配制PDA液體培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后，用接種環(huán)從復(fù)壯菌落邊緣取直徑0.5 cm的生長旺盛且無污染的菌塊2-3塊，接種至PDA液體培養(yǎng)基中，120 r.min-Ι搖瓶培養(yǎng)3_5 d，整個接種與培養(yǎng)過程在超凈工作臺中無菌條件下進(jìn)行。
[0009]尊窗著霉^Penicillium (Ora/icw?) BAM-1可用于分解林地有機(jī)覆蓋物。
[0010]駕履"著霉(FeniciIIium oxalicum) BAM-1在分解雷竹林有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用,其特征在于其應(yīng)用方法為:取用草酸青霉BAM-1發(fā)酵菌液,發(fā)酵菌液生物量為38.5 g干菌.L—1，菌液濾紙酶活力為8.65-10.91U，用量為60-90 kg.hm_2，按1:10稀釋后均勻噴灑于土壤表面，并淺鋤表層土壤，使發(fā)酵菌液與土及有機(jī)覆蓋物充分接觸；應(yīng)用季節(jié)為5-6月和9-10月，氣溫以30-35°C為宜，林地土壤體積水分率為50_60%。
[0011]所述的草酸青霉BAM-1在分解雷竹林有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用，其特征在于所述的發(fā)酵菌液的制備方法為:采用含1%食用油的改良PDA液體培養(yǎng)基，其組分為:去皮馬鈴薯220 g，葡萄糖21 g，食用油10ml，加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05 ;28 °C下發(fā)酵3 d，溶氧量為73 %，攪拌子轉(zhuǎn)速為20 r.mirT1，消泡劑為非離子型改性聚硅氧燒 。
[0012]上述的草酸青霉oxali cum) BAM_1,是從林地有機(jī)材料覆蓋雷竹林土壤、長期堆放有機(jī)覆蓋物中分離出來的一支純的菌株，能在以竹葉、稻草、礱糠為唯一碳源的培養(yǎng)基上良好生長，且生物量與產(chǎn)酶效果明顯優(yōu)于已公布的優(yōu)良纖維素降解菌株哈茨ifMXTrichoderma harziamumy$\綠色Jf.霉 iTrichoderma Kirofe)。本發(fā)明提供了該菌株的分離純化方法并對其培養(yǎng)、產(chǎn)酶、發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，培養(yǎng)方法簡單，效果好。該菌株能夠有效分解高纖維素含量的林地有機(jī)覆蓋物稻草、礱糠，加速了林地存留有機(jī)覆蓋物的快速、生態(tài)腐解，尤其是在竹林可持續(xù)經(jīng)營中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1 % Penicillium oxali cum BAM-1與綠色木霉、哈茨木霉產(chǎn)酶活性比較 圖2為搖'瓶培養(yǎng)Pen i c i 11 i um oxali cum BAM-1生物量積累曲線
圖 3 % Penicillium oxali cum BAM-1 顯微結(jié)構(gòu)圖
圖 4 為 Penicillium oxali cum BAM-1 的系統(tǒng)分類圖
圖5為Penicillium oxali cum BAM-1在發(fā)酵試驗(yàn)中的生物量積累曲線
圖6為Penicillium oxali cum BAM-1對竹葉、稻草和礱糠的分解效果
圖7為對照對竹葉、稻草和礱糠的分解效果
戰(zhàn)込為Penicillium oxali cum BAM-1雷竹林存留有機(jī)覆蓋物分解率曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說明。有必要在此指出的是，以下實(shí)施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
對本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。以下通過具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0015]實(shí)施例1:菌株的分離、活化和培養(yǎng)
該菌株分離自浙江省臨安市太湖源鎮(zhèn)高云村長期堆放的雷竹林地有機(jī)覆蓋物和覆蓋雷竹林土壤，經(jīng)過樣品的富集培養(yǎng)、初篩、復(fù)篩分離得到的一支純的菌株。
[0016]樣品的富集培養(yǎng):各稱取土壤和腐爛有機(jī)覆蓋物樣品10.0 g，加入裝有90 ml無菌水和玻璃珠的250 ml三角瓶中，180 PmirT1振蕩30 min使樣品充分分散，用無菌移液器取懸濁液5 ml接種于45 ml富集培養(yǎng)基中，28 1:下120 PmirT1振蕩培養(yǎng)2 d。再取培養(yǎng)液接種到新鮮無菌富集培養(yǎng)基中，反復(fù)培養(yǎng)3次。
[0017]富集培養(yǎng)基采用改良的馬丁氏孟加拉紅液體培養(yǎng)基，其配方為:KH2PO4 lg、MgSO4.7H20 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10g、瓊脂20 g、孟加拉紅3.3mg鏈霉素30 μ g、H2O1000 ml、自然 pH 值。
[0018]初篩:選用剛果紅纖維素培養(yǎng)基進(jìn)行纖維素降解菌的初步篩選。取第三次富集培養(yǎng)液100 μ?，用玻璃涂布棒均勻涂布在剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基上，28 °c下培養(yǎng)，以在平板上出現(xiàn)透明水解圈的時間以及培養(yǎng)4-5 d后水解圈直徑與菌落直徑的比值大小為基準(zhǔn)，篩選水解圈出現(xiàn)早且直徑較大的菌。將篩選出的菌株保存在PDA平板培養(yǎng)基上。
[0019]剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基配方為:CMC_Na 2.1 g、剛果紅0.39 g、(NH4) SO4 2.1 g、MgSO4*7H20 0.5 g, K2HPO4 1.05 g、NaCl 0.5 g、瓊脂 18 g、H2O 1000 ml、自然 pH 值。
[0020]復(fù)篩:將初篩獲得的透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，用直徑I cm打孔器在菌落生長均勻處取菌塊接種到以稻草秸桿為唯一碳源的赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基中(配方為:稻草 25g, KH2PO4 1.05g、NaCl 0.llg、MgS04.7H20 0.29 g, NaNO32.51 g、FeCl3 0.01g、CaCl2 0.10g、H2O 1000 ml、pH 值 6.05)，28。。下 120 r.mirT1 振蕩培養(yǎng)5 d，測定發(fā)酵液濾紙酶活，篩選出酶活力高的菌株，觀察菌落特征并測序。
[0021]該菌株具有如下特征:菌落形態(tài)平坦，質(zhì)地絨狀，菌絲體白色，分生孢子灰綠色，無可溶性色素。顯微鏡下觀察菌株的菌絲體(見圖3)，分生孢子梗發(fā)生于基質(zhì)，壁平滑，帚狀枝雙輪生，偶有三輪生或單輪生；?；枯?-3個，13-20X3.2-3.7 μ m,彼此通常較緊貼；瓶梗幼齡時為瓶狀至披針狀，充分成熟時近圓柱形，梗頸明顯，分生孢子橢圓形，
4.5-5.5X3.0-4.0 μ m，壁平滑。該菌株26S rRNA基因序列遞交到GenBank數(shù)據(jù)庫，序列見 SEQ ID NO:1 (即 CCCGGGGGTATGCCTCAGTAACGGCGAGTGAGCGGCAAGAGCTCAAATTTGAAAGCTGGCTCCTTCGGGGTCCGCATTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGGAGCGGCCCCCATCTAAGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGAAAATCCCGTCTGGGATGGGGTGTCCGCGCCCGTGTGAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGT GGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATATTGGCCGGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGACTCGCCCACGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGCGGGCGGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCTCGGAATGTAACGCCCCCCGGGGCGTCTTATAGCCGAGGGTGCCATGCGGCCAGCCCAGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCATAATGGTCGTAAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCCAA)；該序列與Penicillium oxalicum 26S rRNA基因序列高度同源(99.3%),見圖4,命名為草酸青霉iPeni ci Ilium oxali cum ) BAM-1。
[0022]本發(fā)明所提供的有機(jī)覆蓋物分解菌株均在PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化與培養(yǎng)，具體活化與培養(yǎng)方法為:
菌株活化:配制PDA固體培養(yǎng)基，高壓滅菌，冷卻至50 °C左右，倒平板，冷卻后用粘菌株的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上劃線，用封口膜封好培養(yǎng)皿，倒置28 1:靜置培養(yǎng)3-5 d，每天觀察菌落生長發(fā)育情況，可重復(fù)復(fù)壯1-2次，整個接種與培養(yǎng)過程需在超凈工作臺中無菌條件下進(jìn)行。
[0023]菌株培養(yǎng):配制PDA液體培養(yǎng)基，并滅菌，冷卻后，用接種環(huán)從復(fù)壯菌落邊緣取直徑0.5 cm的生長旺盛且無污染的菌塊2-3塊，接種至PDA液體培養(yǎng)基中，120 r.mirT1搖瓶培養(yǎng)3-5 d,觀察菌落生長情況(搖瓶培養(yǎng)草酸青霉(Penicillium oxalicum) BAM-1生物量積累曲線見圖2)，整個接種與培養(yǎng)過程需在超凈工作臺中無菌條件下進(jìn)行。
[0024]該菌株的活化與培養(yǎng)分別采用固體和液體PDA培養(yǎng)基進(jìn)行。所述液體PDA培養(yǎng)基組分為:去皮馬鈴薯200 g(先用約500 ml蒸餾水煮沸15 min，棄去馬鈴薯并過濾)，葡萄糖20 g，加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05。向液體PDA培養(yǎng)基中加入18 g瓊脂即得到固體PDA培養(yǎng)基，其他組分相同。
[0025]實(shí)施例2:菌株濾紙酶活力
將草酸青霉(Penicillium oxali cum) BAM-1、綠色木霉、哈茨木霉接種于赫奇遜液體培養(yǎng)基(配方為:1 cmX6 cm 新華定量濾紙、KH2PO4 1.05g、NaCl 0.llg、MgSO4.7H20 0.29g,NaNO3 2.51 g,FeCl3 0.01gXaCl2 0.10g、水 1000 ml、pH值6.05)中，28。。下120 r.rnirT1搖瓶振蕩培養(yǎng)，結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)三菌株濾紙酶活力隨培養(yǎng)時間延長呈先升高而后降低變化趨勢，培養(yǎng)5 d時酶活力最高，分別為9.83 U、3.93 U、4.64 U，草酸青霉oxali cum) BAM-1濾紙酶活力是綠色木霉和哈茨木霉的2倍以上。
[0026]實(shí)施例3:菌株產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化
在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用4/力正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對含有不同濃度碳源(稻草?οg.L'15 g.L'25 g.L—1)、氮源(牛肉膏 1.5 g.L'2.0 g.L'2.5 g.L—1)與無機(jī)鹽(FeCl3
0.01 g.L'0.015 g.L'0.02 g g.!/1 及 KH2PO4 1.0 g.L'1.5 g.L'2.0 g.L-1)赫奇遜液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，見表1。菌株產(chǎn)酶的最優(yōu)培養(yǎng)基因素組合為:稻草25 g.!/1、牛肉膏2.5g.L'FeCl3 0.01 g.L'KH2P04 1.5 g.L'
[0027]表1 L9 (34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.尊窗管霉iPenicilliumBAM-1,保藏號為 CGMCC N0.8315。
2.如權(quán)利要求1所述的草酸青霉(arayicw?)BAM-1,其特征在于其分離純化方法包括以下步驟: 1)富集培養(yǎng):取土壤和腐爛有機(jī)覆蓋物樣品，在無菌水中振蕩分散后，取懸濁液接種于馬丁氏孟加拉紅富集培養(yǎng)基中，28 1:下120 PmirT1振蕩培養(yǎng)2 d，反復(fù)培養(yǎng)3次； 2)初篩:取第三次富集培養(yǎng)液，用玻璃涂布棒均勻涂布在剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基上，28 °C下培養(yǎng)，以在平板上出現(xiàn)透明水解圈的時間以及培養(yǎng)4-5 d后水解圈直徑與菌落直徑的比值大小為基準(zhǔn)，篩選水解圈出現(xiàn)早且直徑較大的菌株，將篩選出的菌株保存在PDA平板培養(yǎng)基上； 3)復(fù)篩:將初篩獲得的透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，用直徑I cm打孔器在菌落生長均勻處取菌塊接種到赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基中，28 °C下120 r.rniiT1振蕩培養(yǎng)5 d，測定發(fā)酵液濾紙酶活力，篩選出酶活力最高的菌株，測序，該菌株的26S rRNA基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如權(quán)利要求2所述的草酸青霉BAM-1,其特征在于:步驟O中所述的馬丁氏孟加拉紅富集培養(yǎng)基的配方為=KH2PO4 I g、MgSO4.7H20 0.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂20 g、孟加拉紅3.3 mg、鏈霉素30 μ g> H2O 1000 ml、自然pH值。
4.如權(quán)利要求2所述的草酸青霉(ora/icw?)BAM-1,其特征在于:步驟2)中所述的剛果紅纖維素平板培養(yǎng)基配方為=CMC-Na 2.1 g、剛果紅0.39 g、(NH4) SO4 2.1g> MgSO4.7Η20 0.5 g、K2HPO4 1.05 g、NaCl 0.5 g、瓊脂 18 g、H20 1000 ml、自然 pH 值。
5.如權(quán)利要求2所述的草酸青霉(ora/icw?)BAM-1,其特征在于:步驟3)中所述的赫奇遜液體復(fù)篩培養(yǎng)基配方為:稻草25 g、KH2PO4 1.05 g、NaCl 0.11 g、MgSO4.7Η20 0.29 g,NaNO3 2.51 g,FeCl3 0.01 g、CaCl2 0.10 g、H20 1000 ml、pH 值 6.05。
6.如權(quán)利要求1或2所述的草酸青霉οxaIicum、BAM-1,其特征在于其活化方法如下:配制PDA固體培養(yǎng)基，高壓滅菌，冷卻至50 °C，倒平板，冷卻后用粘有菌株的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基上劃線，用封口膜封好培養(yǎng)皿，倒置28 1:靜置培養(yǎng)3-5 d，可重復(fù)復(fù)壯1-2次，整個接種與培養(yǎng)過程在超凈工作臺中無菌條件下進(jìn)行；所述的PDA固體培養(yǎng)基的制作方法為:1)取去皮馬鈴薯200 g，切碎，加入500 ml蒸餾水煮沸15 min，過濾，得到馬鈴薯汁；2)在該馬鈴薯汁中加入葡萄糖20 g ;3)然后加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05，得到液體PDA液體培養(yǎng)基；4)向PDA液體培養(yǎng)基中加入18 g瓊脂，得到固體PDA培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求1或2所述的草酸青霉iPenicilliumοχ3^7----)ΒΑΜ-1,其特征在于其培養(yǎng)方法如下:配制PDA液體培養(yǎng)基，滅菌，冷卻后，用接種環(huán)從復(fù)壯菌落邊緣取直徑0.5 cm的生長旺盛且無污染的菌塊2-3塊，接種至PDA液體培養(yǎng)基中，120 r.min-Ι搖瓶培養(yǎng)3_5d，整個接種與培養(yǎng)過程在超凈工作臺中無菌條件下進(jìn)行；所述的PDA液體培養(yǎng)基的制作方法為:I)取去皮馬鈴薯200 g，切碎，加入500 ml蒸餾水煮沸15 min，過濾，得到馬鈴薯汁；2)在該馬鈴薯汁中加入葡萄糖20 g;3)然后加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05。
8.駕履"著霉(FeniciIIiumBAM-1在分解林地有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用。
9.草酸青霉在分解雷竹林有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用,其特征在于其應(yīng)用方法為:取用草酸青霉BAM-1發(fā)酵菌液,發(fā)酵菌液生物量為38.5 g干菌.L—1，菌液濾紙酶活力為8.65-10.91U，用量為60-90 kg.hm_2，按1:10稀釋后均勻噴灑于土壤表面，并淺鋤表層土壤，使發(fā)酵菌液與土及有機(jī)覆蓋物充分接觸；應(yīng)用季節(jié)為5-6月和9-10月，氣溫以30-35°C為宜，林地土壤體積水分率為50_60%。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的草酸青霉在分解雷竹林有機(jī)覆蓋物的應(yīng)用，其特征在于所述的發(fā)酵菌液的制備方法為:采用含1%食用油的改良PDA液體培養(yǎng)基，其組分為:去皮馬鈴薯220 g，葡萄糖21 g，食用油10ml，加水至1000 ml，調(diào)節(jié)pH值至6.05;28 °C下發(fā)酵3 d，溶氧量為73 %，攪拌子轉(zhuǎn)速為20 r.mirT1，消泡劑為非離子型改性聚硅氧 烷。
【文檔編號】C12N1/14GK103525710SQ201310497471
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月22日
【發(fā)明者】郭子武, 陳雙林, 李迎春, 楊清平 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所