一種鱗翅目幼蟲基因組dna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種提取鱗翅目幼蟲基因組DNA的有效方法，鱗翅目幼蟲細(xì)胞內(nèi)含有大量的蛋白質(zhì)，這是影響DNA純度的主要原因，本發(fā)明以鱗翅目幼蟲斜紋夜蛾為例，利用1％CTAB提取液以及飽和苯酚、氯仿、異戊醇混合液去除組織蛋白，其去除組織蛋白效果相對于單純用氯仿、異戊醇混合液去除組織蛋白的效果要好很多，因為在低溫條件下飽和苯酚與組織蛋白的結(jié)合使其變性的能力遠(yuǎn)高于氯仿/異戊醇；為了確保DNA的完整性和活性在操作過程中要求十分謹(jǐn)慎(搖晃樣品時不能太劇烈)，以及異丙醇高效沉淀DNA，最終較徹底去除雜質(zhì)，得到高純度的基因組DNA。
【專利說明】
一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因組DNA的提取是分子生物學(xué)實驗很重要的一個環(huán)節(jié)，基因組DNA的質(zhì)量和產(chǎn) 量，直接影響分子生物實驗中與DNA有關(guān)的后續(xù)實驗的進(jìn)行。
[0003] 鱗翅目包括蛾、蝶兩類昆蟲，屬有翅亞綱、全變態(tài)類。全世界已知約20萬種，中國已 知約8000余種，該目為昆蟲綱中僅次于鞘翅目的第2個大目，分布范圍極廣，以熱帶種類最 為豐富，絕大多數(shù)種類的幼蟲為害各類栽培植物，體形較大者常食盡葉片或鉆蛀枝干，體形 較小者往往卷葉、綴葉、結(jié)鞘、吐絲結(jié)網(wǎng)或鉆入植物組織取食為害，成蟲多以花蜜等作為補(bǔ) 充營養(yǎng)，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。
[0004] 針對鱗翅目昆蟲的研究在防治植物蟲害方面具有重要意義，但目前還沒有一種關(guān) 于提取鱗翅目幼蟲基因組DNA有效方法的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的旨在提供一種提取鱗翅目幼蟲基因組DNA的有效方法。
[0006] 本發(fā)明的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：
[0007] 步驟①:將鱗翅目幼蟲放入無菌研缽中，然后添加液氮將鱗翅目幼蟲研成粉末；
[0008] 步驟②:將所述步驟①中的粉末轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，并倒入提取液，混勻，之后 加入β-巰基乙醇，60~70°C水浴30~45分鐘，混勻，得到混合液I;
[0009] 步驟③:給所述步驟②中混合液I加入飽和苯酚、氯仿、異戊醇混合液，震蕩搖勻， 靜置，離心后取上清液到一支新的離心管中，然后加入核糖核酸酶，使?jié)舛冗_(dá)50ug/ml，然后 30~40 °C水浴20~40分鐘，得到混合液Π ;
[0010] 步驟④:將所述步驟③中混合液Π 離心后取上清液到新的離心管內(nèi)，加入飽和苯 酚、氯仿、異戊醇混合液，混勻，再次離心后取上清液至新的離心管，加入預(yù)冷異丙醇，混勻， 離心后棄上清液，得到混合液m;
[0011] 步驟⑤:將所述步驟④中的混合液m洗滌脫鹽，離心后棄上清液，得到鱗翅目幼蟲 基因組DNA，最后加無菌水溶解，保存。
[0012] 所述步驟②中提取液提取液為100ml，其是由以下物質(zhì)制成的：CTAB lg，NaCl 28ml，EDTA(0 · 5mo 1/L，PH 8 · 0)4ml，Tris-HCl (lmo 1 /L，PH 8 · 0) 10ml，β-巰基乙醇 lml，最后 加水定容至l〇〇ml。
[0013] 所述步驟②中加入提取液的比例為粉末:提取液=1:8(w/v)，所述步驟②中加入 β-巰基乙醇的量為36ul，水浴時溫度為65°C。
[0014] 所述步驟③和步驟④中加入苯酚、氯仿、異戊醇混合液時等體積加入苯酚:氯仿： 異戊醇= 25:24: l(v/v)的混合液。
[0015] 所述步驟③中靜置時間為10~15分鐘，所述步驟③、步驟④和步驟⑤中離心操作 為12000r/min離心10分鐘。
[0016]所述步驟③中水浴時溫度為37°C，水浴時間為30分鐘。
[0017]所述步驟⑤中洗滌脫鹽時用70 %乙醇。
[0018] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果：
[0019] 1、本發(fā)明提供的鱗翅目幼蟲基因組DNA提取方法試驗成本低、操作簡單。
[0020] 2、使用本發(fā)明的方法提取的鱗翅目幼蟲基因組DNA基因完整性好，純度高。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為不同方法提取基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0022] 圖2為不同方法提取斜紋夜蛾DNA得率平均值柱狀圖；
[0023] 圖3為A260/A280平均值柱狀圖；
[0024] 圖4為A260/A230平均值柱狀圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法做詳細(xì) 說明。
[0026] 實施例1:
[0027] 一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，包括以下步驟：
[0028]①:將低溫處理過的鱗翅目幼蟲放入5ml無菌研缽中，然后添加液氮將鱗翅目幼蟲 研成粉末；
[0029]②:將步驟①中的粉末轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，并按l:8(w/v)的比例倒入1%CTAB提 取液，充分混勻，之后加入36ιι1β-巰基乙醇，放入65°C水浴40分鐘，期間不時將離心管顛倒 混勻，得到混合液I;
[0030]③:給步驟②中混合液I按等體積加入飽和苯酸:氯仿：異戊醇=25:24:1 (v/v)的 混合液，震蕩搖勻，靜置10~15分鐘；12000r/min離心10分鐘后取上清液到一支新的離心管 中，然后加入核糖核酸酶，使?jié)舛冗_(dá)50ug/ml，然后37°C水浴30分鐘，得到混合液Π ;
[0031] ④:將步驟③中混合液Π 12000r/min離心10分鐘后取上清液到新的離心管內(nèi)，按 等體積加入飽和苯酸:氯仿：異戊醇=25:24:1 (v/v)的混合液，充分混勾，再次12000r/min 離心10分鐘后取上清液至新的離心管，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，混勻，12000r/min離心5 分鐘后棄上清液，得到混合液m;
[0032] ⑤:將步驟④中的混合液m用70%乙醇洗滌脫鹽，離心后棄上清液，得到鱗翅目幼 蟲基因組DNA，最后加適量無菌水溶解，-20 °C保存。
[0033] 本發(fā)明中 1%CTAB提取液的組成為：CTAB lg，NaCl 28ml，EDTA(0.5mol/L，PH 8.0) 4ml，Tris_HCl(lmol/L，PH 8.0)10ml，β-疏基乙醇lml，水定容至 100ml〇
[0034] 實施例2:
[0035] 四種基因組DNA提取方法的對比試驗：
[0036]本實驗以三齡的斜紋夜蛾為試驗材料，提取液濃度分別為1 % CTAB、2 % CTAB、1 % SDS和2%SDS;通過比較幾種DNA提取方法，總結(jié)出一種適用于大量提取鱗翅目幼蟲基因組 DNA的新方法，檢測結(jié)果表明，改良1%CTAB法完全適用于鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取，與 其他方法相比，具有實驗成本低，基因完整性好，純度高、操作簡單等優(yōu)點，為今后的基因文 庫構(gòu)建、基因克隆重組等分子生物學(xué)下游的研究實驗提供技術(shù)參考。
[0037] -、供試材料與試劑
[0038]供試材料:三齡的斜紋夜蛾幼蟲。
[0039]提取試劑:苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1);異丙醇；聚乙烯吡咯烷酮(PVP);無水乙 醇；Tris堿;十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）；十二烷 基磺酸(SDS);乙二胺四乙酸二鈉(EDTA);以上試劑均為分析純。
[0040] 1 %和2 % SDS提取液(100mL)的配制成分表
[0041]
[0042] 1%和2%CTAB提取液（100mL)的配制成分表
[0043]
[0045]二、試驗方法
[0046] a)基因組DNA的提取方法 [0047] SDS 提取法：
[0048] (1)稱取lg斜紋夜蛾放入遇冷的研磨中加液氮研碎，轉(zhuǎn)入5ml離心管中，分別入2ml 預(yù)熱的SDS提取液（SDS(1.4mol/L NaCl(W/V)，100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，1% PVP-40(W/V)))，同時加入1%B-巰乙醇，充分震蕩混勻，65°C水浴40~45min，不時輕輕震 蕩；
[0049] (2)取出離心管自然冷卻至室溫，按等體積加入苯酚：氯仿：異戊醇（25: 24:1)， 10000r/min，40C離心10min，取上清至另一離心管中；
[0050] (3)加入預(yù)冷(-20 °C )的1 · 5倍體積無水乙醇，置-20°C 30~60min，可見絮狀DNA沉 淀；
[0051 ] (4)挑出沉淀至1.5ml離心管中，70%乙醇洗滌2~3次，每次5min;再用無水乙醇洗 滌1~2次；
[0052] (5)自然干燥DNA，溶解于500ulTE(10mmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH8·0)中 ；
[0053] (6)加入濃度為lOmg/mlRNaseA 2uL降解RNA，37°C消化lh;
[0054] (7)重復(fù)步驟(2)1 次，加入 1/10體積5mol/L CH3C00NH4;
[0055] (8)重復(fù)步驟(3)和(4)1次；
[0056] (9)待DNA自然干燥后，溶解于100-300uLTE中，-20°C長期保存。
[0057] (10)干燥DNA，加適量無菌水溶解，-20°C保存?zhèn)溆?。采用DU800核酸分析儀和1%的 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量和片段大小，每個處理4次重復(fù)。
[0058] CTAB 提取法：
[0059] (1)將低溫處理過的斜紋夜蛾放入5ml的無菌研缽中，適當(dāng)添加液氮用力將斜紋夜 蛾研成粉末；
[0060] (2)迅速將研成粉末的斜紋夜蛾轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，并按l:8(w/v)的比例倒入 CTAB提取液，充分顛倒混勻；
[0061 ] (3)加入36ιι1β-巰基乙醇，迅速放入65°C水浴30min~45min，期間不時將離心管顛 倒混勻；
[0062] (4)按等體積加入飽和苯酚:氯仿：異戊醇=25:24:1 (v/v)混合液震蕩搖勻，靜置 10~15min，12000r/min 離心 10 分鐘；
[0063] (5)將上清液轉(zhuǎn)移到一支新的離心管中，加入處理過的Rnse，使終濃度達(dá)50ug/ml， 37°C 水浴 30min;
[0064] (6)12000r/min離心10分鐘后把上清液倒入新的離心管內(nèi)，之后，按等體積加入飽 和苯酸:氯仿:異戊醇= 25:24: l(v/v)混合液，充分混勾，12000r/min離心10分鐘；
[0065] (7)將上清液移至一新的離心管，加入2/3體積的預(yù)冷異丙醇，顛倒數(shù)次，12000r/ min離心5分鐘，棄上清液；
[0066] (8)用70 %乙醇洗滌脫鹽，離心棄上清液；
[0067] (9)干燥DNA加適量無菌水溶解，-20 °C保存?zhèn)溆谩２捎肈U800核酸分析儀和1 %的瓊 脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量和片段大小，每個處理4次重復(fù)。
[0068] b)RAPD反應(yīng)檢測
[0069]用隨機(jī)引物S66和S98對所提取得斜紋夜蛾基因組DNA進(jìn)行RAPD反應(yīng)。反應(yīng)體系為 (25μ1)：2.5μ1 10Xbuffer,2.Ommol · L,MgCl,160ymol · L dNTPs,0.74ymol · L primer, 20ng的基因組DNA，1.5U的Taq酶。反應(yīng)擴(kuò)增程序為:94 °C預(yù)變性5min，35個循環(huán)，每個循環(huán)包 括:94°C變性30s，36°C退火45s，72°C延伸2min，最后72°C終延伸lOmin。采用1%的瓊脂糖凝 膠電泳檢測擴(kuò)增效果，每個處理4次重復(fù)。
[0070]三、試驗結(jié)果
[0071 ] a)不同提取方法對斜紋夜蛾基因組DNA提取質(zhì)量的影響 [0072] (1)電泳檢測斜紋夜蛾DNA
[0073] 采用電泳檢測對不同方法提取的斜紋夜蛾基因組DNA進(jìn)行提取質(zhì)量比較，可知采 用1 % CTAB法、2 % CTAB法、1 % SDS法、2 % SDS法四種方法均能提取斜紋夜蛾DNA，如圖1所示， 泳道從左到右依次為 1 % CTAB、1 % CTAB、1 % CTAB、1 % CTAB、2 % CTAB、2 % CTAB、2 % CTAB、2 % CTAB、l%SDS、l%SDS、l%SDS、l%SDS、2%SDS、2%SDS、2%SDS、2%SDS，23kb 處都有主帶。
[0074] (2)紫外分光光度計檢測斜紋夜蛾DNA的曲線圖
[0075] 如圖2所示，從不同方法提取D N A的得率來看，1 % S D S法的D N A得率最高 (252.775即/111)，其次是1%0^法的0嫩得率（179.751^/111)，0嫩得率第三的是2%303法 (165 · 5ng/ul)，得率最低的是2 % CTAB法。
[0076] 如表1所列數(shù)據(jù)，用分光光度計檢測DNA的純度，較高純度DNA的A260/280比值范圍 應(yīng)在1.8-2.0之間。在A260比A280的值〈1.8時，DNA樣品中可能存在蛋白質(zhì)污染；當(dāng)A260/ A280>2.0時，DNA樣品中可能存在RNA污染。
[0077] 如圖3所示，四種提取方法的A260/A280的比值存在較大差異，1%CTAB法提取的 DNA，A260/A280的值等于1.8015，在1.8到2.0之間，在正常范圍之內(nèi)；2%0^法提取的0嫩， A260/A280的值是2.03725，大于2.0，說明2 % CTAB法提取的DNA中存在RNA污染；1 % SDS法提 取的DNA，A260/A280的值是1.909，在較高純度0嫩的六260/280比值范圍之內(nèi)；2%303法提取 得到的DNA，A260/A280的值是2.007，大于2.0，說明2 % CTAB法提取的DNA中存在RNA污染。 [0078] 表1不同提取方法基因組DNA測試結(jié)果
[0079]
[0080] 如圖4所示，A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，可對核酸樣品的純度進(jìn) 行評估，純的DNA的A260/A230比值為2.5，如果A260/A230比值小于2.0則說明核酸樣品被碳 水化合物、鹽類污染。由圖4可知，四種DNA提取方法中，A260/A230比值都大于2.0，說明核酸 樣品中未受到碳水化合物及鹽類的污染。
[0081 ] b)斜紋夜蛾DNA的RAro擴(kuò)增結(jié)果
[0082] 從隨機(jī)引物S66和S98對所提取得斜紋夜蛾基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到的結(jié)果 可知，用引物S66對四種提取方法提取的斜紋夜蛾基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)只有1%CTAB 法、2 % CTAB和2 % SDS法所提出的DNA能被擴(kuò)增出來，而1 % SDS所提取出的DNA未能被擴(kuò)增出 來，由于PCR擴(kuò)增對模板NDA的質(zhì)量要求較高，未能擴(kuò)增出來的NDA說明其質(zhì)量不夠好，從而 說明1 %SDS法提取的斜紋夜蛾幼蟲DNA質(zhì)量不好；用S98引物對所四種提取方法提取的斜紋 夜蛾基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)只有CTAB法所提出的DNA能被擴(kuò)增出來，說明CTAB法所提取 出來的斜紋夜蛾NDA完整性比SDS法更好。CTAB法提取的斜紋夜蛾幼蟲基因組DNA作為模板 可較好地用于PCR擴(kuò)增進(jìn)行RAH)分子標(biāo)記的分析。
[0083]四、試驗總結(jié)
[0084] 從不同方法提取DNA的得率來看，雖然1 % SDS法提取的DNA得率在四種提取方法中 最高，A260/A280的值是1.909在1.8-2.0，也在正常范圍之內(nèi)，但由于1 % SDS法提取的DNA不 能用于PCR擴(kuò)增，所以1 %SDS法不是最適宜提取斜紋夜蛾幼蟲DNA的方法。2%SDS法提取的 DNA得率在四種方法中居第三，雖然2 % SDS提取出的斜紋夜蛾幼蟲基因組DNA能用于PCR擴(kuò) 增，但該方法的A260/A280的值是2.007>2.0，不在正常范圍之內(nèi)，說明2%SDS法提取的DNA 中存在RNA污染，所以此方法不能用來提取斜紋夜蛾幼蟲DNA。1 % CTAB法和2 %CTAB法所提 取出的斜紋夜蛾幼蟲DNA均能用于PCR擴(kuò)增，但2 % CTAB法所提取出的斜紋夜蛾幼蟲DNA的 A260/A280的值是2.03725>2.0，說明2 % CTAB法提取的DNA中也存在RNA污染，此方法不能用 來提取斜紋夜蛾幼蟲DNA。綜上所述，1 %CTAB法是最適宜提取斜紋夜蛾幼蟲DNA的方法。
[0085] 本實驗通過4種不同的DNA提取方法的比較可知：改進(jìn)的1 % CTAB法最適合斜紋夜 蛾幼蟲DNA的提取。斜紋夜蛾細(xì)胞內(nèi)含有大量的蛋白質(zhì)，這是影響DNA純度的主要原因，1 % CTAB法利用1%CTAB提取液以及飽和苯酚:氯仿:異戊醇= 25:24:1混合液去除組織蛋白，其 去除組織蛋白效果相對于單純用氯仿：異戊醇= 24:1混合液去除組織蛋白的效果要好很 多，因為在低溫條件下飽和苯酚與組織蛋白的結(jié)合使其變性的能力遠(yuǎn)高于氯仿/異戊醇;為 了確保DNA的完整性和活性在操作過程中要求十分謹(jǐn)慎，搖晃樣品時不能太劇烈，以及異丙 醇高效沉淀DNA，最終較徹底去除雜質(zhì)，得到高純度的基因組DNA，而且通過重復(fù)實驗，得到 的DNA條帶電泳檢測結(jié)果以及PCR擴(kuò)增都較好，說明此方法較可靠、穩(wěn)定，綜上說明1%CTAB 法是一種適宜鱗翅目幼蟲基因組DNA提取的方法。
[0086] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟①:將鱗翅目幼蟲放入無菌研缽中，然后添加液氮將鱗翅目幼蟲研成粉末； 步驟②:將所述步驟①中的粉末轉(zhuǎn)移到無菌離心管中，并倒入提取液，混勻，之后加入 β-巰基乙醇，60~70°C水浴30~45分鐘，混勻，得到混合液I; 步驟③:給所述步驟②中混合液I加入飽和苯酚、氯仿、異戊醇混合液，震蕩搖勻，靜置， 離心后取上清液到一支新的離心管中，然后加入核糖核酸酶，使?jié)舛冗_(dá)50ug/ml，然后30~ 40 °C水浴20~40分鐘，得到混合液Π ; 步驟④:將所述步驟③中混合液Π 離心后取上清液到新的離心管內(nèi)，加入飽和苯酚、氯 仿、異戊醇混合液，混勻，再次離心后取上清液至新的離心管，加入預(yù)冷異丙醇，混勻，離心 后棄上清液，得到混合液m; 步驟⑤:將所述步驟④中的混合液m洗滌脫鹽，離心后棄上清液，得到鱗翅目幼蟲基因 組DNA，最后加無菌水溶解，保存。2. 如權(quán)利要求1所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟 ②中提取液提取液為1 〇〇ml，其是由以下物質(zhì)制成的：CTAB 1 g，NaCl 28ml，EDTA(0.5mo 1/L， PH 8.0)4ml，Tris_HCl(lmol/L，PH 8.0)10ml，β-疏基乙醇lml，最后加水定容至 100ml。3. 如權(quán)利要求2所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟 ② 中加入提取液的比例為粉末:提取液=1:8 (w/v )，所述步驟②中加入β-巰基乙醇的量為 36ul，水浴時溫度為65°C。4. 如權(quán)利要求3所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步驟 ③ 和步驟④中加入苯酚，氯仿，異戊醇混合液時等體積加入苯酚:氯仿：異戊醇=25 : 24:1 (v/v)的混合液。5. 如權(quán)利要求1或2所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步 驟③中靜置時間為10~15分鐘，所述步驟③、步驟④和步驟⑤中離心操作為12000r/min離 心10分鐘。6. 如權(quán)利要求1或2所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步 驟③中水浴時溫度為37 °C，水浴時間為30分鐘。7. 如權(quán)利要求1或2所述的一種鱗翅目幼蟲基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述步 驟⑤中洗滌脫鹽時用70 %乙醇。
【文檔編號】C12N15/10GK106086004SQ201610565959
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月18日
【發(fā)明人】劉佳妮, 余磊, 張瑜瑜, 徐勝光, 陳澤斌, 華金珠, 姚麗媛
【申請人】昆明學(xué)院