專利名稱：促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
在云南香蕉大量種植的今天，由于過量和不正確使用化肥、農(nóng)藥，使得土壤生態(tài)系統(tǒng)受到嚴(yán)重破壞，再加上經(jīng)濟利益的驅(qū)使重茬種植普遍盛行，更使得土壤生態(tài)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重難以修復(fù)。近些年在香蕉的種植中各種病蟲害增加，如根腐病、黃苗、葉斑病、枯萎病、黑星病以及根線蟲蟲害等，都是土壤生態(tài)系統(tǒng)遭受破壞的證明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑及其制備方法，是一種高密度、高活性的促生根、抗重茬香蕉土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑及制備方法。本發(fā)明采用細(xì)菌-真菌聯(lián)合、多菌種聯(lián)合的技術(shù)方法，以菌治菌，從修復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)入手，增加土壤中的有益菌，從而抑制那些容易感染植株病害的細(xì)菌和真菌，達(dá)到修復(fù)土壤生態(tài)系統(tǒng)，防止根腐病、枯萎病等重茬病，同時促進(jìn)根生長，松土壯苗，還具有降解農(nóng)藥、化肥殘留污染的作用。菌劑生產(chǎn)完成后有效活菌數(shù)(cfu)在20億以上即2-3X109cfu/g。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑，是將促生根、抗重茬香蕉土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑的生產(chǎn)菌種接種于含有碳源、氮源、無機鹽和水的滅菌培養(yǎng)基中在溫度為30-37°C、pH值為7. 4-7. 6的條件下進(jìn)行好氧發(fā)酵，分別經(jīng)一級擴大培養(yǎng)，將一級擴大培養(yǎng)液等質(zhì)量混合，再進(jìn)行二級、三級擴大培養(yǎng)，最后將發(fā)酵終產(chǎn)物吸附、固定化于載體上制成的菌劑，生產(chǎn)菌種選用枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌CGMCC1. 1061 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌 CGMCC1. 91 (Bacillus licheniformis)、貝雷絲酵母 CGMCC2. 1193(Trichosporon behrendii)、淡紫擬青霉 CGMCC3. 4034(Paecilomyces lilacinus)、細(xì)黃鏈霉菌 CGMCC4. 891 (Stre ptomyces microflavus)和多粘芽孢桿菌 CGMCC1. 1516(Paenibacillus polymyxa)。本發(fā)明上述的生產(chǎn)菌種均購于中國科學(xué)院微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。無毒、無害、無殘留。滅菌培養(yǎng)基以可溶性淀粉培養(yǎng)基(可溶性淀粉20. Og，硝酸鉀l.Og，磷酸氫二鉀 0. 5g，硫酸鎂0. 5g，氯化鈉0. 5g，硫酸亞鐵0. 01g，蒸餾水1000mL，pH值7. 2-7. 4)為基本培養(yǎng)基，其中碳源選用玉米粉或可溶性淀粉中的一種，氮源選用可溶性淀粉與硝酸鹽的混合或玉米粉與硝酸鹽的混合中的一種。滅菌培養(yǎng)基中還添加占培養(yǎng)基總質(zhì)量0. 5%的腐植酸。本發(fā)明的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑的制備方法包括下列工藝過程
A、將保存的各斜面菌種先用平板劃線法活化后，挑取單菌落，分別經(jīng)試管、三角瓶擴大培養(yǎng)制成一級種子(每株菌各300mL)；B、將A步驟中制備的一級種子進(jìn)行等質(zhì)量混配，對混配后的種子液進(jìn)行二級擴大
培養(yǎng)；C、將B步驟中制備的二級擴大培養(yǎng)液接于三級擴大培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為5% -10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行好氧發(fā)酵制成發(fā)酵終產(chǎn)物；D、將發(fā)酵終產(chǎn)物吸附、固定化于載體上；其中步驟B的發(fā)酵培養(yǎng)基采用可溶性淀粉培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉采用3%玉米粉替代，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入占培養(yǎng)基總質(zhì)量0.5%的腐殖酸；發(fā)酵過程中培養(yǎng)溫度為30-37°C、pH值為7. 4-7. 6、發(fā)酵時間為12_Mh、通風(fēng)量為8-10m3/h、攪拌轉(zhuǎn)速為 200-300r/mino所述的A步驟一級種子的制備過程中的培養(yǎng)基采用可溶性淀粉培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的 PH值為7. 4-7. 6 ；培養(yǎng)條件為溫度為30-37°C、發(fā)酵時間為12_24h，轉(zhuǎn)速為300r/min。所述的A步驟中的培養(yǎng)基的滅菌條件是壓力為0. IMpa,溫度為121°C、時間 30mino所述的B步驟中的二級擴大培養(yǎng)培養(yǎng)基采用可溶性淀粉培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉采用等質(zhì)量的玉米粉替代，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入占培養(yǎng)基總質(zhì)量0. 5 %的腐殖酸；發(fā)酵過程中培養(yǎng)溫度為30_37°C、pH值為7. 4-7. 6、發(fā)酵時間為12_Mh、通風(fēng)量為 8-10m3/h、攪拌轉(zhuǎn)速為 200-300r/min。為能給所培養(yǎng)的菌群提供一定的營養(yǎng)成分，增加保質(zhì)期，還由于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積，所以能在單位體積內(nèi)附著、吸附固定化較多的菌體。優(yōu)選的實施方案是， 所述的載體選用占發(fā)酵終產(chǎn)物總質(zhì)量4-5倍的草炭。為減少菌群的耗氧，增加保質(zhì)期，防止污染。優(yōu)選的實施方案是將吸附、固定化于草炭上制成的微生物菌劑密封包裝。其中更為優(yōu)選的技術(shù)方案是密封包裝是將微生物菌劑密封于內(nèi)襯聚乙烯的包裝袋內(nèi)。本發(fā)明中各個反應(yīng)步驟中培養(yǎng)基的滅菌采用常規(guī)滅菌方法，即壓力為0. IMpa，溫度為121°C，滅菌時間為30min。本發(fā)明所取得的實質(zhì)性特點和顯著的技術(shù)進(jìn)步在于1、在二級擴大培養(yǎng)時采用以3%玉米粉取代可溶性淀粉培養(yǎng)基中的可溶性淀粉， 對混合后的菌種實現(xiàn)擴大培養(yǎng)，大大降低了成本，縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用效率。2、經(jīng)檢測，將發(fā)酵終產(chǎn)物(復(fù)合菌)固定化于草炭上，每克菌制劑的有效菌菌落數(shù) (cfu)可高達(dá)20億以上(即2-3X109cfu/g)(常規(guī)的稀釋平板法)，至今還未見如此高含菌量菌制劑的報道。草炭不僅能為所培養(yǎng)菌提供一些營養(yǎng)成分，還由于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積，所以能在單位體積內(nèi)附著、吸附固定化較多的菌體。因此，一定量的有效菌菌劑一旦均勻加入根圍土壤中就可以很快形成優(yōu)勢菌群，發(fā)揮促生根、抗重茬、益生的作用。3、因土壤生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜，單一的菌或少量的菌是難以完成修復(fù)的。必須由細(xì)菌-真菌聯(lián)合、多種菌聯(lián)合，產(chǎn)生多種酶才能最終降解農(nóng)藥、化肥殘留污染，達(dá)到松土狀苗、 促根生長、抗重茬病的目的。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但不作為對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。實施例1促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑，是將微生物菌劑的生產(chǎn)菌種接種于含有碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，各菌種先經(jīng)一級擴大培養(yǎng)，然后等質(zhì)量混合，再經(jīng)二級、三級擴大培養(yǎng)，最后將發(fā)酵終產(chǎn)物吸附、固定化于載體上制成的微生物菌劑。所述的發(fā)酵過程是在溫度為30-37°C、pH值為7. 4-7. 6的條件下進(jìn)行的好氧發(fā)酵，生產(chǎn)菌種選用枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌CGMCC11061 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌 CGMCC1. 91 (Bacillus licheniformis)、貝雷絲酵母 CGMCC2. 1193 (Trichosporon behrendii)、淡紫擬青霉 CGMCC3. 4034(Paeeilomyces lilacinus)、細(xì)黃鏈霉菌 CGMCC4. 891 (Streptomyces microflavus)和多粘芽孢桿菌 CGMCC1. 1516 (Paen ibacillus polymyxa)，上述生產(chǎn)菌種均購于中國科學(xué)院微生物所菌種保藏中心(CGMCC)。本實施例中所涉及的具體的工藝步驟和工藝參數(shù)是無菌培養(yǎng)基以可溶性淀粉培養(yǎng)基(可溶性淀粉20. Og,硝酸鉀1. Og,磷酸氫二鉀0. 5g，硫酸鎂0. 5g，氯化鈉0. 5g，硫酸亞鐵0. Olg，蒸餾水1000mL，pH值7. 2-7. 4)為基本培養(yǎng)基，其中用3%玉米粉替代可溶性淀粉。無菌培養(yǎng)基中還添加占培養(yǎng)基總質(zhì)量0. 5%的腐植酸。所述的發(fā)酵過程包括下列工藝過程A、將保存的各斜面菌種先用平板劃線法活化后，挑取單菌落，分別經(jīng)試管、三角瓶擴大培養(yǎng)制成一級種子(每株菌各300mL)；B、將A步驟中制備的一級種子進(jìn)行等質(zhì)量混配，對混配后的種子液進(jìn)行二級擴大
培養(yǎng)；C、將B步驟中制備的二級擴大培養(yǎng)液接于三級擴大培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行好氧發(fā)酵制成發(fā)酵終產(chǎn)物，發(fā)酵終點用分光光度法測定吸光值最大或用血球板顯微計數(shù)法菌群數(shù)最大為發(fā)酵終點；D、將發(fā)酵終產(chǎn)物吸附、固定化于載體上；其中步驟B的發(fā)酵過程中培養(yǎng)溫度為35°C、pH值為7. 4，發(fā)酵時間15h，通風(fēng)量為 8m3/h、攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/min。，培養(yǎng)基的pH值為7. 4 ；所述的A、B、C步驟中的培養(yǎng)基的滅菌條件是壓力為0. IMPa、溫度為121°C、時間 30mino所述的載體選用占發(fā)酵終產(chǎn)物總質(zhì)量5倍的草炭，將發(fā)酵終產(chǎn)物-菌液直接噴灑、 攪拌于草炭上。將吸附、固定化于草炭上制成的微生物菌劑密封包裝于內(nèi)襯聚乙烯的包裝內(nèi)。室溫下，保質(zhì)期18個月。實施例2促生根抗重茬香蕉土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑，是將微生物菌劑的生產(chǎn)菌種接種于含有碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，所述的發(fā)酵過程是在溫度為30°C、PH值為7. 6的條件下進(jìn)行的好氧發(fā)酵，生產(chǎn)菌種選用枯草芽孢桿菌CGMCC11061 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌 CGMCC1. 91(Bacilluslich eniformis)、貝雷絲酵母 CGMCC2. 1193 (Trichosporon behrendii)、淡紫擬青霉 CGMCC3. 4034(Paecilomyces lilacinus)、細(xì)黃鏈霉菌 CGMCC4. 891 (Streptomyces microflavus)、和多粘芽孢桿菌 CGMCC1. 1516(Paenibacillus polymyxa)。本實施例中所涉及的具體的工藝步驟和工藝參數(shù)是無菌培養(yǎng)基以可溶性淀粉培養(yǎng)基(可溶性淀粉20. Og，硝酸鉀l.Og，磷酸氫二鉀 0. 5g，硫酸鎂0. 5g，氯化鈉0. 5g，硫酸亞鐵0. Olg，蒸餾水1000mL，pH值7. 2-7. 4)為基本培養(yǎng)基，其中選用3%玉米粉代替可溶性淀粉。無菌培養(yǎng)基中還添加占培養(yǎng)基總質(zhì)量0. 5%的腐植酸。所述的發(fā)酵過程包括下列工藝過程A、將保存的各斜面菌種先用平板劃線法活化后，挑取單菌落，分別經(jīng)試管、三角瓶擴大培養(yǎng)制成一級種子(每株菌各300mL)；B、將A步驟中制備的一級種子進(jìn)行等質(zhì)量混配，對混配后的種子液進(jìn)行二級擴大
培養(yǎng)；C、將B步驟中制備的擴大培養(yǎng)液接于三級擴大培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為 5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行好氧發(fā)酵制成發(fā)酵終產(chǎn)物，發(fā)酵終點用分光光度法測定吸光值最大或用血球板顯微計數(shù)法菌群數(shù)最大為發(fā)酵終點；D、將發(fā)酵終產(chǎn)物吸附、固定化于載體上；其中步驟B的發(fā)酵培養(yǎng)基采用可溶性淀粉培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉采用4%玉米粉替代，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入占培養(yǎng)基總質(zhì)量0. 5%的腐殖酸；發(fā)酵過程中培養(yǎng)溫度為30°C、pH值為7. 6、發(fā)酵時間為12h、通風(fēng)量為10m3/h、攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min。所述的A步驟一級種子的制備過程中的培養(yǎng)基采用可溶性淀粉培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的 PH值為7. 6 ；培養(yǎng)條件為溫度為30°C、發(fā)酵時間為12h，轉(zhuǎn)速為300r/min。所述的A、B、C步驟中的培養(yǎng)基的滅菌條件是壓力為0. IMpa、溫度為121°C、時間 30mino所述的載體選用占發(fā)酵終產(chǎn)物總質(zhì)量4倍的草炭，將發(fā)酵終產(chǎn)物-菌液直接噴灑、 攪拌于草炭上。將吸附、固定化于草炭上制成的微生物菌劑密封于內(nèi)襯聚乙烯的包裝袋內(nèi)。室溫下，保質(zhì)期18個月。
權(quán)利要求
1.一種促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑及其制備方法，其特征在于 該微生物菌劑是將生產(chǎn)菌種接種于含有碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養(yǎng)基中在溫度為 30-37°C、pH值為7. 4-7. 6的條件下進(jìn)行好氧發(fā)酵，分別經(jīng)一級擴大培養(yǎng)，將一級擴大培養(yǎng)液等質(zhì)量混合，再進(jìn)行二級、三級擴大培養(yǎng)，最后將發(fā)酵終產(chǎn)物吸附、固定化于載體上制成的微生物發(fā)酵菌劑，生產(chǎn)菌種選用枯草芽孢桿菌CGMCC1. 1061 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌 CGMCC1. 91 (Bacillus licheniformis)、貝雷絲酵母 CGMCC2. 1193 (Trichosporon behrendii)、淡紫擬青霉 CGMCC3. 4034(Paecilomyces lilacinus)、細(xì)黃鏈霉菌 CGMCC4. 891 (Streptomyces microflavus)和多粘芽孢桿菌 CGMCC1. 1516 (Paenibacillus polymyxa)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑，其特征在于所述的無菌培養(yǎng)基以可溶性淀粉培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，可溶性淀粉培養(yǎng)基的配方為 可溶性淀粉20. Og,硝酸鉀1. Og,磷酸氫二鉀0. 5g，硫酸鎂0. 5g，氯化鈉0. 5g，硫酸亞鐵 0. Olg，蒸餾水1000mL，pH值7. 2-7. 4，其中碳源選用玉米粉或可溶性淀粉中的一種，氮源選用可溶性淀粉與硝酸鹽的混合或玉米粉與硝酸鹽的混合中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑，其特征在于所述的無菌培養(yǎng)基中還添加占培養(yǎng)基總質(zhì)量0. 5%的腐植酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑的制備方法，其特征在于包括下列工藝過程A、將保存的斜面菌種先用平板劃線法活化后，挑取單菌落，分別經(jīng)試管、三角瓶擴大培養(yǎng)制成一級種子液(每株菌各300-400mL)；B、將A步驟中制備的一級種子液進(jìn)行等質(zhì)量混配，對混配后的種子液進(jìn)行二級擴大培養(yǎng)；C、將B步驟中制備的二級擴大培養(yǎng)液接于三級擴大培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為 5%-10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行好氧發(fā)酵制成發(fā)酵終產(chǎn)物，發(fā)酵終點用分光光度法測定吸光值最大或用血球板顯微計數(shù)法菌群數(shù)最大為發(fā)酵終點；D、將發(fā)酵終產(chǎn)物吸附、固定化于載體上；其中步驟B的發(fā)酵培養(yǎng)基采用可溶性淀粉培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉采用 3%玉米粉替代，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入占培養(yǎng)基總質(zhì)量0. 5%的腐植酸；發(fā)酵過程中培養(yǎng)溫度為30-37 °C、pH值7. 4-7. 8、發(fā)酵時間12_Mh，通風(fēng)量為8-10m3/h、攪拌轉(zhuǎn)速為200-300"mirio
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑的制備方法，其特征在于所述的A步驟一級種子的制備過程中的培養(yǎng)基采用可溶性淀粉培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的PH值7. 4-7. 8 ；培養(yǎng)條件為溫度為30-37°C、發(fā)酵時間12_Mh，轉(zhuǎn)速為200-300"mirio
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑的制備方法，其特征在于所述的A、B、C步驟中的培養(yǎng)基的滅菌條件是壓力為0. IMpa、溫度為 121 "C、時間 30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑的制備方法，其特征在于所述的B步驟中的二級擴大培養(yǎng)培養(yǎng)基采用可溶性淀粉培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基中的可溶性淀粉采用3%玉米粉替代，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入占培養(yǎng)基總質(zhì)量0.5%的腐植酸；發(fā)酵過程中培養(yǎng)溫度為30-37°C、pH值為7. 4-7. 8、發(fā)酵時間12_24h，通風(fēng)量為8-lOm3/ h、攪拌轉(zhuǎn)速為200-300r/min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑，其特征在于所述的載體選用占發(fā)酵終產(chǎn)物總質(zhì)量4-5倍的草炭，將發(fā)酵終產(chǎn)物-菌液直接噴灑、攪拌于載體草炭上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的促生根抗重茬香蕉種植土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑，其特征在于將吸附、固定化于草炭上制成的微生物發(fā)酵菌劑密封于內(nèi)襯聚乙烯的包裝袋內(nèi)，室溫下，保質(zhì)期18個月。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種促生根抗重茬香蕉土壤生態(tài)修復(fù)微生物菌劑及其制備方法，該微生物菌劑是將生產(chǎn)菌種接種于含有碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養(yǎng)基中在溫度為30-37℃、pH值7.4-7.6的條件下進(jìn)行好氧發(fā)酵，分別經(jīng)一級擴大培養(yǎng)，將一級擴大培養(yǎng)液等質(zhì)量混合，再進(jìn)行二級、三級擴大培養(yǎng)，最后將發(fā)酵終產(chǎn)物吸附、固定化于載體上制成的菌劑，生產(chǎn)菌種選用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、貝雷絲酵母、淡紫擬青霉、細(xì)黃鏈霉菌、和多粘芽孢桿菌。本發(fā)明的微生物菌劑可有效防止在香蕉種植過程中的死苗、黃苗、枯萎、葉斑、根腐等土壤生態(tài)病狀，生產(chǎn)成本低、發(fā)酵周期短、菌群密度高，還能促進(jìn)根生長、松土壯苗，解除農(nóng)藥、化肥殘留污染，具有土壤生態(tài)修復(fù)作用。
文檔編號C09K17/40GK102210332SQ20111009587
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月17日
發(fā)明者布國偉, 張清敏, 張瑩捷, 趙嵐, 趙穎 申請人:趙穎