識別微絲菌用熒光探針的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種識別微絲菌用熒光探針的制備方法,該方法先采用鹵代長碳鏈化合物對咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的4-甲基吡啶部分進行修飾,而后再與3-甲?;?N-乙基咔唑反應合成具有長疏水鏈的熒光探針。本發(fā)明效果為,該探針制備過程中將咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的制備和修飾同步化,制備方法簡單,制得的熒光探針背景干擾小,熒光強度高,熒光性質穩(wěn)定。利用微絲菌具有疏水表面這一特性,本申請中所制備的具有長疏水鏈的熒光探針可與其結合,從而達到熒光識別微絲菌的目的。
【專利說明】識別微絲菌用熒光探針的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于用于污水處理領域中微生物檢測用熒光探針的制備方法,具體涉及一種鹵代長碳鏈化合物修飾咔唑吡啶苯乙烯類菁染料得到識別微絲菌用熒光探針的制備方法。
【背景技術】
[0002]自活性污泥法誕生一個多世紀以來,污泥膨脹問題就一直是困擾污水處理廠正常運行的一個世界性難題?;钚晕勰嗯蛎浻山z狀菌過度生長引起的絲狀膨脹和非絲狀膨脹,其中前者占主導,據報道約有90%的污泥膨脹問題是由活性污泥中絲狀菌的大量生長而引起的。人們對絲狀膨脹及其關鍵菌群的研究集中在2個方面:一是引發(fā)絲狀膨脹的關鍵菌群本身的研究,包括其分離鑒定、生理生態(tài)特性、以及污泥體系中相關絲狀菌群的識別與定量表征等等;其二是從工藝操作角度探討工藝操作條件對絲狀菌群的影響,尋求控制污泥膨脹的對策。
[0003]微絲菌是污泥起泡和膨脹過程中最常見的一種絲狀菌,特別是涉及營養(yǎng)物去除的污水處理系統中,因而對這類絲狀菌進行鑒別研究,對污泥膨脹現象的預警和控制具有重要意義。傳統鑒別方法主要是根據微絲菌的形態(tài)學特征和染色反應狀態(tài)來進行。但由于微絲菌較難分離和純培養(yǎng),人們對其代謝和生理生態(tài)特性了解較少。近年來,隨著PCR、核酸測序等相關分子生物學技術的迅速發(fā)展,采用突光原位雜交(fluorescence in situhybridization, FISH)技術對微絲菌進行鑒別,避免了傳統的方法進行鑒定和計數的局限性,且測定過程中細胞形態(tài)不被破壞,能夠真實反映自然環(huán)境下微生物的情況及分布等特點。但是,FISH只能對已知核酸序列的微生物進行標識,且FISH方法存在細胞穿透率較低、低rRNA含量以及存在微生物自身熒光的影響和熒光褪色等缺點。
[0004]J.L.Nielsen等人采用熒光微球法對微絲菌進行檢測,發(fā)現微絲菌表面具有一定的疏水性。利用它的這一特性,本申請中采用長碳鏈化合物對熒光染料進行修飾,構建一種具有長疏水鏈的熒光探針,使其與微絲菌結合,從而達到熒光識別微絲菌的目的。
【發(fā)明內容】
[0005]本發(fā)明目的是提供一種識別微絲菌用熒光探針的制備方法,利用鹵代長碳鏈化合物對熒光染料進行修飾,使制得的熒光探針具有長疏水鏈,能與具有疏水表面的微絲菌結合,從而達到識別微絲菌的目的。
[0006]為實現上述目的,本發(fā)明采用的技術方案是提供一種識別微絲菌用熒光探針的制備方法,該方法是采取將咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的合成和修飾同步化的合成路線,先引入鹵代長碳鏈化合物對其4-甲基吡啶部分進行修飾,而后再與3-甲?;?N-乙基咔唑部分反應,制得具有長疏水鏈的熒光探針,包括以下步驟:
[0007](I)長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽的合成
[0008]在圓底燒瓶中分別加入0.8-1.5份4-甲基吡啶,0.7-1.3份鹵代長碳鏈化合物及28份甲苯,磁力攪拌充分溶解進行反應,反應溫度為120°C,待反應完成后,冷卻至室溫,去除上層甲苯得到油狀物,并用正己烷洗滌,最后將洗滌完的油狀物在旋轉蒸發(fā)儀中進行減壓蒸餾,得到長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽;
[0009](2) 3-甲?;?N-乙基咔唑的合成
[0010]在圓底燒瓶中加入三氯氧磷20份,在冰水浴冷卻攪拌條件下,向圓底燒瓶中依次滴加DMF19-22份,65份含3-3.5份N-乙基咔唑的1,2- 二氯乙烷溶液,滴畢,回流反應8h,反應液冷卻至室溫,并倒入冰水中,攪拌,用二氯甲烷萃取,在旋轉蒸發(fā)儀中進行減壓蒸餾后,經柱層析分離得3-甲?;?N-乙基咔唑;
[0011](3)熒光探針的合成
[0012]將步驟(1)中制備的長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽溶于70份無水乙醇中,并加入0.9-1.3份步驟(2)中制備的3-甲?;?N-乙基咔唑,滴加3-5滴哌啶,回流反應12h,得到紅色溶液,反應液濃縮后,加入乙醚析出沉淀,抽濾,制得濾餅,將濾餅在甲醇中重新結晶,得具有長疏水鏈的熒光探針。
[0013]本發(fā)明的效果為:
[0014](I)所制備的熒光探針,是在咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的合成路線中,先引入鹵代長碳鏈化合物對其4-甲基吡啶部分進行修飾,而后再與3-甲酰基-N-乙基咔唑部分反應,從而制備得到鹵代長碳鏈修飾的熒光探針,這一制備方法實現了咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的合成和修飾的同步化,且該制備方法簡單,制得的熒光探針背景干擾小,熒光強度高,熒光性質穩(wěn)定。
[0015](2)鹵代長碳鏈化合物的修飾使得制備的熒光探針具有長疏水鏈,能與具有疏水表面的微絲菌結合,從而達到熒光識別微絲菌的目的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為本發(fā)明熒光探針與微絲菌熒光下作用關系的鏡檢圖;
[0017]圖2為本發(fā)明熒光探針與微絲菌自然光下作用關系的鏡檢圖。
【具體實施方式】
[0018]結合實例對本發(fā)明的識別微絲菌用熒光探針的制備方法加以說明。
[0019]本發(fā)明的識別微絲菌用熒光探針的制備方法,實現了熒光染料的制備和修飾同步化,是在咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的合成路線中,先引入鹵代長碳鏈化合物對其4-甲基吡啶部分進行修飾,而后再與3-甲?;?N-乙基咔唑部分反應,制得具有長疏水鏈的熒光探針,這一過程主要包括以下步驟:
[0020](I)長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽的合成
[0021]在圓底燒瓶中分別加入0.8-1.5份4-甲基吡唆,0.7-1.3份鹵代長碳鏈化合物及28份甲苯,磁力攪拌充分溶解進行反應,反應溫度為120°C,待反應完成后,冷卻至室溫,去除上層甲苯得到油狀物,并用正己烷洗滌,最后將洗滌完的油狀物在旋轉蒸發(fā)儀中進行減壓蒸餾,得到長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽;
[0022](2) 3-甲?;?N-乙基咔唑的合成
[0023]在圓底燒瓶中加入三氯氧磷20份,在冰水浴冷卻攪拌條件下,向圓底燒瓶中依次滴加DMF19-22份,65份含3-3.5份N-乙基咔唑的1,2- 二氯乙烷溶液,滴畢,回流反應8h,反應液冷卻至室溫,并倒入冰水中,攪拌,用二氯甲烷萃取,在旋轉蒸發(fā)儀中進行減壓蒸餾后,經柱層析分離得3-甲?;?N-乙基咔唑;
[0024](3)熒光探針的合成
[0025]將步驟(1)中制備的長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽溶于70份無水乙醇中,并加入0.9-1.3份步驟(2)中制備的3-甲?;?N-乙基咔唑,滴加3-5滴哌啶,回流反應12h,得到紅色溶液,反應液濃縮后,加入乙醚析出沉淀,抽濾,制得濾餅,將濾餅在甲醇中重新結晶,得具有長疏水鏈的熒光探針。
[0026]所制得的具有長疏水鏈的熒光探針與微絲菌的作用過程如下:取制得的熒光探針配置成探針溶液,而后用含微絲菌的細菌溶液對探針溶液進行稀釋,將稀釋后的探針溶液滴加至載玻片上,采用熒光倒置顯微鏡分別在熒光和自然光條件下進行對比觀察,分別如圖1和圖2所示。對比可以看出,圖1中微絲菌菌絲的亮度明顯強于圖2,說明本申請所制得的具有長疏水鏈的熒光探針可很好地識別微絲菌。
[0027]所述鹵代長碳鏈化合物為1-溴十二烷,1-溴十四烷,1-溴十六烷,1-溴十八烷,1-碘十二燒,1-碘十六燒或1-碘十八燒。
[0028]實施例:
[0029]實施例1
[0030]在圓底燒瓶中分別加入0.4650g4-甲基吡唆,1.5268gl_溴十六烷及15mL甲苯,磁力攪拌充分溶解,120°C回流,反應完成后,冷卻至室溫,去除上層甲苯,用正己烷洗滌剩余黃色油狀物三次,將洗滌后的產物在旋轉蒸發(fā)儀中減壓蒸餾去除溶劑得到1-十六烷基-4-甲基吡啶溴化鹽,產率91.5%。在圓底燒瓶中加入9.5mL三氯氧磷,冰水浴冷卻攪拌下,滴加7.7mL DMF,滴畢,于室溫攪拌30min,緩慢滴加16ml含有3.15g N-乙基咔唑的1,2-二氯乙烷溶液,滴畢,回流反應8h。反應完成后冷卻至室溫后,將反應液倒入冰水中攪拌lh,用二氯甲烷萃取冰水溶液,再用P205干燥含有產物的二氯甲烷溶液,之后減壓蒸餾去除二氯甲烷,產物經柱層析分離得3-甲?;?N-乙基咔唑。在得到的1-十六烷基-4-甲基吡啶溴化鹽的反應瓶中,加入1.1155g3-甲酰基-N-乙基咔唑,無水乙醇20.0OmL,滴加3滴哌啶,回流反應12h得紅色溶液,反應液濃縮后,加乙醚析出固體,抽濾,濾餅于甲醇中重結晶,得到所需的熒光探針,產率49.6%。對熒光探針進行光譜檢測,測得熒光探針最大激發(fā)波長為435nm,發(fā)射波長為574nm。
[0031]稱取制備的1-溴十六烷修飾的熒光探針30.lmg,將其溶解于50mL乙醇中,配制成濃度為lmmol/L的探針溶液,采用細菌溶液對其進行稀釋從而配置成濃度為0.01Ommol/L的探針溶液,采用熒光倒置顯微鏡分別在自然光和熒光條件下進行對比觀察,可以明顯看出,在熒光條件下進行檢測,可觀察到光亮的微絲菌菌絲,且明顯區(qū)別于菌膠團,如圖1所示。而在自然光條件下進行檢測,微絲菌菌絲不顯示亮度且不易區(qū)別于菌膠團,如圖2所示。對比說明,本申請制備的熒光探針可與微絲菌結合,從而達到識別微絲菌的目的。
[0032]實施例2
[0033]在圓底燒瓶中分別加入0.6985g4-甲基吡唆,1.8023gl_溴十四烷及15mL甲苯,磁力攪拌充分溶解,120°C回流,反應完成后,冷卻至室溫,去除上層甲苯,用正己烷洗滌剩余黃色油狀物三次,將洗滌后的產物在旋轉蒸發(fā)儀中減壓蒸餾去除溶劑得到1-十四烷基-4-甲基吡啶溴化鹽,產率92.7%。在圓底燒瓶中加入9.5mL三氯氧磷,冰水浴冷卻攪拌下,滴加8.9mLDMF,滴畢,于室溫攪拌30min,緩慢滴加25ml含有3.445g N-乙基咔唑的1,2-二氯乙烷溶液,滴畢,回流反應8h。反應完成后冷卻至室溫后,將反應液倒入冰水中攪拌lh,用二氯甲烷萃取冰水溶液,再用P205干燥含有產物的二氯甲烷溶液,之后減壓蒸餾去除二氯甲烷,產物經柱層析分離得3-甲?;?N-乙基咔唑。在得到的1-十四烷基-4-甲基吡啶溴化鹽的反應瓶中,加入1.45g3-甲酰基-N-乙基咔唑,無水乙醇20.0OmL,滴加5滴哌啶,回流反應12h得紅色溶液,反應液濃縮后,加乙醚析出沉淀,抽濾,濾餅于甲醇中重結晶,得到所需的熒光探針,產率31 %。對熒光探針進行光譜檢測,測得熒光探針最大激發(fā)波長為438nm,發(fā)射波長為572nm。如實施例1中一樣,將所制得的熒光探針配置成濃度為
0.015mmol/L的探針溶液,采用倒置顯微鏡進行觀察,在熒光條件下可觀察到明亮的微絲菌菌絲,所制備探針可識別微絲菌。
[0034]實施例3
[0035]在圓底燒瓶中分別加入0.3725g4-甲基吡啶,0.8723gl_溴十二烷及15mL甲苯,磁力攪拌充分溶解,120°C回流,反應完成后,冷卻至室溫,去除上層甲苯,用正己烷洗滌剩余黃色油狀物三次,將洗滌后的產物在旋轉蒸發(fā)儀中減壓蒸餾去除溶劑得到1-十二烷基-4-甲基吡啶溴化鹽,產率94%。在圓底燒瓶中加入9.5mL三氯氧磷,冰水浴冷卻攪拌下,滴加7.32mL DMF,滴畢,于室溫攪拌30min,緩慢滴加25mL含有2.953g N-乙基咔唑的1,2-二氯乙烷溶液,滴畢,回流反應8h。反應完成后冷卻至室溫后,將反應液倒入冰水中攪拌lh,用二氯甲烷萃取冰水溶液,再用P205干燥含有產物的二氯甲烷溶液,之后減壓蒸餾去除二氯甲烷,產物經柱層析分離得3-甲?;?N-乙基咔唑。在得到的1-十六烷基-4-甲基吡啶溴化鹽的反應瓶中,加入1.004g3-甲?;?N-乙基咔唑,無水乙醇20.0OmL,滴加3滴哌啶,回流反應12h得紅色溶液,反應液濃縮后,加乙醚析出沉淀,抽濾,濾餅于甲醇中重結晶,得到所需的熒光探針,產率30.7%。對熒光探針進行光譜檢測,測得熒光探針最大激發(fā)波長為440nm,發(fā)射波長為566nm。如實施例1中一樣,將所制得的突光探針配置成濃度為
0.020 mmol/L的探針溶液,采用倒置顯微鏡進行觀察,在熒光條件下可觀察到明亮的微絲菌菌絲,所制備探針可識別微絲菌。
[0036]實施例4
[0037]將上述實施例1中的0.5268gl-溴十六烷換成1.667gl_溴十八烷,得到1_十八烷基-4-甲基吡啶溴化鹽,產率89.9%。其它操作均按實施例3中步驟,不作調整,最終得到十八烷基鏈修飾的咔唑吡啶苯乙烯類菁染料熒光探針。對熒光探針進行光譜檢測,測得熒光探針最大激發(fā)波長為435nm,發(fā)射波長為577nm。如實施例1中一樣,將所制得的熒光探針配置成濃度為0.006mmol/L的探針溶液,采用倒置顯微鏡進行觀察,在熒光條件下可觀察到明亮的微絲菌菌絲,所制備探針可識別微絲菌。
[0038]實施例5
[0039]將上述實施例1中的0.5268gl_溴十六烷換成1.4812gl_碘十二烷,得到1_十二烷基-4-甲基吡啶碘化鹽。其它操作均按實施例3中步驟,不作調整,最終得到十二烷基鏈修飾的咔唑吡啶苯乙烯類菁染料熒光探針。對熒光探針進行光譜檢測,測得熒光探針最大激發(fā)波長為441nm,發(fā)射波長為565nm。如實施例1中一樣,將所制得的熒光探針配置成濃度為0.020mmol/L的探針溶液,采用倒置顯微鏡進行觀察,在熒光條件下可觀察到明亮的微絲菌菌絲,所制備探針可識別微絲菌。
[0040]實施例6
[0041]將上述實施例1中的0.5268gl_溴十六烷換成1.7617gl_碘十六烷,得到1_十六烷基-4-甲基吡啶碘化鹽。其它操作均按實施例3中步驟,不作調整,最終得到十六烷基鏈修飾的咔唑吡啶苯乙烯類菁染料熒光探針。對熒光探針進行光譜檢測,測得熒光探針最大激發(fā)波長為436nm,發(fā)射波長為574nm。如實施例1中一樣,將所制得的熒光探針配置成濃度為0.01Ommol/L的探針溶液,采用倒置顯微鏡進行觀察,在熒光條件下可觀察到明亮的微絲菌菌絲,所制備探針可識別微絲菌。
[0042]實施例7
[0043]將上述實施例1中的0.5268gl-溴十六烷換成1.902gl_碘十八烷,得到1_十八烷基-4-甲基吡啶碘化鹽。其它操作均按實施例3中步驟,不作調整,最終得到十八烷基鏈修飾的咔唑吡啶苯乙烯類菁染料熒光探針。對熒光探針進行光譜檢測,測得熒光探針最大激發(fā)波長為443nm,發(fā)射波長為578nm。如實施例1中一樣,將所制得的熒光探針配置成濃度為0.006mmol/L的探針溶液,采用倒置顯微鏡進行觀察,在熒光條件下可觀察到明亮的微絲菌菌絲,所制備探針可識別微絲菌。
【權利要求】
1.一種識別微絲菌用熒光探針的制備方法,該方法是采取將咔唑吡啶苯乙烯類菁染料的合成和修飾同步化的合成路線,先引入鹵代長碳鏈化合物對其4-甲基吡啶部分進行修飾,而后再與3-甲?;?N-乙基咔唑部分反應,制得具有長疏水鏈的熒光探針,包括以下步驟: (1)長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽的合成 在圓底燒瓶中分別加入0.8-1.5份4-甲基吡啶,0.7-1.3份鹵代長碳鏈化合物及28份甲苯,磁力攪拌充分溶解進行反應,反應溫度為120°C,待反應完成后,冷卻至室溫,去除上層甲苯得到油狀物,并用正己烷洗滌,最后將洗滌完的油狀物在旋轉蒸發(fā)儀中進行減壓蒸餾,得到長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽; (2)3-甲?;?N-乙基咔唑的合成 在圓底燒瓶中加入三氯氧磷20份,在冰水浴冷卻攪拌條件下,向圓底燒瓶中依次滴加DMF19-22份,65份含3-3.5份N-乙基咔唑的1,2- 二氯乙烷溶液,滴畢,回流反應8h,反應液冷卻至室溫,并倒入冰水中,攪拌,用二氯甲烷萃取,在旋轉蒸發(fā)儀中進行減壓蒸餾后,經柱層析分離得3-甲?;?N-乙基咔唑; (3)突光探針的合成 將步驟(1)中制備的長鏈烷基-4-甲基吡啶鹵化鹽溶于70份無水乙醇中,并加入0.9-1.3份步驟(2)中制備的3-甲?;?N-乙基咔唑,滴加3-5滴哌啶,回流反應12h,得到紅色溶液,反應液濃縮后,加入乙醚析出沉淀,抽濾,制得濾餅,將濾餅在甲醇中重新結晶,得具有長疏水鏈的熒光 探針。
2.根據權利要求1所述識別微絲菌用熒光探針的制備方法,其特征是:所述鹵代長碳鏈化合物為1-溴十二烷或1-溴十四烷或1-溴十六烷或1-溴十八烷或1-碘十二烷或1-碘十六烷或1-碘十八烷。
【文檔編號】C09K11/06GK104017570SQ201410225878
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年5月26日 優(yōu)先權日:2014年5月26日
【發(fā)明者】費學寧, 朱慧芳, 馬華繼, 郝亞超, 曹凌云, 谷迎春 申請人:天津城建大學