本發(fā)明屬于分析化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于檢測純水相介質(zhì)和細(xì)胞及斑馬魚活體內(nèi)汞離子的近紅外單硫代方酸染料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

發(fā)達(dá)的工業(yè)在給人類生活帶來各種便利的同時(shí)，其副產(chǎn)物工業(yè)垃圾又在很大程度上破壞著生態(tài)環(huán)境的和諧和人類的身心健康。頻發(fā)的安全事件使得科學(xué)界開始致力于各種污染物的研究，其中汞污染由于其強(qiáng)大的危害性成了污染界的污染明星和科研界主要研究對(duì)象之一。各種自然和人為因素，包括海洋和火山噴發(fā)、固體廢棄物的焚燒、金礦開采、礦物燃料的燃燒等，導(dǎo)致了環(huán)境中汞污染的廣泛存在。無機(jī)汞一旦循環(huán)至海洋環(huán)境中，會(huì)被細(xì)菌轉(zhuǎn)化為甲基汞進(jìn)入到生物體內(nèi)（nolan,e.m.;lippard,s.j.a"turn-on"fluorescentsensorfortheselectivedetectionofmercuricioninaqueousmedia.j.am.chem.soc.2003,125(47),14270-14271.）。由于汞污染的長期性和富集性，存留在生物體內(nèi)的汞會(huì)造成一些神經(jīng)中毒性疾病，如產(chǎn)前腦損傷，各種認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)失常以及水俁病等（tchounwou,p.b.;ayensu,w.k.;ninashvili,n.;sutton,d.environmentalexposuretomercuryanditstoxicopathologicimplicationsforpublichealth.environ.toxicol.2003,18(3),149-175.kim,h.n.;ren,w.x.;kim,j.s.;yoon,j.fluorescentandcolorimetricsensorsfordetectionoflead,cadmium,andmercuryions.chem.soc.rev.2012,41(8),3210-3244.）。因此，hg²⁺的檢測對(duì)于環(huán)境保護(hù)和人類健康具有極其重要的意義。

目前，已有的hg²⁺分析方法有多種，如電感耦合等離子體質(zhì)譜法（karunasagar,d.;arunachalam,j.;gangadharan,s.developmentofa‘collectandpunch’coldvapourinductivelycoupledplasmamassspectrometricmethodforthedirectdeterminationofmercuryatnanogramsperlitrelevels.anal.at.spectrom.1998,13(7),679-682.walker,g.s.;ridd,m.j.;brunskill,g.j.acomparisonofinductivelycoupledplasmaatomicemissionspectrometryandinductivelycoupledplasmamassspectrometryfordeterminationofmercuryingreatbarrierreefsediments.rapidcommun.massspectrom.1996,10(1),96-99.）、原子吸收/發(fā)射光譜法（llobet,j.m.;falco,g.;casas,c.;teixido,a.;domingo,j.l.concentrationsofarsenic,cadmium,mercury,andleadincommonfoodsandestimateddailyintakebychildren,adolescents,adults,andseniorsofcatalonia,spain.j.agric.foodchem.2003,51(3),838-842.）、電化學(xué)法等（alves,g.m.s.;magalh?es,j.m.c.s.;salaün,p.;vandenberg,c.m.g;soares,h.m.v.m.simultaneouselectrochemicaldeterminationofarsenic,copper,leadandmercuryinunpollutedfreshwatersusingavibratinggoldmicrowireelectrode.anal.chim.acta2011,703(1),1-7.），但這些檢測方法往往對(duì)儀器的設(shè)備要求很高。熒光光譜法，由于其靈敏度高、選擇性好、儀器操作簡單等優(yōu)點(diǎn)越來越受到科研工作者的關(guān)注。

方酸染料是由方酸與富電子芳基化合物或胺類化合物縮合生成的1,3-二取代衍生物，是一類具有共振穩(wěn)定的兩性離子型結(jié)構(gòu)的染料（ajayaghosh,a.chemistryofsquaraine-derivedmaterials:near-irdyes,lowbandgapsystems,andcationsensors.acc.chem.res.2005,38(6),449-459.）。該類化合物的顯著特征是在可見光區(qū)至近紅外光區(qū)（620-670nm）有窄而強(qiáng)的吸收帶和較高的量子產(chǎn)率，摩爾吸光系數(shù)大于10⁵l?mol^-1?cm^-1。這種光電特性主要來源于分子內(nèi)強(qiáng)烈的供體-受體-供體（donor-acceptor-donor）間的電荷遷移作用。由于其兼有優(yōu)異的熒光發(fā)射性能和電化學(xué)性能，良好的光學(xué)穩(wěn)定性，易修飾等特點(diǎn)，在新一代化學(xué)小分子探針的設(shè)計(jì)上具有廣闊的應(yīng)用前景。

近年來開發(fā)具有高靈敏度、高選擇性的熒光化學(xué)傳感器用于生物體內(nèi)hg²⁺的檢測一直是一個(gè)熱門的課題?；瘜W(xué)劑量計(jì)是基于不可逆化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)hg²⁺的檢測，因而具有更高的選擇性和靈敏度。其中汞誘導(dǎo)脫硫反應(yīng)是一類廣泛應(yīng)用的設(shè)計(jì)hg²⁺化學(xué)劑量計(jì)的反應(yīng)（gong,y.-j.;zhang,x.-b.;chen,z.;yuan,y.;jin,z.;mei,l.;zhang,j.;tan,w.-h.;shen,g.-l.;yu,r.-q.anefficientrhodaminethiospirolactam-basedfluorescentprobefordetectionofhg²⁺inaqueoussamples.analyst2012,137(4),932-938.zhang,x.;xiao,y.;qian,x.aratiometricfluorescentprobebasedonfretforimaginghg²⁺ionsinlivingcells.angew.chem.int.ed.2008,47(42),8025-8029.）。本發(fā)明通過對(duì)方酸染料的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，合成所述的單硫代方酸染料，該染料具有良好的水溶性，在ph為7.0的pbs緩沖體系中自組裝形成聚集態(tài)，導(dǎo)致熒光猝滅?；诠x子誘導(dǎo)脫硫反應(yīng)，向所述染料的水溶液中加入汞離子導(dǎo)致單硫代方酸染料脫硫，基于染料聚集狀態(tài)的改變，體系熒光增強(qiáng)，而加入其它金屬離子體系熒光幾乎無變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的特異性檢測。該探針具有較好的生物相容性和細(xì)胞通透性，較低的生物毒性，可用于細(xì)胞及斑馬魚活體內(nèi)汞離子的成像檢測，且表現(xiàn)出較好的汞離子檢測靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種可用于檢測純水相介質(zhì)和細(xì)胞及斑馬魚活體內(nèi)汞離子的近紅外單硫代方酸染料及其制備方法和應(yīng)用，該方酸染料穩(wěn)定性好，光學(xué)性能優(yōu)異，通過在苯胺側(cè)鏈引入氧醚鏈有效地提高了染料的水溶性，基于汞離子誘導(dǎo)脫硫反應(yīng)，將方酸染料中心四元環(huán)上的一個(gè)氧原子取代為硫原子，實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的特異性響應(yīng)，獲得一個(gè)性能優(yōu)異的汞離子熒光探針。該探針具有較好的生物相容性和細(xì)胞通透性，較低的生物毒性，可用于細(xì)胞及斑馬魚活體內(nèi)汞離子的成像檢測，且表現(xiàn)出較好的汞離子檢測靈敏度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種水溶性近紅外單硫代方酸染料的結(jié)構(gòu)式如下：

。

制備方法包括以下步驟：

（1）將氧代方酸染料和勞森試劑混合，溶于溶劑，n2保護(hù)下回流；

（2）冷卻至室溫，減壓除去溶劑，得粗產(chǎn)品；

（3）經(jīng)硅膠柱層析純化，得到所述的近紅外單硫代方酸染料。

步驟（1）中溶劑為無水甲苯，回流時(shí)間為15小時(shí)；步驟（3）中硅膠柱層析所用的洗脫劑為體積比為100:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液。

所述的氧代方酸染料的合成方法包括如下步驟：

（1）將苯胺衍生物和方酸混合，溶于溶劑，n2保護(hù)下回流分水；

（2）冷卻至室溫，減壓除去溶劑，得粗產(chǎn)品；

（3）經(jīng)溶劑洗滌純化，得到所述的氧代方酸染料

。

步驟（1）中溶劑為體積比為2:1的正丁醇和苯，回流時(shí)間為4小時(shí)；步驟（3）中所用的洗滌劑為石油醚。

所述的苯胺衍生物的合成方法包括如下步驟：

（1）將間氨基苯酚與對(duì)甲苯磺酸酯、碳酸鈉混合，溶于溶劑，加熱回流反應(yīng)；

（2）冷卻至室溫，倒入盛有冰水的燒杯中，用二氯甲烷萃取，有機(jī)相用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾后濃縮除去溶劑得粗產(chǎn)物；

（3）經(jīng)硅膠柱層析純化，得到所述的苯胺衍生物。

步驟（1）中溶劑為體積比為1:1的異丙醇和水的混合溶劑，回流溫度85℃，反應(yīng)時(shí)間48小時(shí)；步驟（3）中硅膠柱層析所用的梯度洗脫劑為體積比為3:2及1:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液。

所述的對(duì)甲苯磺酸酯的合成方法包括如下步驟：

（1）將二乙二醇單甲醚、對(duì)甲苯磺酰氯tscl和吡啶溶于溶劑，加熱回流反應(yīng)；

（2）冷卻至室溫，用水洗滌，無水硫酸鈉干燥，經(jīng)干燥后，除去溶劑得粗產(chǎn)物；

（3）經(jīng)硅膠柱層析純化，得到對(duì)甲苯磺酸酯。

步驟（1）中溶劑為二氯甲烷，回流反應(yīng)溫度40℃，時(shí)間30小時(shí)；步驟（3）中硅膠柱層析所用的洗脫劑為體積比為4:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液。

所述的近紅外單硫代方酸染料作為汞離子的熒光探針，用于純水相介質(zhì)中的汞離子檢測以及用于細(xì)胞內(nèi)及斑馬魚活體內(nèi)的汞離子的成像檢測。

本發(fā)明通過向苯胺側(cè)鏈的氮接入氧醚鏈，可以調(diào)節(jié)染料的溶解性能和聚集行為，從而影響染料的光物理性質(zhì)?；诠x子誘導(dǎo)脫硫反應(yīng)，將方酸染料中心四元環(huán)上的一個(gè)氧原子以硫原子取代，得到與汞離子有特異響應(yīng)的熒光探針。該探針具有較好的生物相容性和細(xì)胞通透性，較低的生物毒性，可用于細(xì)胞及斑馬魚活體內(nèi)汞離子的成像檢測，且表現(xiàn)出較好的汞離子檢測靈敏度。

本發(fā)明涉及的近紅外方酸染料具有如下特征：染料的最大吸收位于652-658nm，具有很高的摩爾吸光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。不同比例的乙醇/水溶液中，染料的吸收強(qiáng)度會(huì)隨含水量增加而逐漸降低。當(dāng)體系中含水量增加至80%時(shí)，染料吸收光譜僅有微小變化。當(dāng)含水量增加至90％時(shí)，652nm處的單體吸收峰明顯降低，562nm左右處出現(xiàn)了聚集態(tài)的吸收峰，在700-800nm出現(xiàn)尾峰。隨著乙醇/水混合溶劑中含水量的繼續(xù)增加，單體的吸收峰強(qiáng)度降低，聚集態(tài)吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)。這表明，相比其它方酸染料，所述的單硫代方酸染料的水溶性和抗聚集能力得到了顯著提高。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)在于：該單硫代方酸染料熒光探針穩(wěn)定性好，光學(xué)性能優(yōu)異。探針在純水相介質(zhì)中對(duì)汞離子具有非常高的靈敏度，通過熒光光譜分析，在pbs緩沖溶液中，對(duì)于hg²⁺的檢測限為1.2×10^-9m（3σ/k）。同時(shí)，在水相介質(zhì)中（如水、生物緩沖液、水溶性有機(jī)溶劑等）均表現(xiàn)出很高的汞離子專一選擇性，堿金屬（li⁺,na⁺,k⁺），堿土金屬（mg²⁺,ca²⁺,ba²⁺）及其它金屬離子（fe³⁺,ni²⁺,zn²⁺,cd²⁺,ag⁺,sr²⁺,al³⁺,mn²⁺,pb²⁺,co²⁺,cu²⁺）均對(duì)hg²⁺的檢測沒有影響。通過熒光共聚焦顯微成像分析，該熒光探針具有較好的細(xì)胞滲透性，在細(xì)胞內(nèi)同樣表現(xiàn)出較好的汞離子檢測靈敏度，且無明顯的細(xì)胞毒害作用，可用于細(xì)胞及斑馬魚活體內(nèi)汞離子的成像檢測。

附圖說明

圖1是濃度為2.0μm的單硫代方酸染料在不同比例的乙醇/水的吸收光譜變化圖。

圖2是濃度為2.0μm的單硫代方酸染料在pbs緩沖溶液中對(duì)金屬離子的熒光光譜響應(yīng)。

圖3是濃度為2.0μm的單硫代方酸染料在pbs緩沖溶液中陰離子的存在對(duì)體系熒光光譜的影響圖。

圖4是濃度為2.0μm的單硫代方酸染料在pbs緩沖溶液中陰離子競爭實(shí)驗(yàn)的熒光光譜圖。

圖5是濃度為2.0μm的單硫代方酸染料在pbs緩沖溶液中對(duì)汞離子的吸收光譜滴定圖。

圖6是濃度為2.0μm的單硫代方酸染料在pbs緩沖溶液中對(duì)汞離子的熒光光譜滴定圖，插圖：檢測體系在657nm處的熒光強(qiáng)度隨汞離子濃度變化的趨勢圖（λex=630nm,pmt=600v,slit=5nm/5nm）。

圖7是濃度為2.0μm的單硫代方酸染料的熒光強(qiáng)度在汞離子濃度為0.06-0.18μm范圍內(nèi)657nm處變化趨勢圖。

圖8是單硫代方酸染料在細(xì)胞內(nèi)對(duì)汞離子檢測的激光共聚焦成像圖，其中(a)和(b)為只有探針時(shí)的明場圖和暗場圖，(c)和(d)為繼續(xù)用含汞離子的細(xì)胞培養(yǎng)液孵育的明場圖和暗場圖。

圖9是單硫代方酸染料在斑馬魚活體內(nèi)對(duì)汞離子檢測的激光共聚焦成像圖，其中(a)和(b)為只有探針時(shí)的明場圖和暗場圖，(c)和(d)為繼續(xù)用含汞離子的pbs緩沖溶液孵育的明場圖和暗場圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

的制備：

將100ml三口瓶置于0℃的冰水浴中，二乙二醇單甲醚（3.52ml，3.60g，30mmol）、吡啶（2.41ml，2.37g，30mmol）溶于60ml的二氯甲烷，然后緩慢滴加溶有對(duì)甲苯磺酰氯tscl（6.35g，33mmol）的ch2cl2溶液約20ml。滴加結(jié)束后，攪拌加熱至40℃，反應(yīng)時(shí)間約30小時(shí)。反應(yīng)完畢，將混合液轉(zhuǎn)移至250ml的分液漏斗中，50ml二次水洗滌三次，無水na2so4干燥有機(jī)相，過濾除去na2so4，減壓蒸除去溶劑，得粗產(chǎn)物。硅膠柱提純，以硅膠為填料，用體積比4:1的石油醚∶乙酸乙酯為淋洗劑，柱層析分離提純粗產(chǎn)品，得無色液體5.15g，產(chǎn)率63%。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.65(d,j=8.2hz,2h),7.22(d,j=8.1hz,2h),4.03(t,j=4.7hz,2h),3.54(t,j=4.7hz,2h),3.42(t,j=4.6hz,2h),3.33(t,j=4.4hz,2h),3.19(s,3h),2.30(s,3h);¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ144.82,132.85,129.80,127.79,71.63,70.39,69.31,68.48,58.75,21.42.

實(shí)施例2

苯胺衍生物的制備

在100ml三口燒瓶中加入間氨基苯酚（196mg，1.80mmol），對(duì)甲苯磺酸酯（988mg，3.60mmol），碳酸鈉（267mg，2.52mmol），溶于30ml體積比為1:1的異丙醇和水的混合溶劑中，在n2的保護(hù)下攪拌加熱至85℃，回流反應(yīng)48小時(shí)，tlc跟蹤至原料點(diǎn)完全消失。反應(yīng)結(jié)束后，減壓除去異丙醇，將殘留物轉(zhuǎn)移至250ml的分液漏斗中，加入少量的飽和食鹽水，然后用約100ml的二氯甲烷多次萃取，合并有機(jī)相。無水mgso4干燥旋蒸除去二氯甲烷，得粗產(chǎn)物。硅膠柱提純，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯（3:2=v/v），分離出雜質(zhì)和單取代組分，再將洗脫劑極性增大為石油醚：乙酸乙酯（1:1=v/v），分離出雙取代組分，分別得到淡黃色的單取代間羥基苯胺衍生物221mg，產(chǎn)率為58%；淡黃色的雙取代間羥基苯胺衍生物235mg，產(chǎn)率為42%。目標(biāo)的雙取代產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征如下：¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ7.01(t,j=8.4hz,1h),6.23(d,j=6.3hz,2h),6.17(d,j=8.1hz,1h),3.60(t,j=6.3hz,8h),3.53(dd,j=13.4,6.4hz,8h),3.39(s,6h);¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ157.43,149.29,130.21,104.02,103.42,99.02,72.02,70.48,68.44,58.92,50.99.

實(shí)施例3

所述的方酸染料的制備：

在100ml的三口瓶中加入方酸（38.8mg,0.34mmol），30ml正丁醇和15ml苯，n2保護(hù)下加熱分水回流1小時(shí)，緩慢滴加2.0ml正丁醇溶解的苯胺衍生物（281mg,0.90mmol）溶液，分水回流反應(yīng)約4小時(shí),tlc跟蹤反應(yīng)至原料的消失停止反應(yīng)。使用石油醚洗滌三次，得到藍(lán)色的化合物，產(chǎn)品質(zhì)量為180mg，產(chǎn)率為75%，熔點(diǎn)為153-154°c。frir(kbr):νmax2874,2811,1623,1568,1530,1431,1402,1344,1267,1234,1183,1115,815,781,746cm^-1;¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.02(d,j=7.7hz,0.6h),7.87(d,j=9.2hz,1.4h),6.42(d,j=10.4hz,2h),6.17(s,2h),3.71(dd,j=11.5,4.5hz,16h),3.62-3.59(m,8h),3.54-3.51(m,8h),3.38(s,12h);¹³cnmrδ(100mhz,cdcl3)δ182.92,173.33,164.68,156.93,132.49,110.29,107.96,98.94,71.94,70.78,68.56,59.11,51.69;esi-ms:m/z727.6([m+na]⁺);hrms(esi):calcdforc36h53n2o12([m+h]⁺):705.3599,found:705.3646;calcdforc36h52n2nao12([m+na]⁺):727.3418,found:727.3464.

實(shí)施例4

所述的近紅外單硫代方酸染料的制備：

在50ml的三口瓶中加入氧代方酸染料（105mg,0.15mmol）和勞森試劑（121mg,0.30mmol）在30ml無水甲苯中加熱回流15小時(shí)，停止反應(yīng)，選用二氯甲烷:甲醇（100:1，v/v）進(jìn)行色譜分離，得到綠色化合物，產(chǎn)品質(zhì)量為57mg，產(chǎn)率為53%，熔點(diǎn)125-127°c。frir(kbr):νmax3456,2875,1685,1611,1396,1343,1282,1223,1192,1114,808,720,648cm^-1;¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ11.78(s,0.6h),11.72(s,0.6h),11.11(s,0.8h),9.23(d,j=9.4hz,0.8h),8.95(d,j=9.4hz,0.6h),8.18(d,j=9.3hz,0.6h),6.55-6.35(m,2h),6.17(d,j=7.6hz,2h),3.72(dd,j=14.7,4.7hz,16h),3.60(dd,j=5.5,3.3hz,8h),3.52(dd,j=6.0,3.0hz,8h),3.38(s,12h);¹³cnmr(100mhz,cdcl3)δ202.04,197.31,185.31,184.97,180.60,178.30,176.00,164.80,164.55,164.12,157.38,157.34,157.18,134.40,132.43,131.51,111.15,111.01,110.53,107.81,107.71,107.62,99.66,98.91,98.82,71.92,70.79,68.56,59.10,51.76;esi-ms:m/z721.7([m+h]⁺),743.6([m+na]⁺);hrms(esi):calcdforc36h53n2o11s([m+h]⁺):721.3370,found:721.3373;calcdforc36h52n2nao11s([m+na]⁺):743.3190,found:743.3191.

所述的染料的最大吸收位于652-658nm，具有很高的摩爾吸光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率。方酸染料在水溶液中易發(fā)生自聚集，溶劑的極性和溶劑的成分對(duì)染料的光譜性質(zhì)具有很大的影響。水具有較大的介電常數(shù)，能有效地減少分子聚集堆積時(shí)同種電荷的排斥，有利于染料分子的聚集。聚集會(huì)引起染料吸收光譜的變化及熒光的猝滅。圖1為2.0μm的單硫代方酸染料在不同含水量的乙醇溶液中的吸收光譜。在不同比例的乙醇/水溶液中，染料的吸收強(qiáng)度會(huì)隨含水量增加而逐漸降低。當(dāng)體系中含水量增加至80%時(shí)，染料吸收光譜僅有微小變化。當(dāng)含水量增加至90％時(shí)，652nm處的單體吸收峰明顯降低，562nm左右處出現(xiàn)了聚集態(tài)的吸收峰，在700-800nm出現(xiàn)尾峰。隨著乙醇/水混合溶劑中含水量的繼續(xù)增加，單體的吸收峰強(qiáng)度降低，聚集態(tài)吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)。這表明，相比其它方酸染料，所述的單硫代方酸染料的水溶性和抗聚集能力得到了顯著提高。

選擇性是評(píng)價(jià)化學(xué)傳感器性能優(yōu)異與否的一項(xiàng)指標(biāo)。在含2.0μm染料的ph為7.0的pbs緩沖溶液中，分別加入20當(dāng)量堿金屬（li⁺,na⁺,k⁺），堿土金屬（mg²⁺,ca²⁺,ba²⁺）及其它金屬離子（fe³⁺,ni²⁺,zn²⁺,cd²⁺,ag⁺,sr²⁺,al³⁺,mn²⁺,pb²⁺,co²⁺,cu²⁺,hg²⁺）。如圖2所示，除了hg²⁺，其它金屬離子的存在并沒有導(dǎo)致較大程度的熒光增強(qiáng)。說明所述的單硫代方酸染料對(duì)hg²⁺具有特異性識(shí)別，表現(xiàn)出良好的選擇性。

在實(shí)際應(yīng)用中，有可能存在一系列復(fù)雜物質(zhì)的干擾。陰離子的存在可能會(huì)對(duì)體系本身的穩(wěn)定性和hg²⁺的檢測產(chǎn)生一定程度的影響。圖3為ph在7.0的pbs緩沖溶液中一系列20當(dāng)量陰離子（scn^-,s2o3^2-,s^2-,so4^2-,i^-,clo4^-,ch3coo^-,no3^-,hco3^-,co3^2-,no2^-）對(duì)體系熒光光譜的影響。上述各種陰離子的存在并沒有導(dǎo)致明顯的熒光光譜變化。因此可以推斷所述的單硫代方酸染料自身不與陰離子發(fā)生相互作用。圖4為與hg²⁺等當(dāng)量的陰離子存在條件下的競爭性實(shí)驗(yàn)。從圖中可以明顯發(fā)現(xiàn)除了s2o3^2-,i^-的存在會(huì)對(duì)hg²⁺的檢測產(chǎn)生一些干擾，包括與hg²⁺具有較強(qiáng)相互作用的s^2-在內(nèi)的其它陰離子并沒有對(duì)hg²⁺的檢測產(chǎn)生顯著的干擾，而實(shí)際體系中s2o3^2-,i^-的含量較低，其存在不會(huì)對(duì)hg²⁺檢測產(chǎn)生明顯干擾。

為了進(jìn)一步研究所述的單硫代方酸染料對(duì)汞離子的定量檢測，開展了對(duì)汞離子的吸收光譜和熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)。圖5是濃度為2.0μm的單硫代方酸染料在ph為7.0的pbs緩沖溶液中對(duì)汞離子的吸收光譜滴定圖。如圖5所示，在不斷滴加hg²⁺的過程中，652nm處的吸收峰紫移到638nm處且吸光度逐漸增強(qiáng)，而448nm和562nm處的吸光度逐漸減弱，700-800nm范圍內(nèi)的尾峰消失。圖6為單硫代方酸染料在ph為7.0的pbs緩沖溶液體系中hg²⁺滴定熒光光譜的變化。明顯可以看到隨著hg²⁺的濃度增大，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，當(dāng)hg²⁺濃度大于1.0μm熒光強(qiáng)度不再變化，說明hg²⁺滴定已經(jīng)達(dá)到飽和。從熒光滴定光譜中選擇汞離子濃度范圍在0.06-0.18μm的七個(gè)點(diǎn)，得到一系列汞離子濃度與熒光強(qiáng)度的工作曲線（r²=0.996,k=1.8×10⁹）。標(biāo)準(zhǔn)偏差的確定是在相同的測試條件下通過平行掃描空白溶液七次，通過公式計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)偏差σ約為0.73。根據(jù)公式（3σ/k）求得所述的單硫代方酸染料對(duì)于hg²⁺的檢測限為1.2×10^-9m（圖7）。

通過共聚焦顯微成像技術(shù)，進(jìn)一步研究所述的單硫代方酸染料在生物體內(nèi)的實(shí)際應(yīng)用。將培養(yǎng)好的兩組hela細(xì)胞用pbs緩沖溶液洗滌三次，用含有探針（2.0μm）的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)1.0小時(shí)后，使用pbs緩沖溶液洗滌三次，其中一組加入培養(yǎng)液后用于細(xì)胞成像（圖8a,b）；另外一組用含有汞（40μm）的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)1.5小時(shí)；使用pbs緩沖溶液洗滌三次，加入培養(yǎng)液后用于細(xì)胞成像（圖8c,d）。從圖8中可以看出，該熒光探針具有良好的細(xì)胞滲透率，無明顯的細(xì)胞毒性，可以在細(xì)胞內(nèi)對(duì)汞離子實(shí)現(xiàn)很好的檢測響應(yīng)，獲得良好的細(xì)胞成像圖。

我們選用5天齡的斑馬魚幼體為模型利用激光共聚焦顯微鏡來研究所述的單硫代方酸染料對(duì)生物活體內(nèi)的hg²⁺的熒光成像。由圖9b可以看出，5天齡的斑馬魚經(jīng)4μm的染料孵育20分鐘后，只能觀察到十分微弱的熒光信號(hào)，而5天齡的斑馬魚依次經(jīng)4μm的染料孵育20分鐘，10μm的hg²⁺孵育10分鐘后，可以觀察到很強(qiáng)的熒光（圖9d）。該熒光探針可以在活體內(nèi)對(duì)汞離子實(shí)現(xiàn)很好的檢測響應(yīng)，獲得良好的成像圖。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。