熒光pH敏感性染料和其使用方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)案的奪叉參考
[0002] 本申請(qǐng)案要求2012年5月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/653, 333號(hào)和2012 年5月31日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/653,616號(hào)的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)案以引 用的方式全文結(jié)合到本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 揭示新穎的pH敏感性熒光染料，和用于包括監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)過(guò)程在內(nèi)的多種應(yīng)用的 分析。
【背景技術(shù)】
[0004] 用于生物研究和醫(yī)學(xué)診斷學(xué)的pH敏感性熒光染料分成兩組，各組的區(qū)別在于對(duì) pH改變的熒光反應(yīng)的起源。第一組包括具有由熒光團(tuán)中的酚系羥基電離控制的熒光的化合 物。實(shí)例包括熒光素、羧基熒光素、OregonGreen?、SNARF?、SNAFL?和HPTS指 示劑。
[0005] 美國(guó)專利公開(kāi)案第2006/0051874號(hào)描述結(jié)合到用于監(jiān)測(cè)血庫(kù)中的血液pH的熒光 檢測(cè)器中的熒光素樣結(jié)構(gòu)。因?yàn)檫@些類型的分子的電離程度會(huì)在環(huán)境酸度降低后增加，所 以它們隨著pH的增加變得更具熒光性。
[0006] 第二組的熒光pH傳感器包括氨基（脂肪族或芳香族）作為指示劑部分，連同熒光 染料報(bào)告部分一起。當(dāng)此類分子吸收光子，產(chǎn)生電子激發(fā)態(tài)時(shí)，氨基的孤對(duì)電子轉(zhuǎn)移到由于 激發(fā)而空出的軌道。此類電子轉(zhuǎn)移稱為光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET)，防止受激分子發(fā)生輻射躍 遷，從而使染料的熒光淬滅。氨基質(zhì)子化會(huì)改變所述對(duì)的軌道的性質(zhì)和能量且阻止PET。因 而，熒光報(bào)告部分對(duì)pH改變作出反應(yīng)。因?yàn)榘被|(zhì)子化會(huì)消除淬滅，所以基于PET的傳感 器隨著pH的降低變得更具熒光性。
[0007] 基于PET的pH傳感器的實(shí)例包括LysoSensor?染料，其含有二甲基氨基作為指示 劑部分；和CypHerl;5E染料，其具有假吲哚指示劑基團(tuán)。這些傳感器的一個(gè)缺點(diǎn)是工作 范圍由于指示劑氨基的低pKa而移到酸性側(cè)。
[0008] -系列基于若丹明的pH傳感器描述于PCT公開(kāi)案第W02005/098437號(hào)（史密斯 (Smith)等人）中。所述染料具有在氧雜蒽部分的鄰位被-OH或-SH(或其去質(zhì)子化形式） 取代的苯環(huán)，使得去質(zhì)子化為帶負(fù)電荷狀態(tài)會(huì)淬滅熒光且僅在帶負(fù)電荷的_〇_或-S^質(zhì)子化 為中性狀態(tài)后，熒光才得以恢復(fù)。典型地，這種情況發(fā)生時(shí)的pH小于pH 6。冊(cè)2005/098437 聲稱，-OH或-SH基團(tuán)的電離狀態(tài)引起染料的pH反應(yīng)且染料中四甲基若丹明的強(qiáng)吸電子特 性顯著地降低指示劑基團(tuán)的pKa，因此使傳感器的工作范圍移向高酸性pH值。然而，這會(huì)限 制TO2005/098437中所述的染料在生理學(xué)pH(例如pH 6-7)下，尤其在生物系統(tǒng)中的適用 性。這些染料的額外缺點(diǎn)是其pKa不可調(diào)。此外，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些化合物在溶液中不穩(wěn) 定。
[0009] 因此，需要具有改進(jìn)的特性（包括在至少一些化合物中，檢測(cè)生物系統(tǒng)中的pH改 變的能力）的額外pH敏感性熒光染料。本發(fā)明的目標(biāo)是開(kāi)發(fā)一類新穎的相對(duì)穩(wěn)定的熒光 pH傳感器，其在UV/VIS光譜的紅色部分中發(fā)熒光，優(yōu)選地具有朝向中性和其它生物相關(guān)pH 值的工作范圍，由此減輕或去除所屬領(lǐng)域中已知的化合物的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本文描述用于使用pH敏感性熒光染料來(lái)檢測(cè)樣品中的pH的化合物、組合物、方法 和試劑盒，一方面，其特征在于省去了如W02005/098437所需的羥基或硫醇基團(tuán)。另一方 面，如本文所揭示的pH敏感性熒光染料允許檢測(cè)UV/VIS光譜的紅色部分中對(duì)pH改變的熒 光反應(yīng)。本發(fā)明教示提供一系列新的pH敏感性紅色熒光染料，其具有優(yōu)于現(xiàn)有的熒光pH 傳感器的顯著且意外優(yōu)點(diǎn)，即在苯胺部分中的烷氧基取代基的對(duì)位存在二烷基氨基會(huì)產(chǎn)生 生理學(xué)pKa值且本文提供的染料的pKa也可調(diào)。因此，本文提供的pH敏感性熒光染料可經(jīng) 改質(zhì)以適合待分析的特定應(yīng)用或條件。
[0011] 在某些實(shí)施例中，提供新穎染料化合物用作熒光pH傳感器，所述染料化合物具有 結(jié)構(gòu)式（I):
[0012]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種pH敏感性熒光染料化合物，其具有結(jié)構(gòu)式（I): 其中
R1為烷氧基或硫烷基； R2和R 6可相同或不同，各自獨(dú)立地為H、鹵素 、-OR a、-SRa、-NRaRb或給電子基團(tuán)； R3為-NR' R"，其中R'和R"可相同或不同，各自獨(dú)立地為烷基或經(jīng)取代的烷基； R4是選自由烷基和經(jīng)取代的烷基組成的群組； R5是選自由以下組成的群組：烷基；經(jīng)取代的烷基；烯基；經(jīng)取代的烯基；醜基；芳基； 經(jīng)取代的芳基；羧基烷基；雜芳基；經(jīng)取代的雜芳基；雜環(huán)基；經(jīng)取代的雜環(huán)基；烷基羧基； 烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基雜芳基；(CH 2)nCO(O)R ; (CH2)nC(O)R ; (CH2)nC(O)NHR JagnC(O)NRr;其中η為1到6的整數(shù)，且R和R?？上嗤虿煌?，各自獨(dú)立 地為Η、烷基、經(jīng)取代的烷基、芳基、經(jīng)取代的芳基、雜芳基、經(jīng)取代的雜芳基、經(jīng)取代的氨基、 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白質(zhì)、親脂性基團(tuán)或R d，其中#為（CH 2) nC (0) NHRx，其中 η為1到6的整數(shù)，且&為反應(yīng)性基團(tuán)；-L-RxJP -L-S。，其中L為鍵聯(lián)基團(tuán)，Rx為反應(yīng)性基 團(tuán)，且S。為結(jié)合的物質(zhì)； RaS Η、烷基或經(jīng)取代的烷基； Rb為烷基或經(jīng)取代的烷基；且 R7、R8、R9和R 1(1可相同或不同，各自獨(dú)立地為烷基或烯基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中 R1為烷氧基或硫烷基； R2和R 6可相同或不同，各自獨(dú)立地為H或鹵素； R3為-NR' R"，其中R'和R"可相同或不同，各自獨(dú)立地為烷基； R4為烷基； R5是選自由以下組成的群組：烷基；經(jīng)取代的烷基；烯基；經(jīng)取代的烯基；醜基；芳基； 經(jīng)取代的芳基；羧基烷基；雜芳基；經(jīng)取代的雜芳基；雜環(huán)基；經(jīng)取代的雜環(huán)基；烷基羧基； 烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基雜芳基；(CH 2)nCO(O)R ; (CH2)nC(O)R ; (CH2)nC(O)NHR JagnC(O)NRr;其中η為1到6的整數(shù)，且R和R。可相同或不同，各自獨(dú)立 地為Η、烷基、經(jīng)取代的烷基、芳基、經(jīng)取代的芳基、雜芳基、經(jīng)取代的雜芳基、經(jīng)取代的氨基、 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白質(zhì)、親脂性基團(tuán)或R d，其中#為（CH 2) nC (0) NHRx，其中 η為1到6的整數(shù)，且IU?反應(yīng)性基團(tuán)；-L-R xjP -L-S。;且 R7、R8、R9和R 1(1可相同或不同，各自獨(dú)立地為烷基或烯基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中 R1為烷氧基或硫烷基； R2和R 6可相同或不同，各自獨(dú)立地為H、C1或F ; R3為-NR' R"，其中R'和R"可相同或不同，各自獨(dú)立地為烷基； R4為烷基； R5是選自由以下組成的群組：烷基；經(jīng)取代的烷基；烯基；經(jīng)取代的烯基；醜基；芳基； 經(jīng)取代的芳基；羧基烷基；雜芳基；經(jīng)取代的雜芳基；雜環(huán)基；經(jīng)取代的雜環(huán)基；烷基羧基； 烷基烷氧羰基；烷基氨基羰基；烷基芳氧基羰基；烷基雜芳基；(CH 2)nCO(O)R ; (CH2)nC(O)R ; (CH2)nC(O)NHR JagnC(O)NRr;其中η為1到6的整數(shù)，且R和R?？上嗤虿煌?，各自獨(dú)立 地為Η、烷基、經(jīng)取代的烷基、芳基、經(jīng)取代的芳基、雜芳基、經(jīng)取代的雜芳基、經(jīng)取代的氨基、 烷基氨基羰基、氨基葡聚糖、酰胺、蛋白質(zhì)、親脂性基團(tuán)或R d，其中#為（CH 2) nC (0) NHRx，其中 η為1到6的整數(shù)，且IU?反應(yīng)性基團(tuán)；-L-R xjP -L-S。;且 R7、R8、R9和R 1(1可相同或不同，各自獨(dú)立地為烷基或烯基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物,其中 R1為烷氧基或硫烷基； R2和R6各自為H ; R3為-NR' R"，其中R'和R"可相同或不同，各自獨(dú)立地為烷基； R4為烷基； R5是選自由以下組成的群組：烷基；經(jīng)取代的烷基；烯基；經(jīng)取代的烯基；醜基；芳基； 經(jīng)取代的芳基；羧基烷基；雜芳基