.Og、硝酸鐘1.Og、乙酸鋼0. 5g、憐酸氨二鐘0. 5g、硫酸儀0. 5g、硫酸儘0.Olg、硫酸亞 鐵0.Olg和水1000血組成，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的抑為7. 2-7. 4 ; 發(fā)酵培養(yǎng)基中加入硫酸儘，起到刺激作用，可生產(chǎn)更多的藍色色素。
[0026] 實施例3產(chǎn)環(huán)保型藍色色素的鏈霉菌（Str巧tomycesSP. ^LAO菌株的生物學(xué)特 征分析 高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.Og，干酪素0. 5g，硝酸鐘（KN03) 1.Og，氯化鋼（化C1) 0. 5g，憐酸氨二鐘化2冊〇4)0. 5g，硫酸儀（M拆〇4. 7&0)0. 5g，硫酸鋒（ZnS〇4)0.01g，硫酸亞 鐵（FeS〇4. 7&0)0.Olg，蒸饋水 1000ml，pH7. 2 - 7. 4。
[0027] 1.形態(tài)特征 在高氏一號培養(yǎng)基上，劃線分離時可形成絨毛狀菌落，早期在顯微鏡下可見形成稀疏 的淺白色絨毛狀菌落。如圖3和圖4所示4化菌落。后逐漸變濃密，白色，但無藍色色素出 現(xiàn)。圖5 (培養(yǎng)60h)，圖6 (培養(yǎng)72h)，圖7 (培養(yǎng)96h)，培養(yǎng)96小時可W看到開始有藍色 形成。第6天能看到菌落周圍有明顯的藍色色素出現(xiàn)，到第7天在平板上能明顯看到藍色 色素大量形成，并有色素分泌液滴形成（圖8，圖9)，氣生菌絲更加發(fā)達巧日圖10)。
[0028] 在插片和印片的顯微鏡觀察中可見到氣生菌絲和螺旋狀的抱子絲，也能看到該菌 株抱子多，抱子鏈3-4圈松散螺旋（圖11，圖12)。
[0029] 2.碳源、氮源對該菌株產(chǎn)生藍色色素的影響情況 在高氏一號培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別用等量的葡萄糖、甘露糖、木糖、乳糖、麥芽糖、薦糖、 甘露醇、木聚糖、簇甲基纖維素鋼、半纖維素、木質(zhì)素、果膠、麥芽粉取代淀粉進行碳源利用 情況實驗，結(jié)果如表1 : 表1碳源利用情況
較好利用：+++，利用：++，利用較差：+，不利用：一 由表1可W看出，不能作為藍色色素分泌的碳源物質(zhì)有：木糖、薦糖和簇甲基纖維素 鋼、果膠；能分泌少量色素的碳源物質(zhì)為：葡萄糖、甘露糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇；有利于色 素分泌的碳源物質(zhì)為：木質(zhì)素最好、淀粉次之、半纖維素和木聚糖再次之，麥芽粉又次之。
[0030] 在高氏一號培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別用等量的硝酸錠、氯化錠、硝酸鐘、硫酸錠、憐酸 錠、憐酸二氨錠、草酸錠、酒石酸錠、尿素、蛋白腺、牛肉膏、干酪素、膜蛋白腺、酵母提取物、 大豆粉取代硝酸鐘進行氮源利用情況實驗，結(jié)果如表2所示： 表2 氮源利用情況
較好利用：+++，利用：++，利用較差：+，不利用：- 由表2可W看出，該菌不能利用憐酸錠、憐酸二氨錠、牛肉膏、酵母提取物、干酪素做氮 源產(chǎn)生色素，但除氯化錠和憐酸二氨錠利用較弱外，其它的基本上都能利用其生長；產(chǎn)生色 素較少的氮源物質(zhì)有硫酸錠、氯化錠、草酸錠，運樣看來錠鹽不利于色素的產(chǎn)生。牛肉膏、蛋 白腺、膜蛋白腺和酵母提取物做氮源均不能產(chǎn)生藍色素；產(chǎn)生藍色素較好的氮源主要有玉 米粉最好、硝酸鐘次之、尿素再次之；就生物量來說，干酪素明顯高于其它氮源，在進行種子 培養(yǎng)時可考慮加入。
[0031] 3.初始抑對色素產(chǎn)生的影響 在高氏一號培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別用10%的鹽酸和氨氧化鋼溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、ll常規(guī)滅菌冷卻后Wl0%的接種量接種，觀察初始pH對色素產(chǎn)生 的影響，結(jié)果如表3所示； 表3初始抑對色素產(chǎn)生的影響
由表3可W看出，初始PH值為7左右時最適于色素的分泌和菌絲體的生長。
[003引如圖18所示，不同抑下的HPLC高效液相色譜圖，由圖18可W看出不同抑下的 色素出峰時間基本沒有變化，說明其物質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相同。
[003引4.不同C/N對色素產(chǎn)生的影響 W高氏一號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，固定氮源的量不變（KN03為Ig/L)，分別稱量lOOmL培養(yǎng)基 中不同量的淀粉（3. 2, 2. 88, 2. 56, 2. 24,1. 92,1. 6,1. 28,0. 96,0. 64,及原配方中的 2.Og使 C/N為12. 5)使C/N比符合下表要求。115°C，高壓滅菌15Min，接種后26-28°C培養(yǎng)。結(jié)果 如表4所示： 表4 不同C/N對色素產(chǎn)生的影響
由表4可知，C/N為14 :1時，產(chǎn)生色素的量最大，生物量也較大。
[0034] 5.無機離子對色素產(chǎn)生的影響 W高氏一號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，固定其它物質(zhì)的量不變，分別稱量lOOmL培養(yǎng)基中不同的 無機鹽0.05g，代替培養(yǎng)基中的化C1。115°C，高壓滅菌15Min，接種后30°C培養(yǎng)。結(jié)果如表 5所示： 表5 無機離子對色素產(chǎn)生的影響
由表5可知，S〇42、C1、N03，等無機陰離子對色素分泌的影響較小，而乙酸根（AC)能 明顯促進色素的分泌；Ca、化、K，等離子對色素的分泌影響一定促進作用，F(xiàn)e、化、Ag、化、Co 不利于色素的分泌，Μη離子能明顯促進色素的分泌，且能促進生物量的快速生長?？煽紤] 在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中加入少量MnS〇4，W便產(chǎn)生更多的種子用于接種，和在發(fā)酵時 產(chǎn)生更多的色素。
[0035] 6.培養(yǎng)時間對色素分泌的影響 從發(fā)酵培養(yǎng)的第24小時開始，每隔24小時于發(fā)酵瓶中取10ml菌液于兩個離屯、管 中。先經(jīng)5000巧m離屯、lOmin，棄沉淀后用紫外可見分光光度計測量其光譜曲線圖，再經(jīng) 1200化pm離屯、lOmin，同樣棄沉淀后用紫外可見分光光度計測量其光譜曲線圖，并取圖譜 中波長為596皿處的數(shù)值，為色素在596皿處的0D值。依據(jù)色素圖譜觀察色素產(chǎn)生量的變 化，直到色素濃度不再變化。得到數(shù)據(jù)作圖14色素的積累量和圖15色素在不同時間段的 產(chǎn)生量。色素的積累量如圖14所示，色素的單天產(chǎn)量如圖15所示。
[0036] 通過對W上色素0D值折線圖的分析，發(fā)現(xiàn)鏈霉菌YLA0在培養(yǎng)過程中，在第2d開 始產(chǎn)生色素，但產(chǎn)量較小，第4d開始大量產(chǎn)生，并且色素單天產(chǎn)量在第6d達到最多，8d時色 素的累積量最多，此后色素總量有所減少。當(dāng)發(fā)酵時間到達第9d時菌體色素產(chǎn)生量明顯減 少。因此對色素進行發(fā)酵生產(chǎn)時可W在第7d停止發(fā)酵，進行色素的提取，此時能獲得最佳 產(chǎn)量。
[0037] 所述產(chǎn)環(huán)保型藍色色素的鏈霉菌（Str巧tomycessp. )YLA0菌株，其16rDNA的部 分基因序列為：

w上基因測序結(jié)果由華大基因測試而得。
[0038] 正向引物 27F:GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG; 反向引物 1541R:AAGGAGGTGATCCAGCCGCA。
[0039] 將得到的基因測序結(jié)果用在線的Blast軟件化ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast)進行同源性分析，結(jié)果在GenBank中找到多個鏈霉菌屬顯著相似的基因序列，其 同源性高達98%。通過Blast工具在NCBI蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中進行同源性捜索，并利用 ClustalW程序進行多重序列比對。利用MEGA4.0軟件，采用相鄰拼接方法（Nei曲bor 化iningMethod),獲得該菌株的系統(tǒng)進化樹（圖13)，將該菌鑒定為鏈霉菌，且該菌株與常 見的菌株均有某些特征不同，可能是能產(chǎn)生藍色色素的一個新種。
[0040] 該菌株已于2015年9月8日送至中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 屯、保藏，保藏編號為CGMCCNo:11335。
[0041] 色素的性質(zhì)與穩(wěn)定性研究 1.色素的溶解性： 對產(chǎn)藍色素鏈霉菌搖床培養(yǎng)7d后停止發(fā)酵，收集發(fā)酵液首先進行5000rpm離屯、lOmin， 取上清液平均分到兩個燒杯中，分別向上清液中不斷滴加Imol/L氨氧化鋼溶液和Imol/L 鹽酸溶液，發(fā)現(xiàn)色素即可溶于堿溶液又可溶于酸溶液，且抑越低溶解度越小，當(dāng)抑< 4時 搖勻后靜置比會產(chǎn)生磚紅色沉淀，將其調(diào)至堿性時，溶液又恢復(fù)藍色。將酸沉后的色素干 燥后，吸水性很差，但易溶于堿溶液，且性質(zhì)不變，所W可W用酸沉的色素較長時間保藏。
[0042] 同樣取5份等量上清液，分別向上清液中加入等量同濃度的極性或非極性有機溶 劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藍色素在極性較強的有機溶劑甲醇和乙醇中產(chǎn)生小顆粒狀沉淀，丙酬中可 產(chǎn)生絲狀沉淀，不溶于Ξ氯甲燒、乙酸和乙酸乙醋等非極性的有機溶劑。
[0043] 實驗結(jié)果：根據(jù)W上實驗結(jié)果，結(jié)合相似相容的原理推測該色素的分子結(jié)構(gòu)是極 性的，對色素分子結(jié)構(gòu)的探究有一定的幫助。
[0044] 2.抑變化對色素呈色的影響 在上述色素溶解性實驗中發(fā)現(xiàn)，向色素中不斷滴加酸或堿時，色素顏色隨抑的變化而 變化，具體變化過程如下：
實驗結(jié)果：色素的變色區(qū)間在P冊-7之間，使之作為指示劑能較好地辨別弱酸或弱堿 溶液的酸堿性，可作為一種較好的酸堿指示劑。
[004引不同抑下的HPLC高效液相色譜圖，由圖可W看出不同抑下的色素出峰時間基本 沒有很大變化，說明其物質(zhì)結(jié)構(gòu)基本相同。
[0046] 3.不同離子對色素穩(wěn)定性的影響 配制 0. 05mol/L的W下鹽溶液（化S〇4、aiS〇4、MgS〇4、CaS〇4、CuS〇4、MnS〇4、BaS〇4、Pb(N〇3)2 、AgN〇3,按照氧化還原集中的配制方法，配制鹽濃度為Immol/L的25%發(fā)酵液的溶液靜置一 段時間。選取未發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的溶液測其596nm處的0D值，發(fā)現(xiàn)色素溶液的吸光度有所增 強。未與色素發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的鹽離子，對色素溶液吸光度的增強效果如圖16所示： 實驗結(jié)果：結(jié)合W上實驗可知化Gu2\Pb+可W與藍色素發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)而產(chǎn)生沉淀。Fe3+產(chǎn)