具有溶酶體定位功能的硅基羅丹明銅離子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及化學(xué)和生物成像技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是具有溶酶體定位功能的硅基 羅丹明銅離子熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 銅元素是生物體必須的微量元素，也是人體內(nèi)含量排在鋅鐵之后、位居第三的過 渡元素，廣泛分布于生物組織中，對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨骼及內(nèi)臟組織的發(fā)育和 功能有著重要影響。銅元素是許多金屬蛋白和酶的重要組成部分、如金屬硫蛋白、環(huán)氧合酶 C0X、細(xì)胞色素 C氧化酶、銅-鋅超氧化物歧化酶等，參與生物體內(nèi)的細(xì)胞呼吸、抗氧化、神經(jīng) 遞質(zhì)及結(jié)締組織的生物合成、天然色素的形成等過程。生物體內(nèi)銅含量的失衡會導(dǎo)致蛋白 質(zhì)、脂類、DNA和其它生物分子的氧化性損傷，導(dǎo)致生長和代謝的紊亂，并可能引發(fā)Menkes、 Wilson、Parkinson 和 Alzheimer 等疾病。
[0003] 溶酶體是真核細(xì)胞中由單層膜包被的囊狀結(jié)構(gòu)，溶酶體內(nèi)pH( ? 4.5)低于胞漿內(nèi) pH( ? 7.0)，內(nèi)含多種水解酶和內(nèi)分泌蛋白，能對細(xì)胞經(jīng)吞噬作用、胞吞作用等吸收的大分 子進(jìn)行消化分解。溶酶體還在膽固醇的動態(tài)平衡、質(zhì)膜的修復(fù)、骨組織的重塑、病原體防御 等過程中發(fā)揮重要作用。溶酶體能夠多方面調(diào)控細(xì)胞的凋亡過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著 密切的聯(lián)系。
[0004] 溶酶體與生物體銅離子的代謝有著密切的關(guān)系，例如肝細(xì)胞通過溶酶體可以將細(xì) 胞內(nèi)多余的銅離子運(yùn)送到細(xì)胞外，最后進(jìn)入膽汁中排出體外，因此檢測溶酶體的銅離子有 著重要的生理意義。熒光檢測法具有靈敏度高、響應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的成 像研究中，但由于溶酶體內(nèi)特殊的酸性環(huán)境，對探針的穩(wěn)定性、酸性條件下的識別性能等提 出了更高的要求，因此特異性檢測溶酶體內(nèi)銅離子的熒光探針鮮有報(bào)道。Cong Wu等人報(bào)道 了一個(gè)基于羅丹明的含六元螺環(huán)的銅離子探針(〇rg.Lett. ,2012,14,4198-4201 )，但沒有 用于細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中；Xiaobo Wang等人報(bào)道了一個(gè)基于ICT機(jī)理的銅離子熒光探針，并且 具有溶酶體靶向功能(Chem.Commun.，2013，49，11263-11265)，但是該探針屬于熒光減弱型 探針，靈敏度較差，且檢測波長不能夠滿足近紅外檢測的要求。專利中也有許多關(guān)于銅離子 熒光探針的報(bào)道，例如專利CN 102127421 A、CN103664971 A、CN 104087285 A、CN 101914102 A等，這些專利中報(bào)道的銅離子探針均無法定位于細(xì)胞內(nèi)溶酶體，且檢測波長均 無法滿足近紅外檢測的要求。中國專利201510010745.0,公開日2015年1月公開了一種用于 細(xì)胞內(nèi)銅離子熒光成像的納米探針及其制備方法，該探針具有尺寸均一、結(jié)果穩(wěn)定、毒性 低、生物相容性好的優(yōu)點(diǎn)。中國專利201410552491.0,公開日2014年10月公開了一種基于羅 丹明B的Cu 2+探針及其制備方法，該探針在pH= 7.2的HEPES緩沖溶液中為無色，加入銅離子 后，迅速變?yōu)榧t色，可通過肉眼直接觀測顏色變化從而測定水樣中部低于6μΜ的銅離子。以 上所述熒光探針都能較好的特異性識別銅離子，但其以熒光素和羅丹明為母體結(jié)構(gòu)，激發(fā) 波長和發(fā)射波長在可見光區(qū)，且不具備溶酶體特異性定位功能。我們知道，細(xì)胞溶酶體內(nèi)為 酸性環(huán)境，對探針的穩(wěn)定性、酸性條件下的識別性能等提出了更高的要求，因此設(shè)計(jì)合成具 有溶酶體靶向的銅離子熒光探針具有良好的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種具有溶酶體定位功能的硅基羅 丹明銅離子熒光探針。
[0006] 本發(fā)明的再一的目的是，提供如上所述硅基羅丹明銅離子熒光探針的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的另一的目的是，提供如上所述硅基羅丹明銅離子熒光探針的用途。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0009] -種具有溶酶體定位功能的硅基羅丹明銅離子熒光探針，所述的熒光探針為SiR-Cu，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示;所述的熒光探針能夠選擇性識別銅離子(Cu 2+)，且具有定位于細(xì)胞 中溶酶體的功能；
[0010] ，
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[0011]所述的熒光探針檢測pH值為4.5-9.0;優(yōu)選為5-7;最優(yōu)為6。
[0012]所述的焚光探針最大激發(fā)波長為667nm，最大發(fā)射波長為680nm〇
[0013] 為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0014] -種制備如上所述具有式（I)結(jié)構(gòu)的硅基羅丹明銅離子熒光探針的方法，包括如 下步驟：
[0015] 1)將2-NH2-SiR 與CSCh反應(yīng)生成2-NCS-SiR;
[0016] 2)將2-NCS-SiR與肼反應(yīng)生成探針SiR-Cu;
[0017]
[0018] 具體制備方法如下：
[0019] 1)將4.0當(dāng)量CSC12溶于干燥CH2CI2中，冰浴，將1.0當(dāng)量2-NH2_SiR溶于CH2CI2中，緩 慢加入CSC1 2的CH2C12溶液中，再加入4.0當(dāng)量NaOH，冰浴下反應(yīng)并慢慢升至室溫，反應(yīng)4小時(shí) 后，加入0.1M碳酸鈉水溶液，繼續(xù)反應(yīng)0.5小時(shí)，CH 2C12萃取，CH2C12層用無水硫酸鈉干燥，蒸 干溶劑，得固體2-NCS-SiR;
[0020] 2)將固體2-NCS-SiR用乙腈溶解，緩慢加入20.0當(dāng)量85 %水合肼，室溫下反應(yīng)4小 時(shí)，蒸干溶劑，CH2C12萃取，無水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析，得探針SiR-Cu。
[0021 ]為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0022] 如上所述硅基羅丹明銅離子熒光探針在檢測細(xì)胞溶酶體內(nèi)銅離子及細(xì)胞溶酶體 熒光成像中的應(yīng)用。所述的檢測為體外樣品檢測。
[0023] 如上所述的硅基羅丹明銅離子熒光探針在制備銅離子檢測試劑中的應(yīng)用。所述的 試劑可特異性定位于細(xì)胞中溶酶體。所述銅離子為Cu 2+。
[0024] 如上所述的硅基羅丹明銅離子熒光探針在制備細(xì)胞染料、生物染色劑、生物分子 或生物粒子的銅離子熒光標(biāo)記物中的應(yīng)用，所述的銅離子熒光標(biāo)記物具有溶酶體定位功 能。
[0025]本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0026] 本發(fā)明設(shè)計(jì)并合成出一種新型硅基羅丹明銅離子探針，該探針能夠特異性定位于 細(xì)胞的溶酶體中，并能夠?qū)崿F(xiàn)對溶酶體內(nèi)銅離子的檢測。該探針的激發(fā)和發(fā)射波長均位于 近紅外光區(qū)，在應(yīng)用于生物成像時(shí)可以降低生物體自身熒光背景的干擾，且穿透能力強(qiáng)，對 活體組織或細(xì)胞的損傷較小，可以滿足近紅外熒光檢測的要求。
【附圖說明】
[0027] 附圖1為本發(fā)明的探針SiR-Cu的核磁氫譜圖。
[0028] 附圖2為本發(fā)明的探針SiR-Cu的核磁碳譜圖。
[0029]附圖3為本發(fā)明的探針SiR-Cu在不同pH條件下激發(fā)光波長為620nm時(shí)，680nm處的 熒光變化圖。
[0030] 附圖4為本發(fā)明的探針SiR-Cu在pH為7.4條件下加入不同當(dāng)量銅離子的熒光光譜 圖。
[0031] 附圖5為本發(fā)明的探針SiR-Cu在pH為5.0條件下加入不同當(dāng)量銅離子的熒光光譜 圖。
[0032]附圖6為本發(fā)明的探針SiR-Cu在pH為5.0與7.4條件下選擇性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0033]附圖7為本發(fā)明的探針SiR-Cu對人正常肝細(xì)胞(L02)染色激光共聚焦熒光成像效 果圖。
[0034]附圖8為本發(fā)明的探針SiR-Cu對人肝癌細(xì)胞(HepG2)激光共聚焦熒光成像效果圖。 [0035]附圖7、附圖8中，（a)均表示激發(fā)光為633nm時(shí)激光共聚焦熒光成像效果圖；（b)均 表示激發(fā)光為488nm時(shí)激光共聚焦熒光成像效果圖；（c)均表示細(xì)胞明場效果圖；（d)均表示 (a)、（b)、（c)的疊加效果圖。
[0036] 附圖9為探針Rh-Cu在不同pH下激發(fā)波長540nm，檢測波長588nm熒光變化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0037]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明公開的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
[0038] 實(shí)施例1探針SiR-Cu的合成
[0039]
|_υυ4υ」 <土丄DDmL·加；^漢孤麗個(gè)，Λ?μ乂不斗Z_lNil2_blK 4UUmg , ZUmL Lil2L·丄2iij·用牛，然 力攪拌。將CSC12 402mg溶于20mL CH2C1沖，緩慢滴加到反應(yīng)瓶中，滴加完畢后，加入NaOH 140mg，冰浴下反應(yīng)并緩慢升至室溫，繼續(xù)反應(yīng)4小時(shí)。加入0.1M碳酸鈉水溶液，繼續(xù)反應(yīng)0.5 小時(shí)，CH2C1 2萃取三次，合并CH2C12層，用水洗滌兩次，飽和NaCl溶液洗滌一次，無水硫酸鈉 干燥，過濾，蒸干溶劑。固體用乙腈溶解，緩慢加入85 %水合肼1.06mL，室溫下反應(yīng)4小時(shí)，蒸 干溶劑，加入水50mL，CH2C12萃取三次，合并CH 2C12層，用水洗滌兩次，飽和NaCl溶液洗滌一 次，無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸干溶劑，硅膠柱層析，洗脫劑石油醚：乙酸乙酯=10:1，得探針 SiR-Cu。其核磁咕 NMR(300MHz，CDCl3)S0.50(s，3H)，0.53(s，3H)，1.13(t，12H，J = 7.2Hz)， 3.32(q，8H，J = 7.2Hz)，4.58(s，2H)，6.47-7.09(m，9H)，8.86(s，lH);13C NMR(75MHz，CDC13) δ-0·37，-0·10,12.66,44.10,72.55,113.30,113.48,114.50,123.34,127.23,129.94， 130.20，130.53，131.12，134.00，136.82，145.69，170.86;高分辨質(zhì)譜!1冊5化51)。&1。(^(^ C30H40N5SS1 [M+H]+: 530.2