一種高特異性dna水凝膠對鉛離子的檢測方法
【專利摘要】一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，包括如下步驟：步驟一，將顯色大分子包埋在對鉛離子響應(yīng)的高特異性DNA水凝膠結(jié)構(gòu)中；步驟二，鉛離子刺激水凝膠從而釋放出包埋于其中的顯色大分子；步驟三，根據(jù)不同濃度的含鉛樣品對水凝膠的瓦解程度不同的原理，從上清溶液中顯色大分子的顏色深淺實(shí)現(xiàn)對鉛離子的可視化檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法靈敏度高、選擇性好、檢測結(jié)果可靠，且成分低廉，檢測快速，具有廣泛推廣的可能性。
【專利說明】一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于可視化定量分析方法【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水凝膠是一類親水性的高分子聚合物，能夠在水環(huán)境下發(fā)生溶脹，依靠物理交聯(lián)或化學(xué)交聯(lián)兩種方式生成。凝膠結(jié)構(gòu)能夠響應(yīng)多種環(huán)境參數(shù)，如溫度、pH、離子強(qiáng)度和溶劑組成等，而發(fā)生改變，因而也被稱作“智能水凝膠”?；诟鞣N傳統(tǒng)意義上的水凝膠構(gòu)建的傳感器在響應(yīng)各種外界信號并發(fā)生性質(zhì)改變后，通常還要結(jié)合一些復(fù)雜、精密的儀器對特征變化進(jìn)行表征和記錄，這樣往往耗時費(fèi)力，不適合普及。DNA交聯(lián)水凝膠的出現(xiàn)，極大地擴(kuò)展了水凝膠傳感器的應(yīng)用范圍(1、Liu J, Liu H, Kang H, et.al., Aptamer-1ncorporatedhydrogels for visual detection，controlled drug release, and targeted cancertherapy[J].Anal Bioanal Chem(2012)402:187 - 194.)。
[0003]具有催化功能的DNA片段被稱為脫氧核酶(DNAzyme或者Deoxyribozymes)。自從1994年Breaker小組第一次發(fā)現(xiàn)這種具有催化功能的DNA片段以來,DNAzyme多種催化功能已被證實(shí)，目前發(fā)現(xiàn)DNAzyme的催化反應(yīng)包括磷酸化、RNA切割、光逆轉(zhuǎn)、DNA連接以及核肽的連接反應(yīng)。功能核酸分子功能的多樣性充分體現(xiàn)出來。脫氧核酶其中一個重要的性質(zhì)是往往依賴金屬離子的存在(如Pb2+、Cu2+、UO2+等)。(Juewen Liu, Zehui Cao, and YiLu, Functional Nucleic Acid Sensors [J].Chem.Rev.(2009) 109:1948 - 1998) ? 脫氧核酶在自由體系中會形成類似環(huán)型的二級結(jié)構(gòu)，在金屬離子的存在下，切割特定的識別位點(diǎn)，使RNA分子裂解。分析化學(xué)工作者利用這一性質(zhì)，將脫氧核酶開發(fā)成能夠檢測金屬離子的生物傳感器。應(yīng)用目的則相對專一，主要是檢測和分析(Tian Lan, Kimberly Furuyab, YiLu，A highly selective `lead sensor based on a classic lead DNAzyme.Chem.Commun.(2010)46:3896 - 3898)。
[0004]傳統(tǒng)方法利用大型儀器如電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)，原子吸收光譜儀(AAS)等實(shí)現(xiàn)對鉛離子的檢測，花費(fèi)較大，且需要復(fù)雜的樣品制備過程。
[0005]即時診斷是近年來日漸成熟的一項診斷技術(shù)。所謂即時診斷(Point of CareTest, POC Test)，是指在病人身旁迅速獲得檢測結(jié)果。該技術(shù)方便、快捷，不依賴昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備或者專業(yè)的技術(shù)人員，亦不需借助復(fù)雜的樣品處理步驟，依靠簡單的設(shè)備讀出信號或者通過觀測試紙上條紋、斑點(diǎn)等的顏色變化來反映檢測結(jié)果。除應(yīng)用于醫(yī)院、診所中迅速獲取病人信息外，即時診斷使疫情早期預(yù)警、家庭保健防護(hù)、貧困地區(qū)醫(yī)療乃至食物、水、環(huán)境等的現(xiàn)場監(jiān)測等成為可能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中檢測鉛離子的手段復(fù)雜、價格昂貴等問題，提供一種快速、靈敏的高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法。[0007]本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
[0008]一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，包括如下步驟:
[0009]步驟一，將顯色大分子包埋在對鉛離子響應(yīng)的高特異性DNA水凝膠結(jié)構(gòu)中；
[0010]步驟二，鉛離子刺激水凝膠從而釋放出包埋于其中的顯色大分子；
[0011]步驟三，根據(jù)不同濃度的含鉛樣品對水凝膠的瓦解程度不同的原理，從上清溶液中顯色大分子的顏色深淺實(shí)現(xiàn)對鉛離子的可視化檢測；
[0012]步驟四，拍照分析或者利用微量紫外-可見光譜儀測定上清溶液吸收，從而定量測定樣品中鉛離子濃度。
[0013]優(yōu)選地，所述顯色大分子為金納米粒子。優(yōu)選地，所述金納米粒子的粒徑為13nm。優(yōu)選地，所述金納米粒子在水凝膠中濃度為30-300nM。
[0014]優(yōu)選地，所述水凝膠中，各DNA鏈的終濃度為50 μ
[0015]優(yōu)選地，所述水凝膠與含鉛樣品的體積比為1:4-6。
[0016]優(yōu)選地,所述水凝膠與含鉛樣品的反應(yīng)時間為30min_3hr。
[0017]所述水凝膠的制備方法為:將兩條丙烯酰胺-DNA高聚鏈、一條脫氧核酶底物鏈、一條脫氧核酶酶鏈與顯色大分子混合制得。比如，采用金納米粒子時，制備的水凝膠中DNA鏈的濃度為120 μ M: 120 μ M:60 μ M:120 μ M，金納米粒子濃度為IOOnM0
[0018]由上述對本發(fā)明的描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法靈敏度高、選擇性好、檢測結(jié)果可靠，且成分低廉，檢測快速，具有廣泛推廣的可能性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為丙烯酸亞磷酰胺單體合成路線。
[0020]圖2為不同濃度鉛離子對水凝膠的響應(yīng)情況及相應(yīng)的上清樣品紫外可見吸收與鉛離子濃度的對應(yīng)關(guān)系。DNA水凝膠解膠實(shí)驗(yàn)在HEPES緩沖液(25mM HEPES, 300mMNaCl, pH7)中于30°C，150rpm反應(yīng)2.5hr。相機(jī)拍照，收集反應(yīng)上清液，在微量可見紫外光譜儀上測其吸收，并作出不同濃度響應(yīng)柱狀圖。
[0021]圖3為鉛離子響應(yīng)水凝膠對不同離子的響應(yīng)情況對比。其中鉛離子濃度為I μ Μ,其它離子濃度為1禮，為鉛離子濃度的1000倍。DNA水凝膠解膠實(shí)驗(yàn)在HEPES緩沖液(25mMHEPES, 300mM NaCl, pH7)中于30°C，150rpm反應(yīng)lhr。相機(jī)拍照，收集反應(yīng)上清液，在微量可見-紫外光譜儀上測其吸收，并作出不同離子響應(yīng)柱狀圖。
[0022]圖4為實(shí)測含鉛的海水樣，用標(biāo)準(zhǔn)樣(含0nM，10nM鉛離子)與之對比，發(fā)現(xiàn)其濃度略大于ΙΟηΜ，這與用大型儀器(ICP-MS)測得的結(jié)果相符(其測得的結(jié)果為20nM)。DNA水凝膠解膠實(shí)驗(yàn)在 HEPES 緩沖液(25mM HEPES, 300mM NaCl, pH7)中于 30°C，150rpm 反應(yīng) 2.5hr。相機(jī)拍照，收集反應(yīng)上清液，在微量可見紫外光譜儀上測其吸收，并作出不同離子響應(yīng)柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下通過【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0024]一、丙烯酸亞磷酰胺單體的合成[0025]丙烯酸亞磷酰胺單體的合成分為三個步驟:1)將6-氨基-1-己醇(lg，8.53mmol),三乙胺(2.36mL,17mmol)加入IOOmL 二氯甲烷中冰浴，在無水無氧條件下逐滴加入甲基丙烯酰氯(2.67g，2.55mmol)，之后整個體系在室溫條件下攪拌反應(yīng)2小時。2)將溶劑旋干，向產(chǎn)物中加入10mT-乙醇和15%Na0H (4mL)將產(chǎn)物選擇性水解成N-(6_hydroxyhexyl)methacrylamide ο 將 N-(6-hydroxyhexyl) methacrylamide 用乙酸乙酯在娃膠柱分離之后進(jìn)行下一步反應(yīng)。3)將純化后的 N-(6-hydroxyhexyl)methacrylamide (0.50g, 2.70mmol)溶于IOmL無水二氯甲烷中，在0°C條件下逐滴加入N，N-二異丙基乙胺(DIPEA，0.98g，
7.5mmol)，再逐滴加入2-氰乙基N，N-二異丙基氯代亞磷酰胺(0.87ml, 3.25mmol)，在室溫反應(yīng)2小時。將溶劑旋干后，將產(chǎn)物用乙酸乙酯:石油醚:三乙胺40:60:3的洗脫液在硅膠柱上洗脫。得到的終產(chǎn)物為無色油狀液體。終產(chǎn)物的核磁表征數(shù)據(jù)如下=1H NMR(⑶Cl3): δ5.92 (br, 1H)，5.63 (m, 1H)，5.27 (m.1 H)，3.86-3.72 (m, 2H)，3.66-3.49 (m, 4H)，3.30-3.23 (m，2H)，2.61 (t, 2H)，1.92 (m, 3H)，1.58-1.50 (m, 4H) 1.37-1.32 (m, 4H) 1.17-1.13 (m, 12H).13CNMR(CDCl3): δ 168.6，140.4，119.3，118.0, 63.8，63.6，58.6，58.3，43.2，43.1, 39.8，31.3，29.7，26.8，25.8，24.9，24.8，24.7，19.0.31P(CDC13): δ 148。
[0026]二、甲基丙烯基團(tuán)修飾的核酸分子的合成與純化
[0027]以普通CPG作為固相載體，以DNA單體堿基為原料，在DNA合成儀上由3'端向5'端合成鏈Α、鏈B及l(fā)inker核酸適體,最后在兩條鏈A和B的5'端修飾上前節(jié)中合成的丙烯酸亞磷酰胺單體。具體合成的序列見表I。合成結(jié)束后，將上述CPG轉(zhuǎn)移至2ml潔凈滅菌的Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺:氨水=1:1的溶液,在65°C下氨解30min,使DNA從CPG上切割下來。氨解完畢后提取上清，并用少量超純水清洗CPG，合并上清。向體系中加入2.5倍體積的冰凍無水乙醇和0.1倍體積的3mol/L NaCl，于_20°C冰箱進(jìn)行酒精沉淀30min。酒精沉淀完畢后，在14000rpm的轉(zhuǎn)速下離心lOmin，棄上清。將得到的粗產(chǎn)物溶解在0.lmol/L的醋酸三乙胺(TEAA)中，使用反相高效液相色譜儀進(jìn)行純化。將通過反相-HPLC純化后的產(chǎn)品進(jìn)行真空干燥，溶于超純水后使用凝膠過濾柱進(jìn)行脫鹽處理。使用紫外-可見分光光度計測定260nm處核酸的吸光度，根據(jù)DNA的消光系數(shù)計算出其相應(yīng)的物質(zhì)的量和濃度值。定量后真空濃縮。
[0028]三、水凝膠的制備
[0029]將鏈A和鏈B分別溶解在超純水中配制成高濃度DNA儲存液。分別配制10%的過硫酸銨和5%的TEMED，即0.05g過硫酸銨溶解至0.5ml超純水和25 μ I TEMED溶解于
0.5ml超純水。將DNA與終濃度為4%的丙烯酰胺配成混合液，放入真空干燥器中抽真空除氣IOmin。加入終濃度為0.14%的新鮮配制的引發(fā)劑(過硫酸銨)和0.07%加速劑(TEMED)，混勻后將反應(yīng)體系置于真空干燥器中，30°C條件下抽真空反應(yīng)15min，得到鏈A和鏈B的線狀高分子聚合產(chǎn)物PS-A、PS-B。將PS-A與PS-B按照1:1混合后，加入反應(yīng)緩沖液(25mMHEPES, 300mM NaCl, pH7)，之后加入金納米顆粒，再加入脫氧核酶底物鏈及酶鏈，保證終濃度PS-A = PS-B:脫氧核酶底物鏈:脫氧核酶酶鏈濃度比為1:1:0.5:1。重復(fù)振蕩、加熱步驟，直至得到均勻包裹有金納米顆粒的三維交聯(lián)水凝膠。上述反應(yīng)在干浴器中進(jìn)行，加熱步驟在65°C保持5min，最后自然冷卻至室溫。
[0030]四、DNA水凝膠可視化定量檢測步驟
[0031]使用前用超純水將水凝膠清洗3次，并除去殘留的緩沖液。檢測時，上層加入不同樣品，將離心管轉(zhuǎn)移至搖床上，于30°C，150rpm的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行充分反應(yīng)。最終拍照記錄，并用微量紫外可見吸收光譜儀測上清吸收。
[0032]表一【具體實(shí)施方式】中所用DNA序列
【權(quán)利要求】
1.一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，其特征在于包括如下步驟: 步驟一，將顯色大分子包埋在對鉛離子響應(yīng)的高特異性DNA水凝膠結(jié)構(gòu)中； 步驟二，鉛離子刺激水凝膠從而釋放出包埋于其中的顯色大分子； 步驟三，根據(jù)不同濃度的含鉛樣品對水凝膠的瓦解程度不同的原理，從上清溶液中顯色大分子的顏色深淺實(shí)現(xiàn)對鉛離子的可視化檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，其特征在于:還包括步驟四，拍照分析或者利用微量紫外-可見光譜儀測定上清溶液吸收，從而定量測定樣品中鉛離子濃度。
3.如權(quán)利要求1所述的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，其特征在于:所述顯色大分子為金納米粒子。
4.如權(quán)利要求3所述的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，其特征在于:所述金納米粒子的粒徑為13nm。
5.如權(quán)利要求3所述的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，其特征在于:所述金納米粒子在水凝膠中濃度為30-300nM。
6.如權(quán)利要求1所述的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，其特征在于:所述水凝膠中，各DNA鏈的終濃度為50 μ M-1mM。
7.如權(quán)利要求1所述的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，其特征在于:所述水凝膠與含鉛樣品的體積比為1:4-6。
8.如權(quán)利要求1所述的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，其特征在于:所述水凝膠與含鉛樣品的反應(yīng)時間為30min-3hr。
9.如權(quán)利要求1所述的一種高特異性DNA水凝膠對鉛離子的檢測方法，其特征在于所述水凝膠的制備方法為:將兩條丙烯酰胺-DNA高聚鏈、一條脫氧核酶底物鏈、一條脫氧核酶酶鏈與顯色大分子混合制得。
【文檔編號】G01N21/33GK103852436SQ201410096353
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】楊朝勇, 黃藝順, 張惠敏, 馬艷麗, 朱志 申請人:廈門大學(xué)