用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料組合物、染液及染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物組織染色領(lǐng)域，具體涉及一種用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染 料組合物、染液及染色方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 尼氏體(Nissl body)發(fā)現(xiàn)者是神經(jīng)解剖學(xué)家Framz Nissl氏（1860~1919)，他在 1892年首次使用甲苯胺藍(lán)染出了以他本人的名字命名的小體并對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察到尼氏小 體呈現(xiàn)出深藍(lán)色，它具有強(qiáng)嗜堿性，均勻分布。在大神經(jīng)元中，如脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中，呈粗大 的斑塊狀;而在小神經(jīng)元里，如神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)元，呈細(xì)顆粒狀。在電鏡下，尼氏體由發(fā)達(dá)的 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體構(gòu)成，表明神經(jīng)元具有活躍的蛋白質(zhì)合成功能，主要合成更新細(xì) 胞器所需要的結(jié)構(gòu)蛋白、合成神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶類以及肽類的神經(jīng)遞質(zhì)。
[0003] 尼氏（Nissl)染色法是應(yīng)用堿性染料顯示神經(jīng)元的一種常規(guī)方法，廣泛應(yīng)用于腦 內(nèi)核團(tuán)的定位、核團(tuán)內(nèi)神經(jīng)元的類型、分布和計(jì)量學(xué)分析，它對(duì)于揭露機(jī)體神經(jīng)細(xì)胞狀況的 判定具有重大參考價(jià)值。選用Pischinger氏法作標(biāo)準(zhǔn)方法，為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組對(duì)貓脊髓進(jìn)行尼 氏體染色，它的基本程序?yàn)?組織切片-梯度酒精脫蠟至水-入染液lOmin-0.2M醋酸緩沖 液(PH4.6)分化1~3min-顯微鏡下觀察到尼氏體清晰為止-5%鉬酸銨液處理3~5min- 蒸餾水洗-常規(guī)脫水透明-中性樹(shù)膠封固-結(jié)果觀察-攝片、圖像與分析。它可以顯示出 神經(jīng)細(xì)胞的分布情況以及對(duì)確定神經(jīng)細(xì)胞的類型。同時(shí)，對(duì)研究神經(jīng)細(xì)胞在生理或病理狀 態(tài)下的形態(tài)變化有一定的價(jià)值。因此，尼氏染色法已成為對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的顯微結(jié)構(gòu)研究 中的四大主要方法之一，近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)一直為科學(xué)家們普遍采用。其目的是為了探索和 開(kāi)發(fā)具有新結(jié)構(gòu)、新靶標(biāo)的染色劑。
[0004] 因此，要完美與清晰的顯示出神經(jīng)組織中尼氏體的染色除選擇優(yōu)良的試劑以外， 還要不斷的創(chuàng)新，改變?nèi)玖戏肿拥男再|(zhì)，才能獲得更好的染色效果，才有利于更好的為醫(yī)學(xué) 教學(xué)與科學(xué)研究服務(wù)，同時(shí)也為研發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)新型染色技術(shù)提供了重要的線索和理論依 據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料組合物、染液及染色 方法，經(jīng)其染色后的動(dòng)物神經(jīng)組織切片的分辨率、美觀度和清晰度幾個(gè)方面均比傳統(tǒng)的 Pischinger氏染色方法以及其它幾種單種染色液染色方法的效果更好。
[0006] 為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的第一方面的技術(shù)方案是采用一種用于神經(jīng)組 織尼氏體染色的染料組合物，所述染料組合物由以下組分按重量份組成：1.〇重量份美藍(lán)和 0.8-1.0重量份硫堇;所述美藍(lán)的分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0008] 所述硫堇的分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0009] 優(yōu)選的，所述染料組合物由以下組分按重量份組成：1.0重量份美藍(lán)和1.0重量份 硫堇。
[0010] 另外，本發(fā)明提供的第二方面的技術(shù)方案為前述任一所述的染料組合物形成的神 經(jīng)細(xì)胞尼氏體染液，所述染液由美藍(lán)、硫堇、氯化鈉以及70 % -80 %的乙醇溶液組成，乙醇溶 液作為溶劑：
[0011] (1)質(zhì)量百分比為1 %或〇. 8 % -1 %的硫堇乙醇染色液；
[0012] (2)質(zhì)量百分比為1%的美藍(lán)乙醇染色液；
[0013] ⑶按硫堇乙醇染色液:美藍(lán)乙醇染色液:0.9%氯化鈉溶液的體積比為1:1:9進(jìn)行 配制成神經(jīng)組織尼氏體染液。
[0014] 另外，本發(fā)明提供的第三方面的技術(shù)方案為一種用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料 組合物，所述染料組合物由以下組分按重量份組成：1.〇重量份美藍(lán)、0.8-1.0重量份硫堇、 0. 1-0. 2重量份天青A和0. 1-0. 2重量份天青B;所述天青A的分子結(jié)構(gòu)式如下：
[0015] 所述天青B的分子結(jié)構(gòu)式如下
[0016] 優(yōu)選的，所述染料組合物由以下組分按重量份組成：1.0重量份美藍(lán)、1.0重量份硫 堇、0.1-0.2重量份天青A和0.1-0.2重量份天青B。
[0017] 另外，本發(fā)明提供的第四方面的技術(shù)方案為前述任一所述的染料組合物形成的神 經(jīng)組織尼氏體染液，所述染液由美藍(lán)、硫堇、氯化鈉以及70%_80%的乙醇溶液組成，乙醇溶 液作為溶劑：
[0018] (1)質(zhì)量百分比為1 %或0.8 % -1 %的硫堇乙醇染色液；
[0019] (2)質(zhì)量百分比為1%的美藍(lán)乙醇染色液；
[0020] (3)質(zhì)量百分比為0.1-0.2 %的天青A乙醇染色液；
[0021 ] (4)質(zhì)量百分比為0.1-0.2%的天青B乙醇染色液；
[0022] (5)按硫堇乙醇染色液：美藍(lán)乙醇染色液：天青A乙醇染色液：天青B乙醇染色液： 0.9%氯化鈉溶液的體積比為1:1:1:1:9進(jìn)行配制成神經(jīng)細(xì)胞尼氏體染液。
[0023] 另外，本發(fā)明提供的第五方面的技術(shù)方案為一種對(duì)神經(jīng)組織尼氏體染色的染色方 法，所述染色方法包括以下步驟：
[0024] 1)動(dòng)物組織用固定液固定20-24小時(shí)后干燥；
[0025] 2)放入權(quán)3或權(quán)6任一所述的染液進(jìn)行染色7-14天；
[0026] 3)固定處理20-24小時(shí)；
[0027] 4)乙醇分色與脫水、石蠟包埋切片。
[0028]優(yōu)選的，所述步驟1)中動(dòng)物組織為整塊的動(dòng)物神經(jīng)組織。
[0029] 11、優(yōu)選的，所述步驟1)中固定液由以下成分組成:冰醋酸、40 %甲醛溶液、70 %酒 精液按體積比為1:3:16。
[0030] 優(yōu)選的，所述步驟1)中干燥的方式為固定液固定所得動(dòng)物組織經(jīng)自然干燥后，再 放入1 %火棉膠液中處理，再次自然干燥。
[0031] 優(yōu)選的，所述步驟3)中固定處理為將步驟2)所得染色后動(dòng)物組織放入5%的鉬酸 銨水溶液中固定處理20-24小時(shí)。
[0032] 優(yōu)選的，所述步驟4)中所述乙醇為95%-100%乙醇溶液。
[0033] 本申請(qǐng)所述用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料組合物的基本說(shuō)明如下：
[0034] 本發(fā)明人通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的研制得出，本申請(qǐng)所述的染料組合物可以有效的對(duì)生物組 織進(jìn)行染色，經(jīng)其染色后的動(dòng)物神經(jīng)組織切片的分辨率、美觀度和清晰度幾個(gè)方面均比傳 統(tǒng)的Pischinger氏染色方法以及其它幾種單種染色液染色方法的效果更好。
【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1是經(jīng)1組硫堇染液染色之后對(duì)應(yīng)貓脊髓的顯微鏡下觀察得到的組織切片效果 顯示圖；
[0036] 圖2是經(jīng)2組美藍(lán)染液染色之后對(duì)應(yīng)貓脊髓的顯微鏡下觀察得到的組織切片效果 顯示圖；
[0037] 圖3是經(jīng)3組本發(fā)明所述染液染色之后對(duì)應(yīng)貓脊髓的顯微鏡下觀察得到的組織切 片效果顯示圖；
[0038] 圖4是1-4組染液染色14天后的貓脊髓組織切片的尼氏體平均灰度值。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì) 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0040] 下面將列舉一些與本申請(qǐng)相關(guān)的用于動(dòng)物神經(jīng)組織尼氏體染色的染液及其實(shí)施 步驟。
[0041] 實(shí)驗(yàn)步驟:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織樣品制備與分組
[0042] 選用健康成年家貓5只，體重1.5~2.0kg，用2%的戊巴比妥鈉（40mg/kg)腹腔麻 醉，固定采用自左心室通過(guò)靜脈套管快速灌注生理鹽水沖洗，待流出清亮液體后，灌注10 % 中性甲醛固定30分鐘，暴露脊髓頸、腰膨大，取其橫切長(zhǎng)為0.4~0.5cm的組織24塊，放入固 定液中固定20~24小時(shí)，其中固定液是由體積比為1:3:16的冰醋酸、40 %甲醛溶液、70 %酒 精液組成。再將所取組織隨機(jī)分成兩組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，3塊用于對(duì)照組，21塊用于實(shí)驗(yàn) 組。對(duì)照組用Pischinger氏美藍(lán)液染色(4組），實(shí)驗(yàn)組采用美藍(lán)染液(美藍(lán)質(zhì)量百分比濃度 為1 %的乙醇溶液，1組）、硫堇染液(硫堇質(zhì)量百分比濃度為1 %的乙醇溶液，2組）以及本發(fā) 明所述染液(3組)進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)組每種染液染色的組織各7塊。分別經(jīng)染色7天、10天、14天 后，取出放95%的酒精30min，100%的酒精各lh，二甲苯15min，入軟蠟2h，入硬蠟2h，硬蠟包 埋，烘干24~48小時(shí)，切片厚5um;展片后，經(jīng)二甲苯脫蠟，中性樹(shù)膠封片;結(jié)果經(jīng)顯微鏡觀察 與分析。
[0043]尼氏體判斷的意義
[0044]尼氏體是神經(jīng)細(xì)胞中所特有的結(jié)構(gòu)，它是位于胞體和樹(shù)突(軸丘和軸突除外）內(nèi)的 嗜堿性物質(zhì)，呈大小不等的塊狀或顆粒狀;它的主要化學(xué)成分是核糖核酸和蛋白質(zhì)，常稱為 核蛋白體，是蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所；它的形態(tài)與大小，在不同的神經(jīng)元內(nèi)表現(xiàn)不同，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞 受到損傷時(shí)，尼氏體會(huì)顯著減少甚至消失;它的形態(tài)、大小在各種不同的染色液中和不同的 生理機(jī)能狀態(tài)下的同一種神經(jīng)細(xì)胞都有所不同，這反映了染色液對(duì)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的著色程度 有變化，例如細(xì)胞體未壞死，則溶解的尼氏體可以重現(xiàn)，胞體代謝也可逐漸恢復(fù)，它的數(shù)量 和分布的改變可以作為判斷神經(jīng)細(xì)胞病變程度或藥物治療療效的良好指標(biāo)。
[0045]細(xì)胞形態(tài)特征的染色的結(jié)果
[0046]經(jīng)1~4組染液染色對(duì)應(yīng)的組織樣品所對(duì)應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞的染色的結(jié)果，在顯微鏡下觀 察切片的染色效果和尼氏體以及細(xì)胞形態(tài)的保存情況并分別作了比較，在1、2和4組可觀察 到在組織染色效果和尼氏體以及細(xì)胞形態(tài)的保持都無(wú)較大區(qū)別，而在3組對(duì)尼氏體以及細(xì) 胞形態(tài)染色與保持方面的合格指數(shù)值更高，即尼氏體著色呈紫蘭色，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色 更鮮艷。經(jīng)過(guò)1~4組染液染色以后相對(duì)應(yīng)的組織樣品以及它們的神經(jīng)細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的染色結(jié) 果(見(jiàn)表1)。
[0047] 表1在1~4組染液染色對(duì)應(yīng)的組織樣品所對(duì)應(yīng)神經(jīng)細(xì)胞的染色質(zhì)量指數(shù)表
[0048]
[0049] 上述實(shí)驗(yàn)中經(jīng)1組硫堇染液染色、2組美藍(lán)染液染色、3組本發(fā)明所述染液染色之 后，對(duì)應(yīng)貓脊髓的顯微鏡下觀察得到的組織切片效果顯示圖，可參見(jiàn)附圖1~3所示。
[0050] 圖像分析
[0051] 應(yīng)用平均灰度質(zhì)對(duì)尼氏體進(jìn)行定量方面的研究與分析，由于尼氏體數(shù)量的多少在 圖像分析中用平均灰度和面積（％)來(lái)表示。而經(jīng)尼氏染色獲得的數(shù)據(jù)處理需借助于圖像處 理技術(shù)，其中，平均灰度在圖像分布中表示圖像的透光率，分為256級(jí)，最暗為0級(jí)，最亮為 256級(jí)。其中尼氏體平均灰度質(zhì)越低，說(shuō)明了染色越深，即細(xì)胞內(nèi)尼氏體含量就越高。為此， 可知尼氏體的平均灰度值與細(xì)胞內(nèi)尼氏體含量的關(guān)系，即平均灰度質(zhì)越低，其細(xì)胞內(nèi)尼氏 體含量越高，也可見(jiàn)平均灰度質(zhì)和尼氏體染色深度成反比；在圖像上灰度的深淺也反映了 各部分尼氏體顏色的深淺程度以及含量的多少，若染色獲得的切片標(biāo)本顏色越淺，卻灰度 的值反而出現(xiàn)越高的現(xiàn)象。
[0052] 數(shù)據(jù)處理
[0053] 所有測(cè)定值以平均值上標(biāo)準(zhǔn)差表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義通過(guò)Microsoft Excel5 .Ofor widows電子表格軟件中的F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，P值〈0.05為具有顯著性差異。應(yīng)用 Luzed-F型圖像分析系統(tǒng)，對(duì)脊髓染色的切片在20倍物鏡下隨機(jī)抽樣測(cè)定30