基于羅丹明的水溶性汞離子熒光探針的制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于羅丹明的水溶性汞離子熒光探針的制備方法和應(yīng)用，該Hg2+熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：，該探針是由1,2,4?偏苯三酸酐、3?二乙氨基苯酚和水合肼為原料合成的。本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)簡單的基于羅丹明衍生物水溶性Hg2+熒光探針的制備方法，這是第一個(gè)用羅丹明內(nèi)酰胺衍生物實(shí)現(xiàn)100%水溶液中對Hg2+檢測的熒光探針。在這個(gè)體系中，Hg2+誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，對Hg2+檢測表現(xiàn)出很高的靈敏度。該熒光探針對Hg2+表現(xiàn)出很好的選擇性，幾乎不受其他陽離子的干擾。當(dāng)pH值在5.0到8.0之間時(shí)，不影響熒光探針對Hg2+的測定，該熒光探針與Hg2+作用迅速，響應(yīng)時(shí)間在3分鐘以內(nèi)。此外，該探針還可以應(yīng)用于環(huán)境水樣中Hg2+的測定以及生物細(xì)胞中Hg2+的熒光成像。
【專利說明】
基于羅丹明的水溶性汞離子熒光探針的制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基于羅丹明衍生物水溶性Hg2+熒光探針 的制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 汞離子作為危害極大的環(huán)境污染物之一，廣泛分布在空氣、水以及土壤中，它可以 在環(huán)境中不斷積累，會被細(xì)菌轉(zhuǎn)化為親脂性的甲基汞，通過食物鏈進(jìn)入生物體和人體(文獻(xiàn) 1 :D.W.Boening，Chemosphere ,2000,40，1335-1351 ·)。而且，萊離子能夠很容易地穿過生物 細(xì)胞膜（文獻(xiàn)2: X · Zhang，Y · Xiao，X · Qian，Angew · Chem · Int · Ed ·，2008，47，8025-8029 ·)，能 與蛋白質(zhì)中的疏基結(jié)合（文獻(xiàn)3 :M.Harada，Crit .Rev. Toxicol.，1995,25，1-24.)，會對大 腦、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損傷（文獻(xiàn)4 : Y · Zhou，C · -Y · Zhu，X · -S · Gao，X · -Y · You， C. Yao，Org. Lett. 2010，12，2566-2569.)。我國《重金屬污染綜合防治"十二五"規(guī)劃》已經(jīng)將 汞的污染及其綜合防治列入重點(diǎn)領(lǐng)域。因此，開發(fā)環(huán)境以及生物體系中汞離子的檢測方法 具有重要的價(jià)值和意義。
[0003] 現(xiàn)有測定汞離子的方法主要是原子吸收法、原子發(fā)射法、原子熒光法、電感耦合等 離子體法，這些方法雖各具優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定弊端，如需要相對復(fù)雜的儀器和操作熟練的 技術(shù)人員，并且檢測費(fèi)用高昂，操作繁瑣，靈敏度不高；熒光探針相比其它檢測方法具有響 應(yīng)快，分子制備簡單，使用簡便，靈敏度高等特點(diǎn)，是檢測重金屬離子的有效手段。最近幾 年，能夠在水溶液中識別檢測汞離子的熒光探針由于可應(yīng)用到生物細(xì)胞內(nèi)的汞離子檢測， 因而引起人們極大的興趣和重視。設(shè)計(jì)合成高靈敏、高選擇性且可在水溶液中檢測汞離子 的熒光探針備受人們關(guān)注。
[0004]最近，許多測Hg2+的熒光探針已被報(bào)道，它們分別基于不同熒光團(tuán)，如香豆素(文獻(xiàn) 5 :M.G·Choi，Y.H.Kim，J.E.Namgoong，S·-K. Chang,Chem.Commun. 2009，3560-3562;文獻(xiàn)6: K · Tsukamoto，Y · Shinohara，S · Iwasaki，Η·Maeda，Chem· Commun · 2011，47，5073-5075;文南犬 7: Y.-S· Cho，Κ·H. Ahn，Tetrahedron Lett .2010,51，3852-3854;文獻(xiàn)8: W. Jiang，W.Wang, Chem.Commun.2009,3913-3915.)，喹啉（文獻(xiàn)9:H.Jiang，W.Luo，J.Jiang，X.Jin，W.Dou， X. Tang，L.Yang，C.Chen，Z.Ju，X.Yao，W.Liu，Sen.Actuators，B 2014,204,68_73·)，焚光素 (文獻(xiàn) l〇:M.G.Choi，D.H.Ryu，H.L. Jeon，S.Cha，J.Cho，H.H.Joo，K.S.Hong，C.Lee，S.Ahn， S · -K · Chang，Org · Let · 2008，10，3717-3720 ·)，苯并二唑（文獻(xiàn)11: S · Sumiya，T · Sugi i， Y. Shiraishi，T.Hirai，J.Photochem.Photobiol .A 2011,219,154-158.)，芘（文獻(xiàn) 12: S.M.Park,M.H.KimJ.-I.Choe,K.T.No,S.-K.Chang,J.Org.Chem.2007,72,3550-3553.), 吩噻嗪（文獻(xiàn)13:]?.1^1^，]\^.〇1〇,0.!1.〇1〇丨，〇768?丨8111.2016，125，1-7.)，鄰苯二甲酰亞胺 (文獻(xiàn) 14 :B.Leng，J. Jiang,H.Tian，AIChE J. 2010,56,2957-2964·)，氟硼吡咯（文獻(xiàn) 15: X · Zhang，Y · Xu，P · Guo，X · Qian，New J · Chem · 2012，36，162卜 1625 ;文獻(xiàn)16 : T · K · Khan， 皿.1^￥11?111讓，〇768?18111.2012,95,89-95.)，苯三唑（文獻(xiàn)17:!1.1^11，￥.51^，￥.1^&11]\^1， L.Xu，J.Ma，Y.Hui，Z.Xie，J.Lumin. 2015,157,280-284.)，蒽（文獻(xiàn) 18 :G.Zhang，D. Zhang, S.Yin,X.Yang，Z.aiuai，D.Zhu，Chem.Commun.2005,16,216卜2163.)，花菁（文獻(xiàn) 19:Z.Zhu, W.Zhu，M.Zhu，X.Wu，H.Tian，Chem.Eur.J. 2010,16,14424-14432·)。然而，大部分這些熒光 探針存在一些局限如水溶性不好，發(fā)射波長短(低于500nm)、熒光淬滅、對離子的選擇性不 好、沒有應(yīng)用到生物系統(tǒng)中。因此，開發(fā)一個(gè)能在100%水溶液中檢測Hg 2+性能優(yōu)良的熒光增 強(qiáng)型熒光探針很有必要。
[0005] 自〇2&1'1111<:等人的先驅(qū)工作以來（文獻(xiàn)20:￥.〇11」〇18，？.卩(^(1，厶.1〇2&1'1111<:， J. Am. Chem.Soc. 1997,119,7386-7387.)，基于羅丹明內(nèi)酰胺的熒光分子探針已引起廣泛的 注意。因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，許多基于羅丹明衍生物作為"關(guān)/開"型的熒光探針已被報(bào) 道出來（文獻(xiàn) 21 :X. Chen，T.Pradhan，F(xiàn). Wang, J.S.Kim，J. Yoon，Chem.Rev. 2012,112,1910-1956;文獻(xiàn) 22 :H.N.Kim，M.H.Lee，H.J.Kim，J.S.Kim，J. Yoon，Chem.Soc. Rev. 2008,37,1465-1472.)。我們都知道，羅丹明以螺內(nèi)酰胺環(huán)的形式存在是無熒光的，與目標(biāo)物結(jié)合后導(dǎo)致開 環(huán)，此時(shí)的羅丹明表現(xiàn)出強(qiáng)烈的熒光發(fā)射及可見光吸收，結(jié)果表現(xiàn)出熒光和物質(zhì)顏色的變 化。而且，羅丹明有一個(gè)長的發(fā)射波長(高于500nm)，對于檢測對象，該熒光團(tuán)可以有效避開 來自背景熒光的干擾（文獻(xiàn) 23:J.Wu，H.J.Kim，M.H.Lee，J.H.Yoon，J.H.Lee，J.S.Kim， Tetrahedron Lett.2007,48 3159-3162)。目前，許多基于羅丹明的測汞離子的熒光探針已 被報(bào)道（文獻(xiàn) 24: J.-S.Wu，I.-C.Hwang，K.S.Kim，J.S.Kim，Org.Lett. 2007,9,907-910;文獻(xiàn) 25:P.Xi,L.Huang,H.Liu,P.Jia,F.Chen,M.Xu,Z.Zeng,J.Biol.Inorg.Chem.2009,14,815-819;文獻(xiàn) 26: J.Du，J.Fan，X.Peng，P. Sun, J.Wang，H.Li，S.Su，0rg.Lett. 2010,12,476-479; 文獻(xiàn)27:Y.-K.Yang,K.-J.Yook，J·Tae，J.Am.Chem.Soc. ,2005,127,16760-16761;文獻(xiàn)28: W.Lin，X. Gao，Y.Ding，L. Yuan，L · Long，Chem · Commun .2010,46,3529-3531;文獻(xiàn) 29: A.B.Rode,J.Kim,S.-H.Kim,G.Gupta, I.S.Hong,Tetrahedron Lett.2012,53,2571-2574； 文獻(xiàn)30 :A. Jana，J. SS· Jung，P·K.Bharadwaj，Chem. Commun· 2009,4417-4419)。然 而，它們需要在有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑-水溶液中進(jìn)行，這大大限制了它們在生理環(huán)境中的實(shí) 際應(yīng)用。因此合成一個(gè)基于羅丹明類能在100%水溶液中高選擇性、高靈敏地檢測Hg 2+的熒 光分子探針具有重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，本發(fā)明人對此進(jìn)行了深入研究，在付出了大量創(chuàng)造 性勞動(dòng)后，提供了一種高靈敏度，高選擇性的基于羅丹明衍生物結(jié)構(gòu)新穎的水溶性Hg 2+熒光 探針。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是，一種基于羅丹明衍生物的Hg2+熒光探針，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0009] 一種基于羅丹明衍生物的Hg2+熒光探針的制備方法。步驟如下：1)將1，2,4_偏苯三 酸酐和3-二乙氨基苯酚按摩爾比1:1.9~1:2.2混合于N，N-二甲基甲酰胺溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù) 下，磁力攪拌回流5~7小時(shí)，停止反應(yīng);反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用二氯甲烷和水進(jìn)行萃 取，合并有機(jī)層并減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲烷/甲醇(體積比為8:1~5:1)為洗脫 劑柱層析分離得紅色固體(5-羧基羅丹明幻。2)將5-羧基羅丹明B和80%水合肼按摩爾比1: 6~1:4混合于無水甲醇溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，60~80°C下磁力攪拌回流18~24小時(shí);減壓蒸 餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲烷/甲醇(體積比為15:1~10:1)為洗脫劑柱層析分離得白色 固體(探針1)。
[0010] -種基于羅丹明衍生物的熒光探針的性能研究。首先，研究了該探針的熒光光譜 性質(zhì)，加入Hg2+之前，熒光探針沒有羅丹明的熒光發(fā)射峰，說明探針分子處于內(nèi)酰胺閉環(huán)結(jié) 構(gòu)；隨著Hg 2+的加入，在573nm處出現(xiàn)了羅丹明的最大發(fā)射峰，并且隨著Hg2+濃度的增大，探 針分子的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，當(dāng)加入1當(dāng)量的Hg 2+時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)42倍，說明該探針可以高 靈敏的對Hg2+進(jìn)行檢測。其次，還研究了探針的紫外吸收光譜，在沒有加入Hg 2+時(shí)，探針在 555nm處沒有吸收帶，加入Hg2+之后，在555nm處出現(xiàn)吸收峰，并且隨著Hg 2+濃度增加，吸光度 增大，同時(shí)伴隨著溶液從無色變成粉紅色。接著，研究了探針對陽離子的選擇性，檢測了探 針與 Hg2+，Na+，K+，Mg2+，Ba2+，Al3+，Zn 2+，Cd2+，Cr3+，Mn2+，F(xiàn)e3+，Co 2+，Ni2+，Ag+，Pd2+，Pb2+，Cu 2+的 熒光響應(yīng)情況。加入Hg2+，在573nm處出現(xiàn)一個(gè)很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，而相同的條件下加入其他 的陽離子，熒光強(qiáng)度除了Cu 2+有較小程度的增加外，其它陽離子都沒有明顯的改變。進(jìn)一步 研究發(fā)現(xiàn)在汞離子的存在下，其他的陽離子幾乎沒有對探針的熒光性能產(chǎn)生影響。由此可 見，熒光探針對Hg 2+有較好的選擇性。最后，研究了pH值對熒光探針測定Hg2+的影響和熒光 探針對Hg 2+的響應(yīng)時(shí)間，當(dāng)pH值在5.0到8.0之間時(shí)，不影響熒光探針對Hg2+的測定。該熒光 探針響應(yīng)迅速，響應(yīng)時(shí)間在3分鐘以內(nèi)。
[0011] -種基于羅丹明衍生物的熒光探針的應(yīng)用。熒光探針1已成功應(yīng)用于實(shí)際水樣中 對Hg2+的定量檢測以及對Hg2+的生物細(xì)胞成像。
【附圖說明】
[0012]圖1為Hg2+焚光探針的合成路線。
[0013]圖2為Hg2+熒光探針與不同濃度的Hg2+作用后的熒光光譜圖。
[0014]橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。Hg2+熒光探針的濃度為10yM，Hg2+濃度分別為： 0，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,20 ·0μΜ。熒光激發(fā)波長為 520nm。插圖為探針對Hg2+濃度的線性響應(yīng)圖。
[0015] 圖3為Hg2+焚光探針與Hg2+作用前后的日光燈和熒光燈下顏色變化以及結(jié)構(gòu)變化 圖。
[0016] 圖4為Hg2+熒光探針與不同濃度的Hg2+作用后的紫外可見吸收光譜圖。
[0017]橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為吸光度。熒光探針的濃度為10yM，Hg2+濃度分別為:0，0.5， 1·0,2·0,4·0,6·0,8·0，10·0μΜ〇
[0018] 圖5為Hg2+熒光探針的選擇性圖。Fo和F表示探針溶液加入金屬離子前后的熒光強(qiáng) 度。黑色柱表示探針溶液在空白或加入各種陽離子后的熒光變化情況，白色柱表示探針溶 液在加入汞離子后，又加入各種陽離子的熒光變化情況。
[0019] 圖6為pH對Hg2+熒光探針的影響圖。
[0020] 圖7為熒光探針在不同Hg2+濃度下(0.5，2.0，5.0，8. ΟμΜ)，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的 關(guān)系曲線圖。
[0021] 圖8為熒光探針的細(xì)胞毒性試驗(yàn)。橫坐標(biāo)為熒光探針的濃度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞的存活 率。
[0022] 圖9為熒光探針的細(xì)胞成像圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不限于此。
[0024] 實(shí)施例1:
[0025] 5-羧基羅丹明B(2)的合成:在含有50mL N，N-二甲基甲酰胺的100mL圓底燒瓶中加 入1,2,4-偏苯三酸酐（1.92g, lOmmol)和3-二乙氨基苯酸（3.30g，20mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，磁 力攪拌回流6小時(shí)，停止反應(yīng);反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，加入二次蒸餾水(200mL)，充分?jǐn)?拌后，用二氯甲烷(100mLX3)進(jìn)行萃取，合并有機(jī)層并減壓蒸餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲 烷/甲醇為6 :1 (體積比）的洗脫劑柱層析分離得紅色固體2(0.419g，產(chǎn)率:8.6% )。咕匪R (400MHz，CD30D)S8 · 19(d，J = 8 ·0Ηζ，1H)，8.08((1, J = 8.0Hz，lH)，7.80(s，lH)，7.28((1, J = 8.0Hz,2H) ,6.98(d,J = 8.0Hz, 2H) ,6.89( s,2H) ,3.64(d,J = 8.0Hz, 8H) ,1.28( s,12H) ?13CNMR(100MHz，CD30D)S164.9，160.4，157.9，134.3，132.8，132.6，131.8，131.7，116·1, 115.9,98.1,47.7,13.9.MS(T0F)m/z 487.3.
[0026] Hg2+熒光探針的合成:化合物2(0.490g，1. OOmmol)溶解在50.0 mL無水甲醇中，攪拌 下滴加水合肼(〇. 30ml，5.25mmol)。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，磁力攪拌回流反應(yīng)混合物24小時(shí);減壓蒸 餾除去溶劑。粗產(chǎn)品用二氯甲烷/甲醇為10:1(體積比）的洗脫劑柱層析分離得白色固體(探 針1)(0.193g,產(chǎn)率：38.5% )</H NMR(400MHz，CD30D)S8.06(d，J = 8.0Hz，lH)，7.84((1, J = 8.0Hz，lH)，7.63(s，lH)，6.39-6.46(m，6H)，4.62(bs，2H)，3.60(q，J=8.0Hz，8H)，1.17(t，J = 8·0Ηζ，12Η).13C NMR(100MHz，CD30D)S163.9,153.9,152.1,149.0,130.6,129.0,127.4, 121.7,108.2,103.7,98.1,64.6,44.0,11.5.MS(T0F)m/z 501.4.Anal.calcd.for C29H32N4〇4(l):C,69.58；H,6.44；N,11.19；0,12.78.Found:C,69.56；H,6.45；N,ll.18；0, 12.80。結(jié)果表明，所得產(chǎn)物結(jié)構(gòu)正確。
[0027] 實(shí)施例2:
[0028]熒光探針1與Hg2+作用的溶液配制
[0029] 將一定量的熒光探針溶解在水中，得到濃度為1.0Xl(T4m〇l · I/1探針的備用溶 液。將一定量的硝酸汞溶解在水中，倒入500mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度線，得到濃度為 1.0Xl(T 3m〇l · I/1的Hg2+。將1.0Χ1〇Λιο1 · I/1的Hg2+水溶液用二次蒸餾水逐漸稀釋得到 1 · 0 X 10-4-1 · 0 X 10-Vol · L-1的Hg2+水溶液。將1 · OmL探針的備用溶液和1 · OmL的Hg2+水溶液 加入到10mL的容量瓶中，用緩沖溶液Tris-HN03定容，得到濃度為1 .ΟΧ ΙΟΛιοΙ · Γ1的熒光 探針和1.0 X 10_4-1.0 X 1〇Λιο1 · Γ1的Hg2+混合待測溶液。
[0030] 實(shí)施例3:
[0031]熒光探針1與Hg2+作用的熒光光譜性質(zhì)的測定
[0032] 以pH值為7.0的Tris-HN03緩沖溶液為溶劑用Perkin Elmer LS 55熒光分光光度 計(jì)測定了熒光探針與Hg2+作用的熒光光譜，結(jié)果如圖2。熒光探針的濃度為10yM，Hg2+的濃度 依次為0,0.3,0.5，1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0，10.0,20.(^]\1，激發(fā)波長固定 為520nm，發(fā)射波長范圍為530~650nm，狹縫寬度為5nm/5nm。加入Hg2+之前，熒光探針幾乎無 熒光，加入Hg2+后，在573nm處出現(xiàn)了羅丹明的發(fā)射峰，并且隨著Hg2+濃度的增大，探針分子 的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)，當(dāng)加入10. 〇μΜ的Hg2+時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)至未加入Hg2+時(shí)的42倍。如圖2 的插圖所示，熒光強(qiáng)度跟Hg 2+的濃度呈現(xiàn)線性關(guān)系，線性范圍是3.0ΧΠΓ7~1.0Χ10-5Μ，檢 測限是9.7 Χ10-8Μ。從圖3也可以看出，熒光探針與Hg2+作用之前，無色且沒有熒光發(fā)射，說 明探針分子處于內(nèi)酰胺閉環(huán)結(jié)構(gòu)；當(dāng)加入Hg 2+后，Hg2+誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán)，溶液變 成粉紅色且有強(qiáng)烈熒光發(fā)射。
[0033] 實(shí)施例4:
[0034]熒光探針1與Hg2+作用的紫外可見吸收光譜性質(zhì)的測定
[0035]圖4為熒光探針與不同濃度的Hg2+作用后的紫外可見吸收光譜圖，Hg2+的加入量依 次為0,0.5，1.0,2.0,4.0,6.0,8.0，10.(^1。從圖4中可以看出，沒有加入取2+時(shí)，探針在 555nm處幾乎沒有吸收峰，加入Hg 2+之后，在該處出現(xiàn)吸收峰，并且隨著Hg2+濃度增加，吸收 峰強(qiáng)度增強(qiáng)，這是因?yàn)樘结樂肿拥慕Y(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，結(jié)構(gòu)從羅丹明的閉環(huán)形式轉(zhuǎn)變?yōu)殚_環(huán) 形式。紫外可見吸收光譜測定用的儀器為Perkin Elmer Lambda 25型紫外可見分光光度 計(jì)。
[0036] 實(shí)施例5:
[0037]熒光探針1對Hg2+測定的選擇性
[0038]在濃度為ΙΟμΜ的熒光探針的Tris-HN03緩沖溶液(pH為7.0)加入金屬陽離子的熒 光強(qiáng)度的變化情況。如圖5黑色柱所示，金屬陽離子有Hg2+，Na+，K+，Mg2+，Ba 2+，Al3+，Zn2+，Cd2+， &3+，1112+^63+，(：〇2+，附 2+48+，？(12+，？132+，(：112+(取 2+的濃度是1(^1，其他陽離子的濃度為 ImM)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，當(dāng)加入汞離子時(shí)該探針分子在573nm處發(fā)出很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，其 強(qiáng)度相當(dāng)于空白溶液的40多倍，在相同的條件下加入其它陽離子時(shí)，只有Cu 2+在573nm處熒 光強(qiáng)度和空白對照組有較小程度的熒光增強(qiáng)。另外，我們也探究了在汞離子存在的條件下， 其它離子對探針1的熒光測定的影響，如圖5白色柱所示，探針幾乎不受其它金屬離子存在 的干擾。這些現(xiàn)象表現(xiàn)探針1對Hg 2+的測定表現(xiàn)出良好的選擇性。
[0039] 實(shí)施例6:
[0040] 溶液pH值對熒光探針1測定Hg2+的熒光性質(zhì)的影響
[0041] 我們考察了pH值對熒光探針測定Hg2+的熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖6。我們研究的 pH范圍為2.0~12.0，焚光探針的濃度為10yM，Hg2+的濃度為ΙΟμΜ。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，當(dāng)pH <5,熒光探針隨著pH的降低熒光強(qiáng)度增大，這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下，探針發(fā)生質(zhì)子化，使得 羅丹明結(jié)構(gòu)處于開環(huán)狀態(tài)；當(dāng)pH>5,由于羅丹明處于閉環(huán)結(jié)構(gòu)，隨著pH的變化，熒光強(qiáng)度基 本不變。然而，加入Hg 2+之后，在pH<8,熒光強(qiáng)度基本不變，這是因?yàn)樵谒嵝詶l件下的質(zhì)子化 或與Hg2+的結(jié)合作用，都能使得羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)處于開環(huán)狀態(tài)。綜上所述，當(dāng)pH值在5.0到 8.0之間時(shí)，不影響熒光探針對Hg 2+的測定，這非常有利于該探針在實(shí)際樣品中的應(yīng)用。 [0042] 實(shí)施例7:
[0043 ]熒光探針1與Hg2+作用的響應(yīng)時(shí)間的測定
[0044]為了研究熒光探針對Hg2+的響應(yīng)時(shí)間，我們考察了熒光探針在不同Hg2+濃度下 (0.5,2.0,5.0,8.ΟμΜ)的熒光光譜的變化情況，其結(jié)果如圖7。從圖中可以看出，該探針對 Hg2+的響應(yīng)時(shí)間不到3分鐘，滿足在實(shí)際樣品中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測時(shí)對響應(yīng)時(shí)間的要求。從圖7我 們還可以看出，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值后，熒光強(qiáng)度不再發(fā)生變化，會出現(xiàn)一個(gè)平臺，表明此 熒光探針光穩(wěn)定性好。
[0045] 實(shí)施例8:
[0046] 熒光探針1的實(shí)際水樣的應(yīng)用
[0047]將所制熒光探針用于水樣(湘江水和池塘水）中Hg2+回收率的測定。將所有水樣經(jīng) 簡單處理后用所制得的探針測定，得知水樣中不含Hg2+，然后分別加入不同濃度的Hg2+樣品 溶液。結(jié)果列于表1。從表中可以看出，探針對所有水樣中Hg 2+回收率的測定結(jié)果令人滿意， 由此看來所制探針(1)可有效的應(yīng)用于實(shí)際樣品中Hg2+的分析測定。(表1)
[0048]表1實(shí)際水樣中Hg2+回收率的測定
[0049]
[0050] a三次測定的平均值，4示準(zhǔn)偏差 [0051 ] 實(shí)施例9:
[0052]熒光探針1在活細(xì)胞中的應(yīng)用
[0053]首先，我們做了細(xì)胞毒性試驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示。當(dāng)加入0~20μΜ Hg2+探針，30min 后，細(xì)胞的成活率均在98%以上，因此可以說明，此Hg2+焚光探針可應(yīng)用于檢測活細(xì)胞內(nèi)的 Hg2+，并且毒性較小。接著，我們將He La細(xì)胞培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后添加有10 %胎牛血清 (FBS)和5%C02，在37°C的環(huán)境下放置。將細(xì)胞接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，培育孵化24h使細(xì)胞 貼壁。做細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)之前，我們先用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)將HeLa細(xì)胞清洗三次。然后加 入10 μ Μ的熒光探針分子1在3 7 °C下恒溫放置1小時(shí)，再用P B S緩沖溶液清洗三次，最終在 OLYMPUS FV1000激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行拍照。拍照完之后，再在該細(xì)胞中加入Hg2+(10y Μ)，在37°C恒溫孵育1小時(shí)，用PBS洗滌三次，并再次于激光共聚焦顯微鏡下拍照。激光共聚 焦顯微鏡所設(shè)定的激發(fā)波長在515nm處。一般情況下，細(xì)胞內(nèi)的Hg 2+含量非常少，因此向細(xì)胞 內(nèi)加入探針，檢測不到熒光信號，如圖9a所示。但是，加入Hg2+后，如圖9b所示，可檢測到細(xì)胞 內(nèi)很強(qiáng)的紅色熒光信號。因此可以說明，此Hg 2+探針可能用于檢測細(xì)胞內(nèi)的Hg2+。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于羅丹明衍生物水溶性Hg2+熒光探針(1)，其結(jié)構(gòu)式如下。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于羅丹明衍生物水溶性Hg2+熒光探針的制備方法，其特 征在于它的具體制備步驟為：1)將1，2, 4-偏苯三酸酐和3-二乙氨基苯酚按摩爾比1:1.9 ~1:2.2混合于N，N-二甲基甲酰胺溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，磁力攪拌回流5~7小時(shí)，停止反 應(yīng)，反應(yīng)混合物冷卻至室溫后，用水和二氯甲烷進(jìn)行萃取，合并有機(jī)層并減壓蒸餾除去溶 劑，粗產(chǎn)品用二氯甲烷/甲醇(體積比為8:1~5:1)為洗脫劑柱層析分離得紅色固體(5-羧 基羅丹明B) ; 2)將5-羧基羅丹明B和80%水合肼按摩爾比1:6~1:4混合于無水甲醇溶液中， 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，60~80 °C下磁力攪拌回流反應(yīng)混合物攪拌下回流18~24小時(shí)，減壓蒸餾除 去溶劑，粗產(chǎn)品用二氯甲烷/甲醇(體積比為15:1~10:1)為洗脫劑柱層析分離得白色固體 (探針1)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于羅丹明衍生物的Hg2+焚光探針的性能研究，其特征在 于：1)該熒光探針用無背景干擾的羅丹明內(nèi)酰胺衍生物對生物相關(guān)的陽離子Hg 2+進(jìn)行檢測； 2)在這個(gè)體系中，Hg2+誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，并且當(dāng)加入1當(dāng)量的 Hg2+時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)42倍，表現(xiàn)出很高的靈敏度;3)該熒光探針對Hg2+表現(xiàn)出很好的選擇 性，幾乎不受其它陽離子的干擾，如 Na+，K+，Mg2+，Ba2+，Al3+，Zn 2+，Cd2+，Cr3+，Mn2+，F(xiàn)e3+，Co 2+， Ni2+，Ag+，Pd2+，Pb2+，Cu2+;4)當(dāng)pH值在5.0到8.0之間時(shí)，焚光探針對Hg 2+的測定不受pH的影 響;5)該熒光探針與Hg2+作用迅速，響應(yīng)時(shí)間在3分鐘以內(nèi)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于羅丹明衍生物的Hg2+熒光探針的應(yīng)用，其特征在于： 成功應(yīng)用于實(shí)際水樣中對Hg 2+的定量檢測以及對Hg2+的生物細(xì)胞成像。
【文檔編號】G01N21/64GK105885828SQ201610250556
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月21日
【發(fā)明人】李春艷, 李丹, 李勇飛
【申請人】湘潭大學(xué)