專利名稱：檢測特異性靶核酸的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測和定量分析樣品中核酸的方法，特別是涉及利用具有嵌入和檢測雙重功能的功能團作為檢測試劑，在均相檢測系統(tǒng)中或在固相載體上檢測和定量特異性靶核酸的方法及試劑盒。本發(fā)明的方法可在無須對靶核酸進行擴增的情況下，借助放大了的信號檢測靶核酸，從而在不降低特異性的條件下，顯著地提高了檢測效率。
背景技術：
核酸雜交是檢測和鑒定病原微生物及遺傳性疾病的一種有效方法，而且核酸雜交在染色體基因作圖及臨床研究中也具有廣泛的應用。在診斷領域，為了檢測低濃度待分析物，已在實踐中廣泛應用了化學發(fā)光和電學發(fā)光方法。在這些方法中，一般是將發(fā)光分子的數(shù)目和光產生過程擴增許多倍，從而得以檢測低濃度被分析物。實踐中，最常使用的化學發(fā)光物質是熒光染料。最典型的基于熒光強度的檢測法基本上都包括這樣的步驟使靶與含熒光的探針接觸；從已結合的探針中除去未結合的探針；然后檢測洗過的樣品中的熒光。繼后發(fā)展的均相法的主要特征是不需要洗滌步驟或不需要提供非液相載體。
美國專利4,220,450和5,538,848號分別公開了在溶液環(huán)境下檢測核酸序列的均相熒光檢測法。其中前者需要使用與報道因子聯(lián)合的淬火劑，以將雜交探針產生的與未雜交探針產生的信號區(qū)分開。后者則需要使用酶，所以這些方法不僅都比較復雜，而且成本高。
另一方面，有些方法使用了能夠結合到雜交復合物中核酸鏈之間的嵌入熒光。例如，美國專利5,824,557號公開了將染料嵌入到雙鏈核酸螺旋或單鏈核酸中，并根據(jù)嵌入后染料熒光的強度直接檢測樣品中核酸量的方法。雖然該方法的目的是檢測樣品中的核酸量，但嵌入劑與核酸之間的非特異性結合使得該方法幾乎不能實際用于檢測特異性結合，特別是在有非靶雙鏈核酸存在的情況下。
在此基礎上，美國專利5,814,447號提出了一種改善反應特異性的方法，其特征在于探針是用嵌入熒光團標記的單鏈寡核苷酸，并且所說的嵌入熒光團被嵌入到靶核酸和單鏈寡核苷酸探針間的互補結合部分。美國專利6,403,313號描述了對上述方法的進一步改進，包括用熒光團標記探針或嵌入劑后，在雜交介質中加入所說的探針、靶和嵌入劑以提供實驗樣品，然后用激發(fā)光照射所說的實驗樣品以使熒光團發(fā)射熒光，檢測熒光發(fā)射的強度并借以判斷探針與靶之間的結合親和性。
另外，最近美國未授權專利申請2002016683號公開了一種使用電化學發(fā)光檢測DNA的方法，包括在固定有探針DNA的芯片上放置靶DNA并將某種嵌入劑嵌入到所形成的雜交DNA中，然后再向芯片上引入電化學發(fā)光反應液。施加電壓以引起嵌入劑與電化學發(fā)光反應液之間的發(fā)光反應后，即可檢測并分析如此產生的光。
上述現(xiàn)有技術的一個共同特征是都使用了嵌入劑，并且所說的嵌入劑可以是帶有或不帶有熒光團的。然而，這些現(xiàn)有技術中的嵌入劑無論是與探針相連還是嵌入到互補結合的雙鏈或三鏈中，基本上都是在原位被激發(fā)并檢測的。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的一個目的是提供檢測樣品中靶核苷酸存在及其相對量的方法，該方法包括(1)將含有與待檢靶核酸樣品的至少一部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的單鏈寡核苷酸探針固定在載體上；(2)在雜交條件下，加入待檢樣品并使之與已固定的所說的單鏈寡核苷酸探針接觸；(3)向待檢樣品與寡核苷酸探針的混合物中加入借助接頭臂與信號基團連接或直接與信號基團連接的嵌入劑分子；(4)保溫適當時間并充分洗滌后，檢測所說的信號基團所發(fā)射的信號的強度，借以判定所說的靶核酸與所說的探針的特異性雜交并確定樣品中靶核酸的存在及其量。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的嵌入劑分子嵌入到靶核酸與單鏈寡核苷酸探針之間雜交形成的復合體中。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的信號基團是可在所說的靶與所說的探針雜交的條件下產生可檢測的化學發(fā)光或電化學發(fā)光信號的基團。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的信號基團是通過所說的接頭臂或直接與所說的嵌入劑分子連接的。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的接頭臂是可共價連接嵌入分子和信號基團的具有1-20個碳原子的直鏈烷烴或其衍生物。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中信號基團和嵌入劑，或信號基團和與嵌入劑相連之接頭臂的遠端分別與親和對的成員之一連接。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的方法需要或不需要對所說的靶進行PCR擴增。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的固相載體包括各種聚合物平板或顆粒或微球，或生物芯片。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測樣品中靶核苷酸存在的試劑盒，所說的試劑盒包括置于一個或多個容器中的(1)能夠與靶核苷酸雜交的單鏈核苷酸探針，(2)可嵌入靶核苷酸與單鏈核苷酸探針雜交形成的雜交復合體中的嵌入劑分子。
根據(jù)本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的嵌入劑分子通過接頭臂或直接與信號基團連接。
根據(jù)本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的接頭臂是可共價連接嵌入分子和信號基團的具有1-20個碳原子的直鏈烷烴或其衍生物。
根據(jù)本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選實施方案，其中信號基團和嵌入劑，或信號基團和與嵌入劑相連之接頭臂的遠端分別與親和對的成員之一連接。
附圖簡要說明附

圖1是顯示本發(fā)明靶核酸檢測方法的原理的示意圖發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及檢測和定量分析樣品中核酸的方法，特別是涉及利用具有嵌入和檢測雙重功能的功能團作為檢測試劑，在固相檢測系統(tǒng)中檢測和定量特異性靶核酸的方法及試劑盒。本發(fā)明的方法可在無須對靶核酸進行擴增的情況下，借助放大了的信號檢測靶核酸，因而可在不至于降低特異性的條件下，顯著地提高檢測效率和敏感性。
本說明書中使用的術語“靶核苷酸”或“靶”是指樣品中存在的并可被定性或定量檢測的任何含核酸物質。對于自然狀態(tài)下以雙鏈形式存在的靶核苷酸，可經加熱處理制成單鏈后再按照本發(fā)明的方法進行檢測。
術語“寡核苷酸探針”或“探針”是指能夠優(yōu)先識別樣品中特定核苷酸序列的任何含核酸化合物。一般說來，探針主要包括用于DNA操作(分離、擴增和切接)或檢測(如檢測特定病原體)中的寡或多核苷酸探針。本文中有時也稱之為“俘獲探針”。
術語“嵌入分子”或“嵌入劑”是指在有雙鏈寡或多核苷酸存在下，可定位或插入到雙鏈核酸(可以是DNA/DNA、DNA/RNA，或RNA/RNA)的兩個相鄰堿基對之間并與所說的堿基對作用的分子或基團。嵌入分子或嵌入劑的特征是其能夠嵌入到核苷酸雙鏈雜交體如靶核酸與探針形成的雙鏈雜交體中。由于本發(fā)明的嵌入分子是通過連接臂或接頭臂或直接與放大了的信號基團(如熒光著染的納米聚合物顆粒)連接的，因此所說的連接物作為一個整體，其具有嵌入核酸雙鏈雜交體和顯示雜交已發(fā)生的雙重功能。所以，所說的連接物有時也被稱為雙功能基團。
嵌入劑可以是芳香族染料化合物，如溴化乙錠、乙錠二聚體(EthD)、丫啶、菲啶、放線菌素D、道諾紅霉素和YOYO-1等。為了形成嵌入劑/核酸復合物，每個嵌入劑分子至少需要4-5個堿基對參與復合。如此形成的復合體一般是對凝膠電泳穩(wěn)定的。另外，在與雙鏈DNA結合后，其熒光的產生可增加數(shù)十倍。然而即使這樣，基于分子的空間遮蔽等原因，嵌入劑插入核酸靶與探針特異性雜交形成的雙鏈DNA后所發(fā)出的熒光仍不足以提供準確檢測所需的信號。為了克服現(xiàn)有技術的這一缺陷，本發(fā)明特別改進了對嵌入劑的設計，即在固有的已知嵌入劑分子上連接一個空間臂或接頭臂，并借助所說的空間臂或接頭臂或直接連接一個放大了的信號基團，例如用一種或多種熒光著染的高聚物納米微粒。
本說明書中使用的術語“接頭臂”或“空間臂”或“接頭分子”是指能夠連接兩個分子或功能基團，并且不干擾其所連接的功能性基團的性質或功能的分子或基團。為本發(fā)明目的，適用的接頭臂或接頭分子是包括1-20個碳原子的、兩末端均帶有適當?shù)姆磻鶊F的直鏈烷烴和其衍生物。
為了進一步提高本發(fā)明方法的特異性和檢測的準確性，可以直接在嵌入劑上或與之相連的接頭臂的遠端偶聯(lián)親和對的一個成員，而在所說的信號基團上偶聯(lián)親和對的另一個成員。這樣，基于核酸雜交而嵌入雜交復合體中的嵌入劑分子即可借助其所偶連的親和對成員之一，與信號基團上偶聯(lián)的親和對的另一成員發(fā)生親和反應。這里所說的親和對包括但不只限于生物素和親和素(抗生物素蛋白)、抗原和抗體例如地高辛和抗地高辛抗體、受體和配體。
本說明書中使用的術語“信號基團”是指可用任何可定量的物理方法檢測的化學發(fā)光或電化學發(fā)光信號的發(fā)生源。所說的信號例如可以是散射光、透射光線、熒光以及電磁波。本發(fā)明中優(yōu)選的是由熒光染料受激發(fā)后產生的特定波長的熒光。特別是，本發(fā)明中優(yōu)選的信號基團是著染或結合了熒光染料特別是花青染料的微顆粒。
由于嵌入劑具有可插入到雙鏈DNA的相鄰堿基對之間的性質，所以許多DNA嵌入化合物如溴化乙錠等，作為功能性化合物已被用于各種核酸分析方法中。然而，對于有限長度的未經PCR擴增的雙鏈核酸(如靶核酸)來說，可嵌入所說的核酸雙螺旋中的嵌入劑分子應是很有限的，因而由被激發(fā)后的嵌入劑分子因離域作用(delocalization)所引出的信號如熒光也將是有限的，以至于使這些信號被本底信號所掩蓋而難以用常規(guī)儀器檢測到。另外，由于大多數(shù)嵌入劑都是具有平面環(huán)結構的芳香族染料，所以當其嵌入后很可能受到核酸分子特別是某些側鏈基團的遮蔽或淬滅等影響。再者，如果嵌入劑分子被溶解在水溶液中，據(jù)信水可通過提高分子的基能態(tài)而顯著地淬滅嵌入劑分子發(fā)射的熒光。
基于上述這些事實，并為了克服可能因上述原因所致的嵌入劑分子本身發(fā)射的熒光信號不足的問題，在研究靶核酸檢測方法的實踐中，本發(fā)明人改變并重新設計了基于核酸分子雜交和嵌入劑分子嵌入之檢測系統(tǒng)中的信號生成及發(fā)射元件，并在此基礎上建立了本發(fā)明的靶核酸檢測方法。結果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，我們所建立的方法不僅保留了現(xiàn)有方法的高度特異性，而且顯著地提高了靈敏性和檢測效率，從而使我們成功地完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的第一個目的是提供檢測樣品中靶核苷酸存在及其相對量的方法，該方法包括(1)將含有與待檢靶核酸樣品的至少一部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的單鏈寡核苷酸探針固定在載體上；(2)在雜交條件下，加入待檢樣品并使之與已固定的所說的單鏈寡核苷酸探針接觸；(3)向待檢樣品與寡核苷酸探針的混合物中加入借助接頭臂與信號基團連接或直接與信號基團連接的嵌入劑分子；(4)保溫適當時間并充分洗滌后，檢測所說的信號基團所發(fā)射的信號的強度，借以判定所說的靶核酸與所說的探針的特異性雜交并確定樣品中靶核酸的存在及其量。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的檢測是在固相體系中進行的。固相可以是以任何形式存在的，例如可以是反應容器如試管壁或其部分，也可以是濾膜如硝酸纖維濾膜或各種高聚物顆?；蛉槟z顆粒。其中優(yōu)選的是高分子聚合物顆粒。對載體顆粒的大小沒有嚴格限制，但顆粒大小應是易于以離心等方法分離的。一般說來，平均顆粒大小范圍應在1nm-100μm之間。
特別是，為了實現(xiàn)高通量檢測，可以在任何市售的商用生物芯片上完成依據(jù)本發(fā)明的靶核酸檢測。
可用各種已知的方法將預先設計并制備的寡核苷酸探針(俘獲探針)固定在所說的固相載體例如上述高聚物顆粒上。適用于本發(fā)明方法的探針包括雙鏈DNA、RNA和蛋白核酸(PNA)，以及含有不帶電荷的骨架的其他核酸類似物。根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，探針序列的長度一般為8-40個堿基，因為在這個范圍內，原核和真核生物體以及人的最小特有DNA序列均可被找到。但特別優(yōu)選的探針長度是大約15-30個堿基。然而，當用于檢測特定病原體靶核酸序列或者為了增加探針與固相載體結合的定化的牢固程度等專用用途時，所說的寡核苷酸探針的長度可達50-300個堿基。例如，本發(fā)明實施例1中用于檢測乙型肝炎病毒(HBV)核酸的寡核苷酸探針即長達102個堿基。
然后，向含有已固定探針的反應體系內加入得自待檢生物學樣品的靶核酸。在正常雜交條件下，完成互補堿基之間的雜交反應并形成雜交復合物。
由于本發(fā)明的方法相當靈敏，所以一般不需要對靶核酸進行PCR擴增。但在某些特定的情況下，如有較多污染或樣品量過少(例如濃度低于10-8M)時，亦可適當?shù)丶尤隤CR擴增步驟。
為了除去未雜交的樣品靶核酸并盡可能地減少本底信號，可在雜交反應完成之后和加入本發(fā)明的連接有信號基團的嵌入劑之前，應包括一個充分洗滌過程。可使用具有標準鹽濃度的雜交緩沖液完成洗滌步驟。然后向體系中加入本發(fā)明的具有嵌入和信號呈遞功能的信號基團即所謂“雙功能基團”，以完成對生物學樣品靶核酸的檢測。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的信號基團是可在所說的靶與所說的探針雜交的條件下產生化學發(fā)光或電化學發(fā)光的基團。本發(fā)明特別優(yōu)選的信號基團是以物理或化學的方法集成結合于聚合物微顆粒上或集成包裹在聚合物內的一組或多組熒光染料。
所說的微顆粒一般是指直徑在1nm-100μm之間，較好在10nm-20μm之間，最好在40nm-5μm之間的納米顆粒。
與常規(guī)載體顆粒相同，用于本發(fā)明的納米顆粒最好也是由聚苯乙烯或聚丙烯酸等聚合物材料制成的。顆粒中可含有適當量(如1-3％)的交聯(lián)劑如二乙烯苯。顆?？珊欣谂c接頭臂或直接與嵌入劑連接的附加表面功能基團，例如羧酸、酯、醇、醛、胺等基團。實踐中，可以在聚合物中摻入含有羧基的物質如丙烯酸或異丁烯酸以在顆粒中加入這些基團，并利用聚合物表面的這些基團連接含有反應性胺或巰基的化合物。
用于本發(fā)明的熒光染料是發(fā)射光波長為500-900nm的氰類染料。但任何可溶于有機溶劑的染料均可使用。適用于本發(fā)明的染料例如包括但不只限于酞青染料、克酮酸衍生物、環(huán)丁烯二酮衍生物等?？梢愿鶕?jù)熒光的光發(fā)射和吸收性質以及疏水特性來選擇適當?shù)娜玖稀？筛鶕?jù)需要，使用下列三種不同的已知方法制備熒光顆粒(1)將染料共價結合到顆粒的表面上；(2)在聚合物聚合形成顆粒期間內部摻入染料；(3)顆粒聚合后以擴散法著染顆粒(分別參見美國專利4,774,189、4,717,655和5,723,218號)。例如，可在圓底燒瓶內攪拌納米顆粒的1％溶液，然后向其中加入溶于有機溶劑的染料。當顆粒不再吸附染料溶液時，停止加染料并減壓除去溶劑。
為了得到本發(fā)明的雙功能基團，可以使用本領域技術人員已知的化學方法將嵌入劑分子直接偶聯(lián)到如上制得的熒光顆粒上，或者通過一個接頭臂并借助其末端反應性基團連接到同樣帶有反應性基團(例如羧基)的熒光顆粒上。
根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的接頭臂是兩末端可共價連接嵌入分子和信號基團的具有1-20個碳原子的直鏈烷烴和其衍生物，如醇、醛、酸、酯和胺等。為本發(fā)明的目的，特別優(yōu)選的接頭分子是戊二醛。
在某些情況下，為了進一步提高本發(fā)明方法的特異性和檢測的準確性，可以直接在嵌入劑上或與之相連的接頭臂的遠端偶聯(lián)親和對的一個成員，而在所說的信號基團上偶聯(lián)親和對的另一個成員。這樣，基于核酸雜交而嵌入雜交復合體中的嵌入劑分子即可借助其所偶連的親和對成員之一，與信號基團上偶聯(lián)的親和對的另一成員發(fā)生親和反應。這里所說的親和對包括但不只限于生物素和親和素(抗生物素蛋白)、抗原和抗體例如地高辛和抗地高辛抗體、受體和配體。其中特別優(yōu)選的親和對是生物素和親和素(抗生物素蛋白)。
本發(fā)明方法的基本特征在于，借助過固定化的探針捕獲靶核酸，經反復洗滌和分離過程使反應的特異性得到保障，。所加入的雙鏈嵌入劑直接或間接與信號基團相連，即可簡便地監(jiān)測靶核酸，從而大大簡化了操作步驟。尤其是在使用核酸芯片的情況下，本發(fā)明的上述方法可避免常規(guī)高通量檢測方法中檢測探針間的相互干擾，從而也大大提高了檢測結果的準確性。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于檢測樣品中靶核苷酸存在的試劑盒，所說的試劑盒包括置于一個或多個容器中的(1)能夠與靶核苷酸雜交的單鏈核苷酸探針，(2)可嵌入靶核苷酸與單鏈核苷酸探針雜交形成的雜交復合體中的嵌入劑分子。
根據(jù)本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的嵌入劑分子通過接頭臂或直接與信號基團連接。并且優(yōu)選的信號基團是攜帶于納米顆粒上的熒光染料。
根據(jù)本發(fā)明試劑盒的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的接頭臂是可共價連接嵌入分子和信號基團的具有1-20個碳原子的直鏈烷烴或其酸、酯、醇、醛、胺類衍生物。
由于改良了核酸檢測系統(tǒng)中的信號生成和呈遞元件，將基于嵌入劑分子嵌入已雜交的雙鏈核酸雜交體產生光輻射的檢測，改變?yōu)橹饕趯χ苯踊蛲ㄟ^接頭與嵌入劑分子相連的熒光顆粒的檢測，使信號發(fā)射源的信號強度提高數(shù)千倍，從而在不降低檢測的特異性的條件下，顯著地提高了檢測方法的靈敏性和檢測效率。
本發(fā)明的方法特別適于檢測樣品中低濃度靶核酸的存在及其可能的堿基錯配，從而得以鑒定病原微生物及遺傳性疾病，為臨床提供可靠的診斷依據(jù)。由于改進了檢測系統(tǒng)中的信號發(fā)生和呈遞元件，即雜交信號的發(fā)生不再依賴于嵌入劑嵌入后的熒光輻射，而是代之以其強度高出數(shù)百甚至上千倍的。所以，本發(fā)明的方法不僅保留了其固有的特異性，而且顯著提高了檢測的靈敏性和檢測效率。另外，由于本發(fā)明的方法在多數(shù)情況下不需要進行費用和時間均消耗較大的PCR擴增，而且可以在生物芯片上完成，所以為低成本、高通量檢測提供了條件。
下列實施例旨在進一步舉例闡述本發(fā)明，但這些實施例并不以任何方式構成對本發(fā)明待批權利要求的限制。
實施例實施例1本實施例以含有乙型肝炎病毒(HBV)的待檢樣品為例，舉例描述本發(fā)明方法的可靠性和實踐可應用性。
(1)單鏈寡核苷酸探針(俘獲探針)的制備和固定基于乙型肝炎病毒的已知核苷酸序列設計并合成具有下示序列的單鏈寡核苷酸探針GTA TCT TTT GGA ATG TGG ATT CGC ACTCCT CCC GCT TAC AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATC TTA TCAACA CTT CCG GAA ACT ACT ATT GTT AGA CGA CGA GGC。
用2×SSC溶液將硝酸纖維素濾膜浸濕并夾在兩片玻璃板之間37℃烘干。然后，即可在干燥的濾膜上滴加含有適當濃度俘獲探針的溶液。加樣后，將濾膜80℃烘烤約2小時。
(2)信號基團連接的嵌入劑的制備將市售的直徑約1μm的桔黃色熒光納米微球(約5.0毫克)依次用25mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)和25mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)各洗三次，然后離心(20,000轉/分，20分鐘)收集經過如此洗滌處理的超微顆粒。將收集的微粒稍加風干并用上述25mM碳酸鹽緩沖液(pH9.5)稀釋后，加入作為嵌入劑的溴化乙錠溶液(2％，1.0ml)并于37℃保溫2小時。然后，再在含有1％牛血清白蛋白(BSA)的封閉液中37℃保溫20分鐘。封閉后，用含有2Mm Tris-Tween 40的洗滌溶液洗5次，然后風干備用。
(3)待檢樣品的予處理取臨床病人的血清樣品0.5ml，向其中加入等體積樣品提取液(1％TrionX-100、1％NP40、10mM Tris-HCl PH8.0)，96℃水浴10分鐘，12000rpm離心取上清(靶核酸)進行試驗。
實驗中，以已確診的乙型肝炎病人血清樣品為實驗組；以經過PCR擴增和同樣處理的探針溶液作為陽性對照組；以經過同樣處理的正常人血清樣品作為陰性對照組，并以生理鹽水作為空白對照組。
(4)雜交和嵌入反應首先將預雜交溶液(含有0.50ml二甲基甲酰胺、0.25ml 20×SSC緩沖液、0.10ml 50×Denhardts溶液、0.05ml 1M PBS，pH6.4、0.05ml 100mM EDTA和50μl經過上述處理的靶核酸)加熱煮沸10分鐘，再轉入冰水浴中冷卻5分鐘。將此預雜交溶液點加在步驟(1)中預制備的硝酸纖維素濾膜上并于42℃下預雜交2小時，然后傾去預雜交溶液。
然后，將雜交溶液(由0.45ml二甲基甲酰胺、0.25ml 20緩沖液、20μl 50×Denhardts溶液、25μl 1M PBS，pH6.4和0.25ml臨床病人血清組成)加熱煮沸10分鐘，再轉入冰水浴中冷卻5分鐘。將此雜交溶液點加在上述硝酸纖維素濾膜上并于42℃下雜交過夜，然后傾去預雜交溶液。
用含有2×SSC和0.1％SDS的溶液將上述硝酸纖維素濾膜洗滌3次，然后再于65℃下用同樣溶液再洗滌三次。將洗滌過的濾膜風干后，用封閉溶液(含有2％BSA的10mM Tris-HCL緩沖液)37℃下封閉3小時。封閉后，用上述同樣洗滌溶液洗滌三次(每次5分鐘)。
(5)信號檢測和數(shù)據(jù)處理使用Wallac 1420型多標記分析儀(PE公司)并采用激發(fā)波長535nm和發(fā)射波長570nm進行檢測。
以陰性對照組樣品測得的熒光強度為基值，將已知或未知待檢樣品的實測熒光強度減去陰性對照組樣品的平均熒光強度，即得到各待檢樣品的熒光強度。結果如下列表1所示。數(shù)值均為每份樣品的三次檢測值±標準差表示。
表1本發(fā)明的方法用于檢測HBV樣品的初步實驗結果
*樣品為病人的血清。
由表1所示的結果可以看出，本發(fā)明的方法用于檢測病原體核酸時，隨著樣品中病毒濃度的增加，熒光強度呈線性增高，即兩者間具有很好的數(shù)據(jù)相關性，而且該方法具有較高靈敏性和簡便性。因此，本發(fā)明使用雙功能信號基團的核酸檢測方法有可能被廣泛用于各種病原生物體核酸或其他未知核酸的檢測。
序列表<110>英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司<120>檢測特異性核酸的方法和試劑盒<140>
<141>
<160>1<210>1<211>102<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。
<400>1GTATCTTTTG GAATGTGGAT TCGCACTCCT CCCGCTTACA GACCACCAAATGCCCCTATC TTATCAACAC TTCCGGAAAC TACTATTGTT AGACGACGAGGC
權利要求
1，檢測樣品中靶核苷酸存在及其相對量的方法，該方法包括(1)將含有與待檢靶核酸樣品的至少一部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的單鏈寡核苷酸探針固定在載體上；(2)在雜交條件下，加入待檢樣品并使之與已固定的所說的單鏈寡核苷酸探針接觸；(3)向待檢樣品與寡核苷酸探針的混合物中加入借助接頭臂與信號基團連接或直接與信號基團連接的嵌入劑分子；(4)保溫適當時間并充分洗滌后，檢測所說的信號基團所發(fā)射的信號的強度，借以判定所說的靶核酸與所說的探針的特異性雜交并確定樣品中靶核酸的存在及其量。
2，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的嵌入劑分子嵌入到靶核酸與單鏈寡核苷酸探針之間雜交形成的復合體中。
3，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的信號基團是可在所說的靶與所說的探針雜交的條件下產生可檢測的化學發(fā)光或電化學發(fā)光的基團。
4，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的信號基團是通過所說的接頭臂或直接與所說的嵌入劑分子連接。
5，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的接頭臂是可共價連接嵌入分子和信號基團的具有1-20個碳原子的直鏈烷烴或其衍生物。
6，根據(jù)權利要求1的方法，其中信號基團和嵌入劑，或信號基團和與嵌入劑相連之接頭臂的遠端分別與親和對的成員之一連接。
7，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的方法需要或不需要對所說的靶進行PCR擴增。
8，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的固相載體包括各種聚合物平板或顆?；蛭⑶?，以及生物芯片。
9，用于檢測樣品中靶核苷酸存在的試劑盒，所說的試劑盒包括置于一個或多個容器中的(1)能夠與靶核苷酸雜交的單鏈核苷酸探針，(2)可嵌入靶核苷酸與單鏈核苷酸探針雜交形成的雜交復合體中的嵌入劑分子。
10，根據(jù)權利要求9的試劑盒，其中所說的嵌入劑分子通過接頭臂或直接與信號基團連接。
11，根據(jù)權利要求9的試劑盒，其中所說的接頭臂是可共價連接嵌入分子和信號基團的具有1-20個碳原子的直鏈烷烴或其衍生物。
12，根據(jù)權利要求9的試劑盒，其中信號基團和嵌入劑，或信號基團和與嵌入劑相連之接頭臂的遠端分別與親和對的成員之一連接。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測和定量分析樣品中核酸的方法，特別是涉及利用具有嵌入和檢測雙重功能的功能團作為檢測試劑，在均相檢測系統(tǒng)中或在固相載體上檢測和定量特異性靶核酸的方法及試劑盒。本發(fā)明的方法可在無須對靶核酸進行擴增的情況下，借助放大了的信號檢測靶核酸，因而可在不降低特異性的條件下顯著地提高檢測效率。
文檔編號C12Q1/68GK1521270SQ0310249
公開日2004年8月18日 申請日期2003年1月27日 優(yōu)先權日2003年1月27日
發(fā)明者盧方, 陳濱暉, 王凱華, 盧 方 申請人:英科新創(chuàng)(廈門)科技有限公司