專利名稱：分離分子的方法
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背景技術(shù)：
本發(fā)明廣泛地涉及組合物和將金屬離子或其它靶物質(zhì)與非靶物質(zhì)分離的方法，所述靶物質(zhì)包括但不限于多肽，核酸或內(nèi)毒素。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明包括從起始物質(zhì)中分離靶物質(zhì)的方法，所述方法包括將起始物質(zhì)和選自如下一組的組合物接觸 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基(aralkylene)，或取代或未取代的亞芳基；
R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體(solid support)的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1；以在至少靶物質(zhì)的一部分和所述組合物之間形成復(fù)合物。
參考下面的附圖和詳細(xì)的描述，本發(fā)明的這些和其它方面將被更好地理解。
這里所引用的每個出版物或?qū)＠暾堃云淙績?nèi)容并入?yún)⒖?。在本公開和并入的出版物之間有沖突的情況下，以本公開為準(zhǔn)。
附圖簡述

圖1提供了比較血紅蛋白，堿性磷酸酶和B-半乳糖苷酶在氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒(圖1A)、Q-瓊脂糖樹脂(圖1B)以及DEAE樹脂(圖1C)上分級分離的圖示。
圖2是利用氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒分級分離的FluoroTect-Green標(biāo)記的螢光素酶和血紅蛋白的SDS-PAGE凝膠。
圖3A和3B是由3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲的糖基化膜蛋白的SDS-PAGE凝膠。
圖4是利用3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒分離的在無細(xì)胞表達(dá)體系中表達(dá)的膜蛋白的SDS-PAGE凝膠。
圖5是說明3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒捕獲細(xì)菌細(xì)胞的圖示。
圖6是利用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒純化的組氨酸標(biāo)記(his-tag)RNase HI的SDS-PAGE凝膠。
圖7是比較利用多種金屬3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分級分離血紅蛋白的SDS-PAGE凝膠。
圖8A是利用氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒后，再利用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分級分離的組氨酸標(biāo)記RNase HI的SDS-PAGE凝膠。圖8B是利用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒后，再利用氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒分級分離的組氨酸標(biāo)記螢光素酶的SDS-PAGE凝膠。
圖9A是顯示考馬斯藍(lán)染料結(jié)合附著在鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒上的組氨酸標(biāo)記螢光素酶照片。圖9B是顯示用增加咪唑的濃度將考馬斯藍(lán)染色的組氨酸標(biāo)記螢光素酶從鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒上洗脫的圖示。圖9C是比較考馬斯藍(lán)染料結(jié)合附著于鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的組氨酸標(biāo)記蛋白和考馬斯藍(lán)染料結(jié)合附著于其它金屬螯合樹脂的組氨酸標(biāo)記蛋白的照片。
圖10A顯示鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分級分離后熒光標(biāo)記的組氨酸標(biāo)記螢光素酶的SDS-PAGE凝膠。圖10B顯示銅-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分級分離后熒光標(biāo)記的組氨酸標(biāo)記BSA的SDS-PAGE凝膠。
圖11是利用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分離的tRNA的SDS-PAGE凝膠。
圖12是利用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分離的來自無細(xì)胞表達(dá)體系的組氨酸標(biāo)記蛋白的SDS-PAGE凝膠。
圖13是比較游離tRNA合成酶的酶活性與結(jié)合鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的tRNA合成酶的酶活性的圖示。
圖14顯示改造的包括本發(fā)明用于多肽純化和分析的固體載體的移液管頭。
圖15是顯示利用多種金屬3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒從兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中結(jié)合和洗脫復(fù)合蛋白混合物模式的SDS-PAGE凝膠。
圖16A是利用銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒從兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中結(jié)合和洗脫復(fù)合蛋白混合物模式的SDS-PAGE凝膠。圖16B是顯示各個級分蛋白質(zhì)濃度(Bradford法A595)的圖示。
圖17A是顯示利用銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒從CHO細(xì)胞裂解物中結(jié)合和洗脫復(fù)合蛋白混合物模式的SDS-PAGE凝膠。圖17B是顯示各個級分蛋白質(zhì)濃度(Bradford法A595)的圖示。
圖18A是說明利用銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒從麥胚細(xì)胞裂解物中結(jié)合和洗脫復(fù)合蛋白混合物模式的SDS-PAGE凝膠。圖18B是顯示各個級分蛋白質(zhì)濃度(Bradford法A595)的圖示。
圖19是說明在不同條件下用銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒序貫洗脫蛋白的SDS-PAGE凝膠。
圖20是說明在不同條件下用銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒序貫洗脫蛋白的SDS-PAGE凝膠。
圖21是利用鐵(III)或鎵(III)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分離的磷蛋白卵清蛋白SDS-PAGE凝膠。
圖22是利用鐵(III)或鎵(III)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒從兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中分離的磷蛋白SDS-PAGE凝膠。
圖23A是利用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分離的在誘導(dǎo)后不同時間點回收的細(xì)菌裂解物的考馬斯染色的組氨酸標(biāo)記蛋白的圖片；圖23B是誘導(dǎo)后時間函數(shù)的細(xì)胞生長(OD600測定)和蛋白質(zhì)濃度(考馬斯染色蛋白A595測定)的圖示；圖23C是樣品中純化蛋白的SDS-PAGE凝膠。
圖24顯示利用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分離并用BODIPY染色的組氨酸標(biāo)記蛋白的SDS-PAGE凝膠熒光圖像。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了從起始物質(zhì)中分離靶物質(zhì)的組合物和方法。合適的靶物質(zhì)包括，但不限于金屬離子、多肽、核酸、全細(xì)胞和細(xì)胞膜等。本發(fā)明還提供適合用于本發(fā)明方法實施的試劑盒。
本發(fā)明的組合物和方法在多種應(yīng)用中是有用的，包括例如混合物中分子的分級分離，從液體中去除金屬離子，從細(xì)胞懸液中捕獲細(xì)胞，分離膜或膜蛋白和從混合物中去除不希望的污染蛋白等。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解的，本發(fā)明的組合物和方法可以單獨使用或與其它組合物或方法聯(lián)合使用。
本發(fā)明的組合物和方法允許靶物質(zhì)輕而易舉的分離或純化，因此它們可用于小型化、機(jī)械操作以及用于高通量分析。本發(fā)明組合物和方法還適用于結(jié)構(gòu)和功能基因組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)。
本發(fā)明組合物包括改性固體載體，包括次氮基三乙酸(NTA)改性固體載體和金屬改性固體載體。
本發(fā)明方法使用NTA改性固體載體、金屬改性固體載體或胺改性固體載體與起始物質(zhì)中的靶物質(zhì)如金屬離子、分子、亞細(xì)胞組分或全細(xì)胞形成復(fù)合物，或者說實現(xiàn)靶物質(zhì)如金屬離子、分子、亞細(xì)胞組分或全細(xì)胞與起始物質(zhì)中的非靶物質(zhì)分離。
適于制造本發(fā)明改性固體載體的合適固體載體包括，但不限于，凝膠或硬的支持材料、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、纖維素、塑料、多糖、尼龍、聚苯乙烯、乳膠異丁烯酸鹽、二氧化硅、氧化鋁、電極、膜、及其衍生物。
合適的二氧化硅固體載體包括，但不限于硅氧化物(siliceousoxide)、磁性二氧化硅顆粒、固體二氧化硅如玻璃或硅藻土等等，或二氧化硅材料的組合(參見，例如“preparation of silica discussion inKurt-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology”，第21卷，第四版，Mary Howe-Grant編輯，John Wiley &Sons出版，1997，第1021頁)。如在下面實施例中所討論的，合適的硅膠可以從廠商如Silicycle(Quebec City，Canada)、J.T.Baker(Phillipsberg，NJ)以及Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)商購獲得。在下面的實施例中將進(jìn)一步描述適用于本發(fā)明組合物和方法的合適硅膠。其它合適的二氧化硅載體包括結(jié)晶或透明二氧化硅，例如石英、透明石英、可控孔度玻璃(controlled pore glass)顆粒以及玻璃纖維。
可以用孔直徑、顆粒大小或比表面積來表征硅膠的特征。合適的硅膠具有大約30到大約1000埃的孔直徑，大約2到大約300微米的顆粒大小以及大約50m2/g到大約1000m2/g的比表面積。合適的硅膠包括，例如，那些具有大約40埃、大約60埃和大約150埃孔直徑的硅膠；那些具有大約2到大約25微米、大約5到大約25微米、大約15微米、大約63到大約200微米和大約75到大約200微米顆粒大小的硅膠；以及那些具有大約300m2/g、大約500m2/g、大約550m2/g、大約675m2/g和大約750m2/g比表面積的硅膠。
合適地，本發(fā)明的固體載體可以包括磁性二氧化硅顆粒。磁性二氧化硅顆粒含有一個用水合硅氧化物吸附表面(例如有硅烷醇或Si-OH基團(tuán)的表面)涂布的超順磁(superparamagnetic)核心。合適的可商購獲得的磁性二氧化硅顆粒包括可從Promega Corporation(Madison，WJ)獲得的MagneSilTM顆粒。在美國專利號No.6,296,937中描述了適于用作本發(fā)明載體的磁性二氧化硅顆粒的制備。
合適的纖維素載體包括，但不局限于，硝酸纖維素和醋酸纖維素。
合適的膜包括，但不局限于，用二氧化硅浸漬的玻璃纖維膜。
合適的氧化鋁固體載體包括，但不局限于，大約150目和58埃的Brockmann氧化鋁。
如本文所述，可以形成胺改性固體載體，例如，使用包括至少一個游離羥基的固體載體以便當(dāng)所述固體載體與氨基硅烷化合物接觸時，氨基硅烷化合物的硅原子通過至少一個硅烷醇鍵共價結(jié)合所述固體載體以形成胺改性固體載體。
氨基硅烷化合物通過廠商如United Chemical Technologies，Inc.(Bristol，PA)可以商購獲得。合適的氨基硅烷化合物包括 其中X是可達(dá)20個碳原子的亞烷基，所述亞烷基可以是飽和的、未飽和的、支鏈的、線性的或環(huán)狀的，如亞甲基、乙烯基丙烯、壬烯，或X是可達(dá)20個碳原子的亞芳烷基，其中烴基部分可以是飽和的、未飽和的、支鏈的、線性的或環(huán)狀的，或X是可達(dá)20個碳原子的亞芳基，以及其中X可以是如下面關(guān)于烴基所限定的未取代或取代的；R1是烴基，或取代的烴基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵，鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；以及RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3獨立地選自烴基，取代的烴基或氫原子；合適地，RN1、RN2和RN3可以獨立地是最長鏈可達(dá)6個碳原子的烴基，最長鏈可達(dá)6個碳原子的取代的烴基，或氫原子?！白铋L鏈”是IUPAC術(shù)語中所用的烴基的最長鏈。
本文所用的術(shù)語“烴基”是指可達(dá)20個碳原子的烴基基團(tuán)(alkylgroup)(即烷烴、烯烴或炔烴)，所述烴基可以是飽和的、未飽和的、支鏈的、線性的或環(huán)狀的；或可達(dá)20個碳原子的芳烴基，其中烷基部分可以是飽和的、未飽和的、支鏈的、線性的或環(huán)狀的；或可達(dá)20個碳原子的芳基。合適地，所述烴基具有2到15個碳原子，或5到10個碳原子?！叭〈臒N基”是指本文所定義的其中至少一個碳原子被氧、硫或氮原子取代的烴基。所述取代基可以是，例如氧基(oxo)、烷氧基、烷氧羰基、羥基、酯、硫醚、氨基、烷基胺或氨基甲酰。
用于本發(fā)明實施的合適氨基硅烷化合物的例子包括，但不限于，氨丙基硅烷、丙基乙二胺硅烷、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺以及N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]二亞乙基三胺。
如本文所述，NTA改性固體載體可以通過接觸有游離-NH2基團(tuán)的固體載體以在次氮基三乙酸和所述載體的胺基間形成酰胺鍵。次氮基三乙酸作為能與多價金屬離子形成穩(wěn)定復(fù)合物的螯合劑。
任何固體載體都可用于生產(chǎn)NTA改性固體載體，如果其具有能被改性的胺基基團(tuán)，或能使該固體載體含有可改性的胺基基團(tuán)。用于制備NTA改性固體載體的合適固體載體具有多個游離NH2基團(tuán)。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過化學(xué)修飾這些固體載體表面能將游離胺官能團(tuán)(functionality)附著在固體載體上。參見，例如Greg T.Hermason，A.Krishna Mallia，Paul K.Smith，Immobilized Affinity Legand Techniques，Academic Press(1992)。另外，具有能結(jié)合NTA以形成本發(fā)明NTA改性固體載體的游離NH2基團(tuán)的合適固體載體可以商購獲得。這些包括但不限于，Sigma-Aldrich Inc.(St Louis，MO)出售的基于瓊脂糖的載體；International Dynamics Corporation(Longwood，F(xiàn)L)出售的基于乳膠的載體；Bangs Laboratories Inc.(Fishers，IN)出售的基于聚苯乙烯的載體；Spherotech(Libertyville，Ill)；以及Dynal Biotech(LakeSuccess，NY)。
另一方面，本發(fā)明提供金屬改性固體載體。如本文所述，可以通過將上文所述的NTA改性固體載體與金屬離子溶液接觸以形成金屬改性固體載體來生產(chǎn)金屬改性固體載體。所述的金屬離子溶液可以由金屬離子鹽組成，其中所述鹽包括，但不限于，氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、乙酰丙酮化物、溴化物、氟化物、碘化物、硝酸鹽和草酸鹽。金屬濃度可以是從小于大約10-6M到大約1M。典型地，溶液中的金屬離子濃度可以在大約0.1M到大約1M范圍內(nèi)?？梢韵胂笏龅慕饘匐x子溶液可以僅由一個金屬或不同金屬的混合物組成。合適地，在金屬離子和NTA改性固體載體之間可以形成四配位復(fù)合物。參見，例如New multidentate ligands.XV.Chelatingtendencies of diglycine-N，N-diacetic acid，triglycine-N，N-diacetic acidand tetraglycine-N，N-diacetic acid，Inorganic Chemistry(1974)，13(3)，550-9。
“金屬離子”用于金屬改性固體載體的上下文中，它的意思是指在+1和+6之間氧化態(tài)的任何金屬。合適地，所述金屬可以是鎳、銅、鈷、鐵、鋅或鎵。另外，認(rèn)為下述金屬離子是適合用于本發(fā)明的鐵(III)、銅(II)、鈷(II)、鎳(II)、鋅(II)、鈰(III)、鎂(II)、鈣(II)、鎵(III)、鉻(III)、銦(III)、鑭(III)、镥(III)、鈧(III)、鉈(III)、鐿(III)、釷(IV)、鈾酸鹽(II)、銀(I)、金(I)和銅(I)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)待分離的物質(zhì)能夠選擇合適的金屬。另外，可以想象用螯合劑如乙二胺四乙酸(EDTA)可以將結(jié)合的金屬離子從金屬改性固體載體上剝離下來，因此允許NTA改性固體載體的再生。
本發(fā)明改性固體載體可用于多種方法中，包括，但不限于本發(fā)明實施例或說明書的其它部分所述的方法。如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，根據(jù)應(yīng)用的具體要求，可以以多種不同的形式提供或使用本發(fā)明的載體。例如，所述改性固體載體可以用于柱子，旋轉(zhuǎn)柱，微量滴定板孔，摻入或形成濾膜、作為可植入哺乳動物體內(nèi)的裝置，或放于轉(zhuǎn)移工具中(如移液管頭)。
用于本發(fā)明方法的起始物質(zhì)可以包括含有或疑有靶物質(zhì)的任何物質(zhì)，以及可以任選包括非靶物質(zhì)。起始物質(zhì)包括直接從生物來源(例如細(xì)胞培養(yǎng)物、用過的培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物)或環(huán)境來源(如水或空氣)獲得的物質(zhì)以及被加工或部分純化的物質(zhì)。起始物質(zhì)可以包括任何形式的(如溶液或懸浮液)靶或非靶物質(zhì)。起始物質(zhì)可以來自真核或原核來源，包括培養(yǎng)的真核或原核細(xì)胞，也可以包括重組的或天然存在的生物分子。起始物質(zhì)可以包括，例如，粗細(xì)胞裂解物，包括用于表達(dá)體系的裂解物，包括但不限于無細(xì)胞裂解物如大腸桿菌(E.coli)S-30、麥胚和兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物。起始物質(zhì)可以是分泌了靶物質(zhì)的用過的細(xì)菌或細(xì)胞培養(yǎng)基。合適的起始物質(zhì)可以包括蛋白質(zhì)的復(fù)合混合物。起始物質(zhì)可以包括細(xì)菌、酵母、真菌或病毒物質(zhì)、植物或動物物質(zhì)，包括其產(chǎn)物(如全血、血漿、血清、乳汁等)。起始物質(zhì)還可包括液體如水、空氣或尿。
在本發(fā)明的方法中，起始物質(zhì)和本發(fā)明改性固體載體接觸以在靶物質(zhì)和所述載體之間形成復(fù)合物。為簡便起見，將接觸的起始物質(zhì)從顆粒中機(jī)械分離而回收的物質(zhì)稱作“流出物(flow through)”，無論分離是通過什么手段實現(xiàn)的。
本發(fā)明的方法取決于起始物質(zhì)中靶或非靶物質(zhì)與本發(fā)明組合物形成復(fù)合物的能力而實現(xiàn)具體效果，即靶物質(zhì)與起始物質(zhì)或其組分間空間關(guān)系的變化。對于靶和非靶物質(zhì)，可以將該效果描述為去除、分開、分離、純化、分級分離等。這些術(shù)語并沒有限制本發(fā)明之意。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解這些術(shù)語是相對的，而不是絕對的，可以替換使用。
在一些應(yīng)用中，為實現(xiàn)將不希望的靶物質(zhì)從起始物質(zhì)中去除(例如從液體如水中將潛在有毒的金屬離子去除)可以使用本發(fā)明方法。在其它情況中，本發(fā)明的目的是從包括靶物質(zhì)和非靶物質(zhì)的復(fù)合混合物中分離或純化特定靶物質(zhì)，或分級分離靶和非靶物質(zhì)。
本發(fā)明方法分離或純化的靶物質(zhì)如多肽適用于許多下游應(yīng)用?？梢酝ㄟ^如下任一種技術(shù)對分離的靶物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的分離、定性或定量，這些技術(shù)包括但不限于雙向凝膠電泳、質(zhì)譜、X-線衍射、核磁共振、蛋白質(zhì)芯片(基于陣列或基于矩陣)以及酵母雙雜交系統(tǒng)。
本文所用術(shù)語多肽包括通過肽鍵相連的三個或多個氨基酸單位的聚合體，也可以包括蛋白質(zhì)。多肽可以包括單鏈，或兩個或多個同源或異源多肽鏈，因為在天然蛋白質(zhì)情況下，該蛋白質(zhì)有多個亞基，或在多種多肽情況下，這些多肽彼此相互作用或形成復(fù)合物(例如抗原—抗體復(fù)合物，或有一個蛋白質(zhì)做為底物的酶)。多肽可以包括變性蛋白質(zhì)或天然蛋白質(zhì)。合適的多肽可以包括金屬結(jié)合基團(tuán)或作為電子密度供體或受體的表面活性氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸、半胱氨酸、谷氨酸或天冬氨酸)。其表面上有大于三個組氨酸或半胱氨酸殘基的多肽尤其適用于根據(jù)本發(fā)明方法的純化。所述組氨酸或半胱氨酸可以是天然存在的組氨酸(例如在血紅蛋白、肌紅蛋白和其它含血紅素蛋白中發(fā)現(xiàn)的)，也可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的遺傳工程技術(shù)加到多肽上。
合適的多肽包括，但不限于金屬蛋白、激素、受體、酶、儲藏多肽、血液多肽、抗體、膜多肽、磷酸化多肽、胞質(zhì)多肽、分泌多肽、細(xì)胞器多肽、多肽—核苷酸復(fù)合物、多蛋白復(fù)合物以及通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的遺傳工程技術(shù)產(chǎn)生的突變多肽。
靶物質(zhì)包括靶多肽可以被修飾或設(shè)計包括一個“親和標(biāo)記”以便促進(jìn)靶物質(zhì)與缺乏親和標(biāo)記的非靶物質(zhì)的分離?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的化學(xué)或重組DNA方法形成親和標(biāo)記靶多肽。合適地，通過將編碼靶多肽的多核苷酸序列遺傳工程化而將親和標(biāo)記加到N-或C-末端，或N-和C-末端以使其包括親和標(biāo)記。也可以將編碼合適親和標(biāo)記的序列工程化以便親和標(biāo)記位于靶多肽的內(nèi)部位點。合適的親和標(biāo)記可以包括，例如組氨酸(His)標(biāo)記(例如多組氨酸尾)和金屬結(jié)合域。適用于本發(fā)明的其它親和標(biāo)記可以包括多精氨酸標(biāo)記、Strep-tag、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽、麥芽糖結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、泛素或生物素/抗生物素蛋白。
下面實施例描述了具體組氨酸標(biāo)記蛋白的分離(例如組氨酸螢光素酶，His-RNaseHI和His-甲硫氨酰tRNA轉(zhuǎn)移酶)。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法在分離其它的組氨酸標(biāo)記蛋白(His-endostatin、His-Tau、His-Karyopherin-α2、His-泛素、His-骨橋蛋白以及His-calcinuerin Bα蛋白)中是有效的(數(shù)據(jù)未顯示)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這些方法可用于純化任何組氨酸標(biāo)記蛋白。
可以想象本發(fā)明方法可以用于將任何感興趣的靶分子與起始物質(zhì)中的非靶分子分離，如果所述靶分子相對于起始物質(zhì)中存在的至少一種非靶分子具有與本發(fā)明的組合物形成復(fù)合物的差異傾向。
NTA改性固體載體可以用于從水、空氣、血液或其它感興趣的液體中去除有毒的金屬。例如，NTA改性固體可以用于從工業(yè)廢水和/或從用于人類消費的用水中去除和/或回收潛在有害或有毒的金屬，如鋁、砷、鉍、銻、過剩的鈣、過剩的鐵、金、鋅、鎂、汞、鎘、鉛、銅和銀。尤其有關(guān)的是能從家用管道設(shè)備的管道和焊接接頭處瀝濾的鉛鹽。NTA改性固體載體可以用于與螯合劑相似的方式從水中去除重金屬離子(如美國專利號No.4,500,494)、使用螯合化合物聯(lián)合過濾捕獲金屬離子以分析重金屬離子(如美國專利號No.4,080,171)、純化水(如美國專利號No.4,348,328)或與樹脂聯(lián)合從液體中回收重金屬離子(如美國專利號No.4,220,726)。
本發(fā)明NTA改性固體載體在多種其它想要從液體中提取、滅活或去除金屬的應(yīng)用中也是有用的，例如從血漿中去除鈣使血漿變?yōu)檠?，或揩干實驗室中濺出的放射性金屬離子。NTA改性固體載體還可用于從鉛或汞中毒的個體中去除有毒的金屬。
已報道干預(yù)或耗竭某些金屬離子對于健康狀態(tài)是有用的。因此，本發(fā)明NTA改性固體載體可作為診斷工具用于檢測和提取指示疾病狀態(tài)或?qū)δ骋患膊【哂幸谆夹缘慕饘傧嚓P(guān)分子。
所述NTA改性固體載體可以以與例如美國專利號No.6,428,807所述的常規(guī)方法相似的方式用于制備螯合免疫刺激復(fù)合物。
金屬改性固體載體可以用于將靶物質(zhì)(例如多肽或核酸)與起始物質(zhì)中的非靶物質(zhì)分離。例如，金屬改性載體可以用于將組氨酸標(biāo)記多肽與起始物質(zhì)中存在的其它分子分離?？梢匀芜x地調(diào)整起始物質(zhì)使其包括濃度從大約0到大約60mM的咪唑。使用任何合適的緩沖液從載體上將組氨酸標(biāo)記蛋白洗脫下來。合適的緩沖液可以含有濃度從大約60mM到1M的咪唑。其它合適的洗脫緩沖液可以是pH比感興趣的蛋白質(zhì)的等電點(pI)低的那些洗脫緩沖液，合適的是低于大約pH5。其它合適的洗脫緩沖液包括含有競爭螯合劑如EDTA或EGTA、三氟乙酸、L-組氨酸、二肽、組氨酸肽或聚合體、或咪唑樣聚合體的緩沖液。
金屬改性固體載體可以單獨使用或與其它純化方法包括，例如利用氨改性固體載體聯(lián)合使用。
金屬改性固體載體還可以用于從起始物質(zhì)中去除內(nèi)毒素。合適地，術(shù)語內(nèi)毒素是指與某些種類的革蘭氏陰性細(xì)菌外膜相關(guān)的脂多糖復(fù)合物，這些革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、奈瑟球菌屬(Neisseria)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)或任何其它產(chǎn)生內(nèi)毒素的致病細(xì)菌。
金屬改性固體載體可以用于分離或鑒定低豐度蛋白、膜蛋白或磷酸化蛋白。
金屬改性載體可以用于分離核酸，如WO/02/42398A2中對其它IMAC樹脂的描述。
如下面實施例所述，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明金屬改性固體載體以及其它含有固定化金屬螯合劑的固體載體(例如可以從Qiagen商購獲得的鎳瓊脂糖珠)允許使用可檢測標(biāo)記檢測與所述固體載體復(fù)合的蛋白質(zhì)。在這些實施例中，發(fā)現(xiàn)考馬斯、熒光素或Bodipy定量地與固定到所述固體載體上的蛋白質(zhì)復(fù)合。可以想象任何合適的染料或熒光標(biāo)記都可以用于檢測與含有固定化金屬螯合劑的固體載體復(fù)合的蛋白質(zhì)。合適可檢測標(biāo)記的其它例子包括，但不限于remazol亮藍(lán)R、曙紅異硫氰酸鹽、活性橙、普施安(procion)紅、曙紅碘乙酰胺、活性黑5、活性橙14、孔雀綠異硫氰酸鹽、羅丹明異硫氰酸鹽、remasol亮紫5R、羅丹明和香豆素。
金屬改性固體載體還可以用于分離或評價多肽—多肽復(fù)合物或相互作用；多肽功能的篩選；分離抗體、抗原或抗體—抗原復(fù)合物；定量親和標(biāo)記多肽；疾病的診斷篩選；抗體篩選；藥物拮抗劑和激動劑篩選；報告基因檢測；制備多肽表達(dá)文庫、從細(xì)胞制備多肽文庫；制備多肽微陣列；篩選遺傳工程化酶；共分離相互作用分子(如輔因子)；降低在體內(nèi)內(nèi)毒素的濃度；組織剖析(profiling)；或細(xì)胞剖析。
如在下面實施例所詳述的，發(fā)現(xiàn)胺改性固體載體在多種應(yīng)用中是有用的。胺改性固體載體可以使血紅蛋白易于與起始物質(zhì)中存在的其它物質(zhì)分離、易于膜小泡的分離、膜蛋白的純化以及細(xì)胞的濃縮和純化。
胺改性固體載體可用于從起始物質(zhì)中去除血紅蛋白。如下面實施例所述，血紅蛋白不結(jié)合胺改性二氧化硅磁性顆粒。血紅蛋白與其它蛋白質(zhì)的分離在血紅蛋白存在的任何應(yīng)用中是有用的。例如，通過將裂解物與胺改性固體載體接觸來去除血紅蛋白可以增強(qiáng)網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物表達(dá)體系中表達(dá)的蛋白質(zhì)的純化。去除血紅蛋白在采用熒光法檢測的應(yīng)用中尤其是有用的，因為血紅蛋白通過降低信噪比干擾熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)的檢測。除了促進(jìn)血紅蛋白的去除，本發(fā)明方法還可用于去除含血紅素基團(tuán)的其它蛋白質(zhì)，如肌紅蛋白。
為隨后的鑒定和定性，可使用胺改性固體載體分離膜相關(guān)蛋白質(zhì)。在下面的實施例中，膜蛋白或膜相關(guān)蛋白質(zhì)在含微粒體膜小泡的無細(xì)胞裂解物中表達(dá)并且通過裂解物與胺改性固體載體接觸而使膜和載體形成復(fù)合物從而將表達(dá)的膜蛋白或膜相關(guān)蛋白質(zhì)與存在于裂解物中的其它物質(zhì)分離。該方法可用于篩選體外表達(dá)的蛋白質(zhì)收集物以易于膜蛋白的分離和鑒定，并且該方法適用于這些蛋白質(zhì)的高通量篩選。從實施例可以看出，所述方法可任選地采用使膜蛋白易于回收的非離子去垢劑。
如下面實施例所述，胺改性固體載體可與其它純化方法如金屬改性固體載體聯(lián)合使用以純化感興趣的分子，包括變性或非變性條件下的親和標(biāo)記多肽。所進(jìn)行的使用胺改性固體載體的純化步驟相對于純化方案中的其它步驟的順序可以改變，這取決于靶物質(zhì)和可能存在的任何非靶物質(zhì)的性質(zhì)。
可以想象結(jié)合到胺改性固體載體上的特異靶蛋白隨后可在對所述特定靶蛋白特異的適當(dāng)條件下被洗脫。合適的分級分離條件對于本領(lǐng)域研究人員是公知的。如實施例中所示，含有組氨酸殘基如組氨酸標(biāo)記的靶蛋白不結(jié)合胺改性固體載體。可以想象本發(fā)明胺改性固體載體可以使遺傳工程化而含有降低與胺改性固體載體結(jié)合的部分的靶蛋白分離更容易，這些部分包括但不限于金屬結(jié)合部分或表面活性氨基酸。取決于所用的分離組氨酸標(biāo)記靶多肽的技術(shù)，未結(jié)合的組氨酸標(biāo)記多肽可以存在于流出物中。未結(jié)合的組氨酸標(biāo)記多肽可以用金屬改性固體載體進(jìn)一步純化。
下面的非限制性實施例完全是試圖例證性說明本發(fā)明。
實施例實施例1制備金屬改性的3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基二氧化硅磁性顆粒。
a)制備3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒。
3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒按如下方法制備。一份50ml的3-氨丙基三甲氧基硅烷加入到攪拌的甲醇溶液(900ml)中，之后加入水(50ml)。將該混合物加入100g磁性二氧化硅顆粒(MP-50，W.R.Grace，Columbia，MD)。通過間斷攪動使這些顆粒在室溫保持懸浮狀態(tài)4小時。去除殘留的甲醇/硅烷/水溶液，載體顆粒用3×1.2L的水漂洗然后重懸在1L甲醇中。通過過濾收集3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒并真空干燥。元素分析確定3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒的成分C，0.75；H，0.64；N，0.30。
b)制備3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒。
通過以下步驟制備3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒首先將如上所述制備的3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒(100g)懸浮在N，N-二甲基乙酰胺(600ml)中，加入三乙胺(31ml，210mM)并完全混合。加入400ml含200mM 2，6-二酮-N-羧甲基-嗎啉(根據(jù)美國專利號No.3,621,018制備)的N，N-二甲基乙酰胺，所獲得的混合物室溫下保持懸浮狀態(tài)4小時。去除未反應(yīng)的N，N-二甲基乙酰胺/酐/三乙胺溶液，并用3×1.2L的水漂洗顆粒。元素分析確定3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基改性的磁性二氧化硅顆粒成分C，1.06；H，0.61；N，0.17。
c)制備鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒。
鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒通過如下步驟制備將如上所述制備的3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒100g懸浮在250mM氯化鎳(II)溶液(1L)中，室溫4小時。去除過多的鎳溶液并將所獲得的固體載體用水漂洗5次。
通過使用起始顆粒而不是來自W.R.Grace的磁性二氧化硅顆粒制備與上面實施例1(a)-(c)中所述顆粒相似的改性顆粒。步驟(a)-(c)所用的其它硅膠可購自Sigma-Aldrich Corp(St.Louis，MO)(23，681-0，23，682-9和23，684-5)；Silicyle Inc.(Quebec，CA)(S10030M，10040M，100300T，S10040T和R10030M)；或J.T.Baker(Philipsburg，NJ)(7314-02和7315-20)。商購的硅膠含有直徑在大約5到大約500微米范圍和孔徑大小在大約40到大約1000埃范圍的顆粒。
d)制備鈷(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒。
鈷(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒通過如下步驟制備將如上所述制備的100mg 3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒懸浮在250mM氯化鈷(II)溶液中，室溫保持2分鐘。去除過多的鈷溶液并將所獲得的磁性二氧化硅顆粒用水漂洗5次。
e)制備銅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒。
銅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒通過如下步驟制備將如上所述制備的100mg 3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒懸浮在CuCl2(250mM)溶液中，室溫保持2分鐘。去除銅溶液并將所獲得的磁性二氧化硅顆粒用水漂洗3次。
f)制備鋅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒。
鋅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒通過如下步驟制備將如上所述制備的100mg 3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒懸浮在ZnCl2(250mM)溶液中，室溫保持2分鐘。去除鋅溶液并將所獲得的磁性二氧化硅顆粒用水洗3次。
實施例2制備金屬改性的3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基硅膠。
(a)制備3-氨丙基改性的硅膠將3-氨丙基三甲氧基硅烷(125ml)加入到攪拌的甲醇溶液(2000ml)中，之后加入水(125ml)。將該混合物加入250g硅膠(S10040T，1000埃，Silicycle，Inc.，Quebec，Canada)，然后將所獲得的混合物在室溫保持懸浮狀態(tài)4小時。樹脂沉降殘留的甲醇/硅烷/水溶液后將該溶液輕輕倒出，之后用水(3×2.5L)漂洗顆粒并重懸在2L甲醇中。通過過濾收集氨基硅烷改性固體載體并真空干燥。元素分析確定氨丙基改性固體載體的成分C，0.46；H，0.30；N，0.19。
(b)制備3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基硅膠。
將如上所述制備的3-氨丙基改性固體載體(100g)懸浮在N，N-二甲基乙酰胺(100ml)中，并將三乙胺(31ml，210mM)加入該混合物。將懸浮液徹底混合，然后加入400ml含200mM 2，6-二酮-N-羧甲基嗎啉(根據(jù)美國專利號No.3,621,018制備，該文全部并入本文)的N，N-二甲基乙酰胺，并將獲得的混合物室溫下保持懸浮狀態(tài)4小時。去除未反應(yīng)的N，N-二甲基乙酰胺/酐/三乙胺溶液，并用4×1.2L的水漂洗固體載體。元素分析確定3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基固體載體成分C，0.94；H，0.32；N，0.28。
(c)制備鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基硅膠將一部分如上所述制備的3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基固體載體懸浮在250mM氯化鎳(II)溶液中，室溫4小時。去除過多的鎳溶液并將獲得的固體載體用水洗5次。
實施例3制備丙基乙二胺改性的磁性二氧化硅顆粒將N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺(2ml)加入到攪拌的含有磁性二氧化硅顆粒(2g)的95％甲醇(8ml)中。獲得的混合物在室溫保持懸浮狀態(tài)4小時。去除殘留的甲醇/二氧化硅溶液然后用甲醇(5×40mL)洗顆粒并真空干燥。元素分析確定氨丙基乙二胺改性的二氧化硅磁性固體載體的成分C，0.97；H，0.70；N，0.45。
實施例4制備丙基乙二胺改性的硅膠。
將N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺(2ml)加入到攪拌的含二氧化硅顆粒(1.0g，Davisil，644級硅膠，100-200目，孔徑大小150A)的95％甲醇溶液(8ml)中。獲得的混合物在室溫保持懸浮狀態(tài)4小時。去除殘留的甲醇/二氧化硅溶液，然后用甲醇(5×40mL)洗顆粒并真空干燥。元素分析確定氨丙基乙二胺改性的二氧化硅固體載體的成分C，5.82；H，1.49；N，2.44。
本發(fā)明前面的描述僅是示例性的，其目的是說明和解釋本發(fā)明。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是未偏離本發(fā)明精神實質(zhì)和范圍的改變和修改是可能的。下面的權(quán)利要求應(yīng)該認(rèn)為是包含所有這樣的改變和修改。
實施例5利用3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒去除血紅蛋白和分級分離靶蛋白。
評價3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒從摻加β-半乳糖苷酶和小牛小腸堿性磷酸酶的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中分級分離蛋白質(zhì)和去除血紅蛋白的能力，以Q-瓊脂糖(BioRad，F(xiàn)oster City，CA)和DEAE-瓊脂糖(Sigma-Aldrich，Milwaukee，WI)做為平行對照。制備一包含未處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(100μl)、1ml 20mM Tris緩沖液(pH8.3)、8μl原液β-半乳糖苷酶(Promega Corp.)、40μl小牛小腸堿性磷酸酶(Promega Corp.)的樣品。在1.5ml Eppendorf管中，將一等份分裝樣品(400μl)加入如上所述制備的預(yù)平衡3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒(40mg)中并在室溫下混合。通過將所述管放在磁力表架(magnetic stand)上將所述顆粒與上清液(或流出物)分開，然后移去上清液并保留。所述顆粒用400μl 200mM Tris緩沖液(pH8.3)洗兩次。通過序貫應(yīng)用20mM Pipes緩沖液(pH6.7)、20mM檸檬酸鈉(pH5.0)，之后兩次應(yīng)用含有1M醋酸銨的20mM Tris緩沖液(pH8.3)將結(jié)合蛋白(β-半乳糖苷酶和小牛小腸堿性磷酸酶)洗脫下來。采用如上所述用于分離3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒的分離程序來評價在Q-瓊脂糖或DEAE-瓊脂糖上血紅蛋白的去除和蛋白質(zhì)的分級分離。
通過將一等份上清液用水1∶20稀釋后在415nm處測定吸光度來測定每個上清液中血紅蛋白的含量。
通過如下步驟檢測β-半乳糖苷酶的活性。用超純(nanopure)水1∶1稀釋Promega 2×測定緩沖液[E203A，14041201]，然后將490μl緩沖液加到1.5ml塑料微量離心管(microfuge tube)中。將10μl測試級分加入管中。作為對照，10μl 20mM Tris緩沖液pH8.3代替測試級分加入。這些管子在室溫下孵育45分鐘。將0.5ml等份碳酸鈉溶液[PromegaE202A，14679601]加入每管中，然后使用對照管作為空白在420nm處讀溶液的吸光度。
通過如下的步驟檢測磷酸酶活性。通過將48ml 100mM Tris緩沖液pH8.3與對硝基苯磷酸溶液混合制備對硝基苯磷酸飽和溶液的磷酸酶測定試劑，其中通過將固體p-NPP(Sigma Chemical Co.)懸浮在100％乙醇中而制得對硝基苯磷酸溶液，其用量是如果該物質(zhì)都溶解將產(chǎn)生20mM溶液。將900μl飽和溶液加到1.5ml微量離心管中，然后將2μl所述級分加入管中。作為對照，2μl 20mM Tris pH8.3緩沖液代替測試級分加入。這些管子在37℃孵育120分鐘，用對照溶液將分光光度計調(diào)零后在420nm處測定吸光度。
結(jié)果以圖示的形式顯示在圖1A(氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒)、圖1B(Q-瓊脂糖)和圖1C(DEAE瓊脂糖)中。當(dāng)氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒用于分級分離起始物質(zhì)中的蛋白質(zhì)時，發(fā)現(xiàn)大部分血紅蛋白在未結(jié)合的流出物級分中(圖1A)。相反，用Q-瓊脂糖和DEAE瓊脂糖，最大百分比的血紅蛋白是與樹脂結(jié)合并被20mM Pipes緩沖液(pH6.7)洗脫，大量血紅蛋白被20mM檸檬酸鈉(pH5.0)洗脫。通過使用不同的洗脫緩沖液，從氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒上洗脫結(jié)合蛋白實現(xiàn)了β-半乳糖苷酶和小牛小腸堿性磷酸酶的分級分離(圖1A)。
實施例6使用3-氨丙基二氧化硅磁性顆粒將FluoroTect標(biāo)記的螢光素酶與血紅蛋白分離使用3-氨丙基改性的磁性二氧化硅顆粒從兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中分級分離蛋白質(zhì)。根據(jù)廠商說明書指導(dǎo)，使用FluoroTect-Green體外翻譯標(biāo)記系統(tǒng)(Promega Corp.，Madison，WI)在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中表達(dá)FluoroTect標(biāo)記的螢光素酶。翻譯后，在1.5ml Eppendorf管中，將20μl翻譯反應(yīng)混合物與20mM MOPS緩沖液(pH6.8)預(yù)平衡的5mg氨丙基改性的二氧化硅磁性顆粒(100mg/ml)混合。在室溫混合使顆粒重懸。通過將管子放在磁力表架上將顆粒和上清液分開，然后移去上清液并保留用于隨后的分析。將顆粒用1ml 20mM MOPS緩沖液(pH6.8)洗兩次。用2M醋酸銨(pH6.5)或1M NaCl處理顆粒，然后收集純化級分并用SDS-PAGE分析(圖2)。關(guān)于圖2，如下順序加樣凝膠泳道M，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(Promega Corp.)；泳道1和2，含有10μl反應(yīng)混合物+40μl緩沖液的對照；泳道4和5，醋酸銨(pH6.5)洗脫物；泳道6-9，1M NaCl洗脫物。
圖2所示凝膠泳道1和2與泳道4和5相比，可見螢光素酶被回收在用醋酸銨(pH 6.5)洗脫的級分，血紅蛋白顯著降低，表明大量血紅蛋白在流出物級分出現(xiàn)而沒有結(jié)合到顆粒上。
實施例7使用3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲用于體外翻譯的膜小泡體外蛋白質(zhì)合成使用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(Promega Corp.，Madison，WI)在30℃翻譯核心糖基化對照mRNA(啤酒酵母(S.cerevisiae)α-因子)60分鐘。按表1所總結(jié)步驟制備的反應(yīng)混合物(25μl)含有17.5μl網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物、0.5μl RNA酶抑制劑(RNasin)(40單位/μl)、0.5μl 1mM氨基酸(不含甲硫氨酸)、20μCi L-[35S]甲硫氨酸(Amersham)、2μl的0.1μg/μl核心糖基化對照RNA以及任選地或犬微粒體膜(Promega Corp.)或從Hela細(xì)胞系(Hela-S3)(BiovestInternational Inc.，Englewood Cliffs，NJ)制備的Hela微粒體膜小泡(Promega Corp.制備)。在4-20％Novex凝膠上通過SDS-PAGE、轉(zhuǎn)移到一張PVDF上，然后曝光磷光成像儀(PhosphorImager)暗盒16小時來分析反應(yīng)物。
表1
*糖基化對照mRNA(啤酒酵母α-因子)**犬微粒體膜***Hela微粒體膜等份3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒(60mg/ml)加入如表1所示的25μl翻譯反應(yīng)混合物中。4×(10μl)SDS緩沖液加到～20-25μl上清液(流出物)中，熱變性并用SDS-PAGE檢測。顆粒用1ml 20mM MOPS緩沖液(pH 6.8)洗一次并用25μl含1M NaCl的MOPS緩沖液(pH 6.8)洗脫蛋白質(zhì)。用10μl 4×SDS緩沖液混合洗脫物，加熱變性并用SDS-PAGE檢測。將10μl含1M NaCl的MOPS緩沖液(pH 6.8)和10μl 4×SDS緩沖液加入氨丙基磁性二氧化硅顆粒中，加熱變性并用SDS-PAGE檢測。作為對照，未與氨丙基磁性二氧化硅顆粒接觸的一等份反應(yīng)混合物(3μl)用20μl 20mM MOPS(pH6.8)和10μl 4×SDS緩沖液處理，加熱變性并用SDS-PAGE檢測(圖3)。這一實驗結(jié)果顯示使用3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒可以分離和分析體外表達(dá)和翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。
實施例8膜蛋白的鑒定和純化在Promega公司用Hela細(xì)胞系(Hela-S3)(Biovest InternationalInc.)制備的Hela微粒體膜小泡存在的情況下，使用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(Promega公司，Madison，WI)在50μl反應(yīng)體系中翻譯啤酒酵母α-因子mRNA 60分鐘。翻譯反應(yīng)體系(每50μl)含有35.0μl網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物、1.0μl RNA酶抑制劑(40單位/μl)、1.0μl 1mM氨基酸(不含甲硫氨酸)、20μCi L-[35S]甲硫氨酸(Amersham Biosciences，Sunnyvale，加利福尼亞)、2μl的0.1μg/μl核心糖基化對照RNA以及Hela微粒體膜小泡。反應(yīng)混合物的一部分用4×SDS緩沖液處理，加熱變性，然后在4-20％Novex凝膠上通過SDS-PAGE分析。將凝膠轉(zhuǎn)移到一張PVDF上，然后曝光磷光成像儀暗盒16小時進(jìn)行分析(圖4)。
下面是多種反應(yīng)混合物在SDS-PAGE分離前所經(jīng)歷的可選擇處理的總結(jié)。
(1)翻譯反應(yīng)之后，將反應(yīng)混合物以1∶1比例(即10μl混合物比10μl顆粒)或1∶1.7比例(即30μl混合物比50μl顆粒)加到3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒中。顆?；旌衔镉?ml 20mM MOPS緩沖液洗一次。顆粒用20μl含1N NaCl的20mM MOPS緩沖液和10μl 4×SDS緩沖液處理。加熱變性顆?；旌衔?，然后通過SDS-PAGE分析上清液，如圖4泳道1A、1B和2A、2B所示。
(2)翻譯反應(yīng)之后，3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲后用蛋白酶K進(jìn)行有限蛋白酶解。將反應(yīng)混合物以1∶1比例(即10μl混合物比10μl顆粒)或1∶1.2比例(即40μl混合物比50μl顆粒)加到3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒中。顆粒用1ml 20mM MOPS緩沖液洗一次，然后用10μl 50mM Tris/CaCl2緩沖液和2μl 50mM CaCl2處理。混合物在冰上孵育10分鐘。孵育后，加入蛋白酶K(1mg/ml 1μl)或者可替換地加入蛋白酶K(1mg/ml 1μl)和Triton X-100(10％ 1μl)并將所獲得的混合物在冰上孵育1小時。通過加入2μl 2mg/ml PMSF終止蛋白酶K反應(yīng)。另外加入5μl 20mM MOPS緩沖液和10μl 4×SDS。加熱變性反應(yīng)混合物并用SDS-PAGE分析。當(dāng)所述反應(yīng)用40μl混合物時，下述試劑也增加4倍Tris/CaCl2緩沖液、50mM CaCl2、1mg/mL蛋白酶K、TritonX-100(10％ 1μl)、2mg/mL PMSF。取少量的反應(yīng)混合物用于凝膠分析。然后10μl 4×SDS緩沖液加入反應(yīng)顆粒中。加熱變性顆?；旌衔?，并用SDS-PAGE分析上清液，如圖4泳道3A、3B和4A、4B所示或如圖4使用Triton X-100溶解膜蛋白的泳道7A、7B和8A、8B所示。
(3)翻譯反應(yīng)之后，蛋白酶K處理后進(jìn)行3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲膜小泡。將反應(yīng)混合物(即10μl)加到2μl的50mM CaCl2中?；旌衔锉戏跤?0分鐘。將蛋白酶K(1mg/ml 1μl)或蛋白酶K(1mg/ml1μl)和Triton X-100(10％ 1μl)加入反應(yīng)混合物中，并在冰上孵育1小時。通過加入2μl的2mg/ml PMSF終止反應(yīng)。將3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒(10μl)加入混合物中。允許顆粒懸浮液沉降，并用1ml 20mMMOPS洗顆粒一次。為洗脫膜結(jié)合蛋白，20μl含1N NaCl的20mMMOPS緩沖液加入顆粒中。為準(zhǔn)備SDS-PAGE分析，10μl 4×SDS緩沖液加入混合物中。之后，加熱變性所述混合物并用SDS-PAGE分析。當(dāng)反應(yīng)使用40μl混合物時，下述試劑也增加4×體積Tris/CaCl2緩沖液、50mM CaCl2、1mg/mL蛋白酶K、Triton X-100(10％ 1μl)、2mg/mL PMSF。取少量的反應(yīng)混合物用于凝膠分析。將反應(yīng)顆粒與10μl 4×SDS緩沖液組合，加熱變性顆?；旌衔?，然后用SDS-PAGE分析上清液，如圖4泳道5A、5B和6A、6B所示或圖4使用Triton X-100溶解膜蛋白的泳道9A、9B和10A、10B所示。
如下所述加樣圖4所示凝膠
泳道M標(biāo)記泳道1RRL+mRNA泳道1ARRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(10μl反應(yīng)混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道1BRRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(30μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道2RRL+mRNA+HMM泳道2ARRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(10μl反應(yīng)混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道2BRRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(30μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道3ARRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲---蛋白酶K處理(10μl反應(yīng)混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道3BRRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅捕獲---蛋白酶K處理(40μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道4ARRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性顆粒捕獲---蛋白酶K處理(10μl反應(yīng)混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道4BRRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲---蛋白酶K處理(40μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道5ARRL+mRNA---蛋白酶K處理---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(10μl反應(yīng)混合物+10μl氨基二氧化硅磁性顆粒)泳道5BRRL+mRNA---蛋白酶K處理---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(40μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道6ARRL+mRNA+HMM---蛋白酶K處理---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(10μl反應(yīng)混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)
泳道6BRRL+mRNA+HMM---蛋白酶K處理---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(40μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道7ARRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲---蛋白酶K處理+Triton X-100(10μl反應(yīng)混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道7BRRL+mRNA---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲---蛋白酶K處理+Triton X-100(40μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道8ARRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲---蛋白酶K處理+Triton X-100(10μl反應(yīng)混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道8BRRL+mRNA+HMM---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲---蛋白酶K處理+Triton X-100(40μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道9ARRL+mRNA---蛋白酶K處理+Triton X-100---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(10μl反應(yīng)混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道9BRRL+mRNA---蛋白酶K處理+Triton X-100---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(40μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道10ARRL+mRNA+HMM---蛋白酶K處理+TritonX-100---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(10μl反應(yīng)混合物+10μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)泳道10BRRL+mRNA+HMM---蛋白酶K處理+TritonX-100---3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒捕獲(40μl反應(yīng)混合物+50μl 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒)
泳道11RRLRRL兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物HMMHela微粒體膜制備物這一實驗結(jié)果顯示使用3-氨丙基磁性二氧化硅顆?？煽焖勹b定和定性無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系中表達(dá)的膜蛋白。
實施例93-氨丙基磁性二氧化硅顆粒對細(xì)菌細(xì)胞的捕獲細(xì)菌細(xì)胞(大腸桿菌JM109)在37℃Luria肉湯中培養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物懸液(每份500μl)轉(zhuǎn)移分裝在Eppendorff管中。通過將150μl的100％異丙醇和350μl無菌雙蒸水加入所述管中而制備用15％異丙醇處理的樣品。通過將300μl 100％異丙醇及200μl無菌雙蒸水和細(xì)胞混合而制備用30％異丙醇處理的樣品。通過將150μl 100％異丙醇、200μl5M NaCl及150μl無菌雙蒸水和細(xì)胞混合而制備用15％異丙醇和1MNaCl處理的樣品。通過將300μl 100％異丙醇及200μl 5M NaCl和細(xì)胞混合而制備用30％異丙醇和1M NaCl處理的樣品。將3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒(10mg)加入每管中并混合1分鐘。在對照管中不加入顆粒。通過將管子放在磁鐵上以捕獲磁性二氧化硅顆粒從而將上清液中未結(jié)合的細(xì)胞移去，并測定上清液的OD600。結(jié)果總結(jié)在圖5中，該圖顯示了下面各組的未結(jié)合細(xì)胞的OD600(1)不含顆粒的對照組；(2)雙蒸水處理的培養(yǎng)物；(3)1M NaCl處理的培養(yǎng)物；(4)15％異丙醇處理的培養(yǎng)物；(5)30％異丙醇處理的培養(yǎng)物；(6)15％異丙醇和1MNaCl處理的培養(yǎng)物；及(7)30％異丙醇和1M NaCl處理的培養(yǎng)物。
3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒能在1分鐘或更短的時間內(nèi)從培養(yǎng)物中直接結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞。加入異丙醇和氯化鈉能增加所述顆粒結(jié)合的細(xì)胞數(shù)。用15％或30％異丙醇處理的培養(yǎng)物上清液OD600值比未處理細(xì)胞的值低得多，這表明3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒在結(jié)合用異丙醇處理的細(xì)胞時是有效的。
實施例10使用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分離多肽制備細(xì)胞裂解物表達(dá)組氨酸標(biāo)記蛋白的細(xì)菌細(xì)胞(大腸桿菌JM109)在50ml含有四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中37℃生長過夜。這些細(xì)胞在新鮮的含有四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中1∶100稀釋，并在37℃生長直到OD600在0.4-0.6之間。加入終濃度為1mM的IPTG，誘導(dǎo)細(xì)胞至少3小時。離心沉淀細(xì)胞并重懸在100μl含有100mM Hepes(pH7.5)和10mM咪唑的結(jié)合緩沖液中。超聲破碎細(xì)胞并離心去除未破碎的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。之后，上清液用于下面所述的純化實驗。在一些情況下，不是用超聲破碎細(xì)胞，而是使用通常用于裂解細(xì)菌細(xì)胞的多種去垢劑裂解來破壞細(xì)胞。這些去垢劑的使用不干擾蛋白質(zhì)的分離。
非變性條件下多肽的純化將如上所述制備的鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒(3mg)和超聲破碎的含有組氨酸標(biāo)記蛋白的細(xì)胞組合，并通過移液管吹打或振蕩約1～5分鐘混合。將管置于磁力表架上以將顆粒與上清液分開，并移去上清液。用150μl結(jié)合緩沖液洗顆粒3次。用洗脫緩沖液(100mM Hepes pH7.5和0.1～0.5M咪唑)洗脫結(jié)合到顆粒上的組氨酸標(biāo)記蛋白。使用Pierce蛋白質(zhì)測定系統(tǒng)測量蛋白質(zhì)濃度，并用SDS-PAGE分析所述蛋白質(zhì)(圖6)。
圖6顯示使用所述顆粒將his-RNaseHI與細(xì)胞裂解物中的其它蛋白質(zhì)分離。泳道1，未接觸所述顆粒的裂解物；泳道2，接觸所述顆粒的裂解物的流出物；泳道3，用0.5M咪唑從所述顆粒上洗脫的蛋白質(zhì)；及泳道4，大小標(biāo)記。
在變性條件下蛋白質(zhì)的純化超聲或用裂解緩沖液裂解細(xì)胞前，將尿素或鹽酸胍加入細(xì)胞，終濃度為6M。將30μl鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒加入細(xì)胞裂解物中。通過移液管吹打或振蕩約1～5分鐘混合顆粒。將管置于磁力表架上以將顆粒和上清液分開，并移去上清液。顆粒用含6M尿素或鹽酸胍的結(jié)合緩沖液洗3次(每次150μl)。用洗脫緩沖液(100mM Hepes pH7.5，0.1～0.5M咪唑和6M尿素或鹽酸胍)洗脫結(jié)合到顆粒上的組氨酸標(biāo)記蛋白。用SDS-PAGE或功能性分析分析純化的蛋白質(zhì)。使用Pierce蛋白質(zhì)測定系統(tǒng)測量蛋白質(zhì)濃度。6M尿素或鹽酸胍的存在并不干擾組氨酸標(biāo)記蛋白的結(jié)合或洗脫(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例11使用鎳/鋅/銅/鈷(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒純化和分離血紅蛋白如上所述方法制備鎳3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒、銅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒、鈷3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒和鋅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒。用25μl純化的組氨酸螢光素酶蛋白摻入兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(Promega公司)(200μl)。將50μl等份裂解物分別加入含有10mg鎳、銅、鋅或鈷3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的四個分開的管中。通過移液管吹打或振蕩將裂解物和顆?；旌?～5分鐘。將管置于磁力表架上以將顆粒和上清液分開，并移去上清液。顆粒用含100mM Hepes(pH7.5)的結(jié)合緩沖液洗3次(每次150μl)。蛋白用100μl洗脫緩沖液(100mM Hepes pH7.5和0.1或0.5M咪唑)洗脫并用SDS-PAGE分析(圖7)。結(jié)果表明血紅蛋白和鎳、銅、鋅或鈷3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒結(jié)合，以及這些顆粒能用于將血紅蛋白從不結(jié)合這些顆粒的蛋白中分離出來。
實施例12使用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒和3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒將靶多肽和非靶多肽分離(a)通過用氨丙基改性固體載體預(yù)處理含靶混合物純化靶蛋白。
通過在含有20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和20mM咪唑的結(jié)合緩沖液中超聲表達(dá)His-RNaseHI的大腸桿菌JM109細(xì)胞來制備細(xì)胞裂解物(100μl)。裂解物與3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒(50mg)組合，用移液管吹打10次并孵育2分鐘。上清液與3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒分開，然后與3mg鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒混合并用移液管吹打(10×)2分鐘。將主要含有非靶蛋白的上清液移去并棄除。將鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基顆粒用150μl含有20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和20mM咪唑的緩沖液洗3次。然后用含有20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和0.5M咪唑的洗脫緩沖液(100μl)洗脫His-RNaseHI。通過凝膠電泳分析樣品(圖8)。關(guān)于圖8A，泳道4含有標(biāo)記，泳道5含有未分級分離的細(xì)菌裂解物，泳道6含有來自3-氨丙基磁性顆粒的流出物溶液，泳道7含有來自鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的流出物溶液，泳道8含有來自鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的0.5M咪唑洗脫物，泳道9含有來自3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒的流出物級分，泳道10含有來自鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的流出物，以及泳道11含有來自鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的0.5M咪唑洗脫物。
(b)通過用氨丙基改性固體載體后處理含靶混合物純化靶蛋白。
通過在含有20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和20mM咪唑的結(jié)合溶液中超聲JM109細(xì)胞來制備表達(dá)組氨酸標(biāo)記螢光素酶的大腸桿菌JM109細(xì)胞裂解物。通過用移液管吹打(10×)2分鐘將裂解物(100μl)與3mg鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒混合。使用磁鐵將顆粒與結(jié)合溶液分開，然后用150μl結(jié)合溶液洗3次。通過加入100μl的20mM Tris(pH7.5)、0.5M NaCl和0.5M咪唑pH7.5洗脫靶蛋白。通過與3mg 3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒混合2分鐘并將含靶上清液與顆粒分開來從殘余的背景多肽中進(jìn)一步純化洗脫的靶蛋白。通過凝膠電泳分析樣品(圖8B)。關(guān)于圖8B，泳道1含有未分級分離的細(xì)菌裂解物，泳道2含有用3-氨丙基磁性顆粒處理的流出物溶液，泳道3含有來自鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的流出物以及泳道4含有來自鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒洗脫的蛋白的3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒流出物級分。
這些結(jié)果表明3-氨丙基磁性二氧化硅顆粒，與鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒聯(lián)合使用，有利于污染蛋白質(zhì)的去除。
實施例13使用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒定量多肽的方法將表達(dá)組氨酸螢光素酶(100μl)的細(xì)菌等份裂解物放入3個Eppendorf管中，并與50μl如上所述制備的鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆?；旌希靡埔汗艽荡?～2分鐘。不加裂解物的顆粒作為對照。顆粒用1ml的100mM Hepes(pH7.5)漂洗。將一等份(100μl)含有1％考馬斯藍(lán)的100mM Hepes(pH7.5)加入漂洗的顆?；?qū)φ疹w粒中。顆粒用100mM Hepes pH7.5充分漂洗直到洗液是清亮的。用0.1M咪唑、0.2M咪唑或0.5M咪唑洗脫組氨酸標(biāo)記螢光素酶，將收集的洗脫物拍照(圖9A)。在595nm波長處用分光光度計測定吸光度(圖9B)?；厥盏臉?biāo)記蛋白量和用于洗脫蛋白質(zhì)的咪唑濃度成正相關(guān)。在平行實驗中，用鎳瓊脂糖珠(Qiagen)代替相同μl的鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒，標(biāo)記的蛋白用0.5M咪唑洗脫，并且將洗脫物拍照(圖9C)。
在類似的實驗中，表達(dá)組氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶的JM109細(xì)胞生長到OD600并用1mM IPTG誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)后三小時內(nèi)每半小時收集等份培養(yǎng)物，并用于制備如前節(jié)所述處理的裂解物。圖23A是洗脫的考馬斯藍(lán)染色的蛋白照片，表明標(biāo)記蛋白質(zhì)的回收和誘導(dǎo)后時間成正相關(guān)。圖23B是描繪作為誘導(dǎo)后時間函數(shù)的細(xì)胞生長(OD600測定)和蛋白質(zhì)濃度(通過考馬斯染色蛋白A595測定)的圖示。圖23C是樣品中純化蛋白質(zhì)的SDS-PAGE凝膠。
純化的組氨酸標(biāo)記蛋白與鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒接觸并用BODIPY染料處理。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)/顆粒，并用熒光成像儀掃描顯像(圖24)。關(guān)于圖24，泳道1含有組氨酸螢火蟲螢光素酶(62kDa)；泳道2含有組氨酸-Renilla螢光素酶(36kDa)；泳道3含有組氨酸-RNA酶抑制劑(45kDa)；以及泳道4含有組氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶(76kDa)。
該實驗描述了使用染料顆粒內(nèi)標(biāo)記蛋白質(zhì)來定量蛋白質(zhì)的方法。咪唑干擾蛋白質(zhì)測定法如Bradford或BCA法，使用這些方法測定蛋白質(zhì)濃度前通過透析必須將咪唑去除。相反，因為咪唑不干擾本發(fā)明所述方法，所以不需要先透析樣品就可以直接評價樣品中的蛋白濃度。
實施例14檢測熒光標(biāo)記多肽的方法如上所述制備銅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆?；蜴?II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒。顆粒用100mM Hepes(pH7.5)洗一次。將等份(100μl)表達(dá)組氨酸-螢光素酶的細(xì)菌裂解物或含BSA(10mg/ml)的100mM Hepes(pH7.5)放入不同的Eppendorff管中。每管裂解物中加入等份50μl 10％(w/v)鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒，以及每管BSA中加入50μl 10％(w/v)銅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒，然后移液管吹打混合1-2分鐘。用1ml 100mM pH7.5 Hepes洗顆粒。然后，將100μl熒光素或Bodipy溶于含有60％乙腈的100mM Hepes(pH7.5)中并加入漂洗的顆粒以及對照顆粒中。顆粒用100mM Hepes(pH7.5)洗三次或直至游離、未結(jié)合的熒光素或Bodipy被去除。用0.5M咪唑洗脫結(jié)合多肽。通過將樣品在SDS-PAGE上跑膠之后在熒光成像儀(Fluoroimager)上UV檢測來檢測多肽。從圖10A可以看出，用Bodipy(泳道1)或熒光素(泳道2)標(biāo)記的組氨酸螢光素酶是可檢測的。從圖10B可以看出，用Bodipy(泳道1)或熒光素(泳道2)標(biāo)記的BSA是可檢測的。
這些結(jié)果表明當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)附著在所述顆粒上時，蛋白質(zhì)可以用熒光染料標(biāo)記。這有利于從樣品中去除游離染料，并提供了多肽的快速檢測和定量。
實施例15使用鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒分離tRNA合成酶在S-30(Promega公司)體外翻譯反應(yīng)中表達(dá)編碼組氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶的質(zhì)粒DNA。反應(yīng)混合物含有8μg質(zhì)粒DNA、5μgBodipy f-Met tRNA、氨基酸(25μl)、S-30預(yù)混合物(100μl)和S-30提取物(75μl)。在37℃進(jìn)行反應(yīng)1小時。每個反應(yīng)混合物與3mg鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒組合并用移液管吹打混合。顆粒用100mM Hepes(pH7.5)洗三次。結(jié)合所述顆粒的物質(zhì)用10mM醋酸銨洗脫。作為對照，顆粒與反應(yīng)混合物接觸并漂洗，但不用醋酸銨處理。醋酸銨洗脫物和對照顆粒用100μl蛋白變性緩沖液處理，并在70℃放置5分鐘，然后通過SDS-PAGE分析(圖11)。關(guān)于圖11，泳道1含有未處理的裂解物；泳道2含有施用于顆粒的裂解物的流出物；泳道3含有醋酸銨洗脫物；以及泳道4含有未用醋酸銨處理的顆粒。這些結(jié)果表明tRNA牢固地結(jié)合所述顆粒以及使用含10mM醋酸銨的洗脫緩沖液可以將部分所述tRNA洗脫下來。
實施例16無細(xì)胞表達(dá)的組氨酸標(biāo)記GFP的純化根據(jù)廠商說明書指導(dǎo)，使用快速翻譯系統(tǒng)RT500(RapidTranslation System RT500)(Roche)在0.5ml T7-S30反應(yīng)體積中用15μgDNA模板(pGFP-HIS)進(jìn)行表達(dá)組氨酸標(biāo)記GFP的原核細(xì)胞體外轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)，并用RTS 500裝置(Roche)在30℃孵育20小時。當(dāng)使用時，加入Fluoro TectTM或Bodipy-fMet-tRNA，其濃度為1μg/50μlT7-S30反應(yīng)體積。
通過將反應(yīng)混合物與鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆?；旌霞兓M氨酸標(biāo)記GFP。用100mM Hepes(pH7.5)和10mM咪唑洗顆粒兩次。然后顆粒用30％甲醇洗并用含50％乙腈和0.1％三氟乙酸的水洗脫。
將樣品(5μl，或是漂洗或洗脫樣品時，10μl)和20μl 4×SDS樣品緩沖液混合并在4-20％Novex Tris/甘氨酸凝膠上跑膠，用Gel-Code染色并用數(shù)字式相機(jī)捕獲熒光圖像(圖12)。關(guān)于圖12，泳道1和10含有大小標(biāo)記，泳道2含有無DNA的S-30裂解物，泳道3含有有質(zhì)粒DNA的S-30裂解物，泳道4含有有質(zhì)粒DNA和Bodipy-fMet tRNA的S-30裂解物，泳道5含有有質(zhì)粒DNA的S-30裂解物，泳道4含有有質(zhì)粒DNA和fluorotect tRNA的S-30裂解物，泳道6含有用0.1％三氟乙酸水洗脫的無質(zhì)粒DNA的S-30裂解物，以及泳道7-9含有用含50％乙腈和0.1％三氟乙酸的水洗脫的有質(zhì)粒DNA的S-30裂解物。
結(jié)果表明鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆?？捎糜诩兓跓o細(xì)胞表達(dá)體系中表達(dá)的組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)。
實施例17顆粒內(nèi)tRNA合成酶活性的功能測定。
表達(dá)組氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶的大腸桿菌菌株JM109在50ml含四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中37℃生長過夜。將一等份15ml的過夜培養(yǎng)物加到3L LB培養(yǎng)物中并在37℃生長。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到OD600在0.4-0.6之間時，將IPTG加入，終濃度為1mM并誘導(dǎo)細(xì)胞至少3小時。細(xì)胞離心沉淀，并重懸在10ml 10mM Hepes緩沖液(pH8.0)和5mM MgCl2(緩沖液A)中。將樣品超聲并離心沉淀。將含有組氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶的上清液與10ml鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆?；旌希⒃?℃孵育1小時。顆粒用緩沖液A洗五次，然后用于如下所述的結(jié)合tRNA合成酶的功能測定。用于該檢測的未結(jié)合的純化tRNA合成酶通過用0.5M咪唑從顆粒樣品中洗脫結(jié)合蛋白以及透析洗脫物去除咪唑而獲得。
結(jié)合的tRNA活性通過在37℃孵育下述物質(zhì)15分鐘來測定，所述物質(zhì)為84μl如前節(jié)所述制備的含有結(jié)合的甲硫氨酰tRNA合成酶的顆粒、14.4μl葉酸(0.01M)、8.0μl35S Met、7.2μl(2M)NaCl、12.0μl(1mM)Met、144.0μl(1M)Hepes(pH8.0)、14.4μl(0.1M)MgCl2、57.6μl(0.1M)ATP、14.4μl(0.01M)CTP、14.4μl(0.1M)DTT以及469.6μl無菌雙蒸水。作為對照包括的是如上所述制備的游離組氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶。加入一等份120μl 10％TCA并將混合物在冰上孵育15分鐘。樣品通過0.2μm的玻璃微量滴定濾膜(Whatman)過濾，用10％TCA洗，然后用10％乙醇洗。干燥濾膜并用閃爍計數(shù)器計數(shù)。結(jié)果顯示在圖13中，其示出結(jié)合的組氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶活性接近游離、純化的組氨酸-甲硫氨酰tRNA合成酶活性。
實施例18使用修飾的移液管頭制備用于質(zhì)譜儀分析的蛋白質(zhì)使用Promega 200 Barrier Tip 200μl塑料移液管頭(Promega公司，Madison，WI)制備用于質(zhì)譜儀分析的移液管頭。將50-100μl鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒或銅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒裝載移液管頭，所述顆粒是通過使用直徑從100μm到150μm范圍的二氧化硅(Sigma-Aldrich公司，Milwaukee，WI)如上所述將二氧化硅改性而制備的。將顆粒引入移液管頭中(圖14)。使用前，將移液管頭中的顆粒用1ml含10mM咪唑的100mM Hepes緩沖液(pH7.5)洗三次。移液管頭可以包括具有10μl到1ml容量范圍內(nèi)的塑料或玻璃移液管頭?？梢愿鶕?jù)樣品體積或待純化蛋白質(zhì)量調(diào)整移液管頭中樹脂量。
蛋白質(zhì)純化/分級分離為分析復(fù)合蛋白，將5μl兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(Promega)用195μl100mM Hepes(pH7.5)混合。將50μl樣品轉(zhuǎn)移到如上所述制備的含有100μl銅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的移液管頭中。樣品通過用移液管將樣品吹入和吸出移液管頭5或6次而混合。允許蛋白結(jié)合顆粒1-2分鐘。顆粒用1ml 100mM Hepes(pH7.5)洗三次。結(jié)合蛋白用100μl含0.1％TFA的水洗脫。洗脫的樣品在快速真空儀(Speed Vac)中干燥并在質(zhì)譜儀(HT Laboratories)中分析。
為分離組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)，將含有組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)的50μl細(xì)菌裂解物轉(zhuǎn)移到含有100μl鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的移液管頭中。通過移液管出入吹打至少5或6次將顆粒和樣品混合。顆粒用1ml結(jié)合緩沖液洗三次。蛋白用100μl含0.1％TFA的水洗脫。洗脫樣品在快速真空儀中干燥并在質(zhì)譜儀(HTLaboratories)中分析。
實施例19使用固定化金屬螯合色譜法(IMAC)進(jìn)行多肽的序貫多向分級分離和分離如上所述制備銅(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒、鈷3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒和鋅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒。通過將1ml等份的10％3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒置于磁力表架上以移去液體并將1ml含250mM硝酸鎵(III)的水或1ml含250mM硫酸鐵(III)的水加入顆粒中而制備鎵3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒和鐵3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒。通過移液管吹打?qū)㈩w粒和金屬溶液充分混合。通過置于磁力表架上將顆粒和金屬溶液分開并去除金屬溶液。另一1ml等份的金屬溶液和每管中的顆?；旌?，孵育2分鐘，然后通過置于磁力表架上而去除金屬溶液。顆粒用1ml MilliQ水洗四次，然后用100mM Hepes(pH7.5)洗一次。如下所述進(jìn)行蛋白質(zhì)的分級分離。
復(fù)合蛋白混合物的結(jié)合和洗脫等份兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(5μl)(Promega公司)用195μl 100mMHepes(pH7.5)稀釋。稀釋裂解物與100μl 3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆?；蚺c鎳、鈷、銅、鋅、鐵或鎵3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒在Eppendorf管中通過移液管吹打1-2分鐘混合。然后將管子置于磁鐵上，移去上清液并用1ml 100mM Hepes(pH7.5)洗顆粒三次。用0.5M咪唑?qū)⒔Y(jié)合蛋白從顆粒上洗脫下來，并通過SDS-PAGE分析(圖15)。泳道1，大小標(biāo)記；泳道2，未分級分離的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物；泳道3-9，分別來自3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒，鎳、鈷、銅、鋅、鐵(III)或鎵(III)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的流出物級分；泳道10-16，分別來自3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒，鎳、鈷、銅、鋅、鐵(III)或鎵(III)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒的咪唑洗脫物。這些結(jié)果表明在所用的條件下鈷和銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒相對牢固地結(jié)合兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中的大多數(shù)蛋白質(zhì)。
1到20μl兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物與銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒組合并如上所述操作(圖16A和16B)。泳道1，大小標(biāo)記；泳道2，未分級分離的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物；泳道3-6，分別來自3、5、10或20μl裂解物的流出物級分，在銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒上分級分離；泳道7-10，在銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒上來自3、5、10或20μl裂解物的咪唑洗脫物。每個級分的蛋白質(zhì)濃度用Bradford方法測定。圖16B顯示作為分級分離裂解物體積函數(shù)的流出物或洗脫物的吸光度(595nm)。
通過將8×106細(xì)胞懸浮在1ml 100mM Hepes(pH7.5)中并凍溶破碎細(xì)胞來制備CHO細(xì)胞裂解物。將細(xì)胞離心，然后保留上清液。每個實驗使用一等份100μl上清液。如對兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的說明，進(jìn)行結(jié)合、漂洗、洗脫和分析。結(jié)果顯示在圖17中。關(guān)于圖17A，泳道1含有未分級分離的CHO細(xì)胞裂解物；泳道4含有蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；泳道2、3、5和6含有分別來自3、5、10或20的流出物；泳道7-9含有來自3、5或10μl CHO裂解物的咪唑洗脫物。
另外，還使用了麥胚裂解物(Promega)用于結(jié)合研究。50μl麥胚裂解物加入50μl 100mM Hepes(pH7.5)緩沖液中，用于本實驗。如對兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物的說明進(jìn)行結(jié)合、漂洗、洗脫和分析。結(jié)果示于圖18。
蛋白質(zhì)的序貫多向分離用195μl 100mM Hepes(pH7.5)稀釋等份兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(5μl)(Promega公司)。通過在Eppendorf管中用移液管吹打1-2分鐘將稀釋的裂解物與100μl銅3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙酰基]氨基]-丙基磁性二氧化硅顆?；旌?。然后將管子放置在磁鐵上，移去上清液并用1ml100mM Hepes(pH7.5)洗顆粒3次。通過用1、5、10、20和50％乙腈序貫處理顆粒來洗脫蛋白質(zhì)。然后，用雙蒸水處理顆粒，之后用0.1和1％三氟乙酸(TFA)洗脫。通過SDS-PAGE分析所有這些樣品。結(jié)果顯示在圖19中。
在一分開的實驗中，首先用100、200、500或1000mM咪唑洗脫蛋白質(zhì)，然后用pH8.5、9.5、10.5和12.5的緩沖液洗脫相同顆粒。使用SDS-PAGE分析樣品，結(jié)果顯示在圖20中。
實施例20
磷蛋白的分離如上所述制備的鐵(III)和鎵(III)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒用100mM Hepes(pH7.5)平衡。
制備含有10mg/ml卵清蛋白(Sigma)的100mM Hepes(pH7.5)溶液。等份(100μl)溶液加入鐵(III)和鎵(III)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒中，并用移液管吹打充分混合。包括鎳(II)3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒和非荷電3-[[[雙(羧甲基)氨基]-乙?；鵠氨基]-丙基磁性二氧化硅顆粒作為對照。結(jié)合后，顆粒用100mM Hepes(pH7.5)緩沖液洗三次。結(jié)合蛋白用2％氫氧化銨洗脫。樣品用SDS-PAGE分析(圖21)。平行實驗中，使用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞(用100mM Hepes(pH7.5)1∶1稀釋)并通過SDS-PAGE分析各級分(圖21)。
實施例21篩選膜蛋白表達(dá)文庫使用如上實施例7和8所述的分離膜蛋白方法篩選膜蛋白表達(dá)文庫。在犬或HeLa微粒體膜存在的情況下，在96孔板中使用cDNA克隆庫(pool)(每庫50-100個克隆)作為小規(guī)模轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)的模板以產(chǎn)生蛋白質(zhì)。將胺改性的二氧化硅磁性顆粒加入反應(yīng)混合物中捕獲膜小泡和任何相關(guān)膜蛋白。
本發(fā)明的前述描述是示例性的，其目的是說明和解釋本發(fā)明。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員明顯的是未偏離本發(fā)明的精神實質(zhì)和范圍的改變和修改是可能的。下面的權(quán)利要求應(yīng)該認(rèn)為包含這些改變和修改。
權(quán)利要求
1.從起始物質(zhì)中分離靶物質(zhì)的方法，包括(a)將起始物質(zhì)與選自如下一組的一種組合物接觸以在至少靶物質(zhì)的一部分和所述組合物之間形成復(fù)合物，所述的組為 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1。
2.權(quán)利要求1的方法，其中X是-(CH2)3-，R4是H，以及M+是Ni(II)。
3.權(quán)利要求1的方法，還包括(b)漂洗步驟(a)的復(fù)合物；以及(c)洗脫靶物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中靶物質(zhì)選自由多肽、多核苷酸和內(nèi)毒素組成的組。
5.權(quán)利要求1的方法，其中靶物質(zhì)是多肽。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述多肽包含一個親和標(biāo)記。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述親和標(biāo)記包含多組氨酸標(biāo)記。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述多肽包含一個可檢測標(biāo)記。
9.權(quán)利要求8的方法，其中可檢測標(biāo)記選自熒光團(tuán)和染料或其組合組成的組。
10.將靶物質(zhì)與起始物質(zhì)中非靶物質(zhì)分離的方法，所述方法包括(a)將起始物質(zhì)與一種組合物在適合組合物和非靶物質(zhì)之間形成復(fù)合物的條件下接觸，所述組合物包括 其中X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R1是烴基或取代的烴基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；以及RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3獨立地選自具有可達(dá)六碳主鏈的烴基，具有可達(dá)六碳主鏈的取代的烴基，或氫原子；(b)收集含有靶物質(zhì)的流出物；(c)將步驟(b)的靶物質(zhì)與另一組合物在適合于載體和靶物質(zhì)之間形成復(fù)合物的條件下接觸，所述的另一組合物選自如下一組 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述固體載體選自由二氧化硅和磁性二氧化硅顆粒組成的組。
12.權(quán)利要求10的方法，其中步驟(c)的載體可逆結(jié)合靶物質(zhì)。
13.權(quán)利要求10的方法，其中靶物質(zhì)選自由多肽、核苷酸和內(nèi)毒素組成的組。
14.從起始物質(zhì)中分離膜相關(guān)蛋白的方法，所述方法包括(a)將起始物質(zhì)和一種組合物在適合所述膜和組合物之間形成復(fù)合物的條件下接觸，其中所述起始物質(zhì)包括一種含有微粒體膜小泡的體外表達(dá)系統(tǒng)，并且其中所述組合物包括 其中X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R1是烴基或取代的烴基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；以及RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3獨立地選自烴基，取代的烴基或氫原子。
15.權(quán)利要求14的方法，其中RN1、RN2和RN3獨立地選自如下組成的組最長鏈可達(dá)6個碳原子的烴基，最長鏈可達(dá)6個碳原子的取代的烴基以及氫原子。
16.權(quán)利要求14的方法，還包括將步驟(a)的復(fù)合物和非離子去污劑接觸。
17.將靶物質(zhì)與起始物質(zhì)中非靶物質(zhì)分離的方法，包括(a)將起始物質(zhì)和一種組合物接觸以在靶物質(zhì)和組合物之間形成復(fù)合物，其中所述組合物包括 其中X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R1是烴基或取代的烴基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；以及RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3獨立地選自具有可達(dá)六碳主鏈的烴基，具有可達(dá)六碳主鏈的取代的烴基，或氫原子；其中至少非靶物質(zhì)的一部分不與所述組合物形成復(fù)合物，其中所述非靶物質(zhì)包括含有血紅素輔基的多肽。
18.權(quán)利要求17的方法，其中RN1、RN2和RN3獨立地選自如下一組最長鏈可達(dá)6個碳原子的烴基，最長鏈可達(dá)6個碳原子的取代的烴基以及氫原子。
19.權(quán)利要求17的方法，其中非靶物質(zhì)選自由血紅蛋白和肌紅蛋白組成的組。
20.將靶物質(zhì)和起始物質(zhì)中的非靶物質(zhì)分離的試劑盒，所述試劑盒包括一種組合物，所述組合物包括選自如下一組 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1。
21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中X是-(CH2)3-，R4是H，以及M+是Ni(II)。
22.權(quán)利要求20的試劑盒，還包括至少結(jié)合緩沖液，漂洗緩沖液和洗脫緩沖液之一。
23.減少液體中金屬離子的方法，所述方法包括(a)將液體和一種組合物接觸以在金屬離子和組合物間形成復(fù)合物，所述組合物包括 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；以及n包括整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述組合物是 其中R1是 X是-(CH2)3-；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是氫原子；以及n包括整數(shù)≥1。
25.從起始物質(zhì)中去除細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)將起始物質(zhì)和一種組合物在適合于細(xì)胞和組合物之間形成復(fù)合物的條件下接觸，所述組合物包括 其中X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R1是烴基或取代的烴基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；以及RN是NH2、NHRN1、NRN1RN2或NRN1RN2RN3，其中RN1、RN2和RN3獨立地選自烴基、取代的烴基或氫原子。
26.權(quán)利要求25的方法，其中RN1、RN2和RN3獨立地選自由最長鏈可達(dá)6個碳原子的烴基，最長鏈可達(dá)6個碳原子的取代的烴基以及氫原子組成的組。
27.權(quán)利要求25的方法，其中RN1、RN2和RN3獨立地選自最長鏈可達(dá)6個碳原子的烴基，最長鏈可達(dá)6個碳原子的取代的烴基以及氫原子。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述條件包括存在濃度至少約1％(v/v)的甲醇、乙醇或異丙醇。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述條件包括存在濃度至少約15％(v/v)的異丙醇。
30.權(quán)利要求25的方法，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
31.檢測起始物質(zhì)中蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括(a)將起始物質(zhì)與一種包括固體載體的組合物接觸以在蛋白質(zhì)和組合物之間形成復(fù)合物，所述固體載體包括一種固定化金屬螯合劑；(b)將步驟(a)的復(fù)合物與復(fù)合蛋白的可檢測標(biāo)記接觸以形成標(biāo)記的蛋白復(fù)合物；(c)漂洗載體以去除未復(fù)合的標(biāo)記；(d)檢測標(biāo)記的蛋白復(fù)合物。
32.權(quán)利要求31的方法，還包括(e)檢測復(fù)合的標(biāo)記；以及(f)通過將步驟(e)的復(fù)合標(biāo)記的量與一已知量的標(biāo)記蛋白復(fù)合物相關(guān)聯(lián)而確定所述蛋白質(zhì)的濃度。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述金屬改性固體載體選自如下一組 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1。
34.權(quán)利要求31的方法，其中所述可檢測標(biāo)記選自由熒光團(tuán)和染料，或其組合組成的組。
35.從起始物質(zhì)中分離核酸的方法(a)將起始物質(zhì)和一種組合物在適合的條件下接觸以在核酸和組合物之間形成復(fù)合物，所述組合物選自如下一組 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1。
36.權(quán)利要求35的方法，還包括(b)洗脫步驟(a)的核酸。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述核酸包括tRNA。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述金屬離子是鎳。
39.測定起始物質(zhì)中酶活性的方法，所述酶能催化底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，所述方法包括(a)將起始物質(zhì)與一種組合物接觸以在酶和組合物之間形成復(fù)合物，所述組合物選擇如下組成的組 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1；(b)在合適的反應(yīng)條件下將步驟(a)的復(fù)合物與所述酶的底物接觸；以及(c)檢測底物的減少或產(chǎn)物的增加。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述酶包括多組氨酸標(biāo)記。
41.從起始物質(zhì)分離磷蛋白的方法，所述方法包括(a)將起始物質(zhì)和一種組合物接觸以在磷蛋白和組合物之間形成復(fù)合物，所述組合物選自如下組成的組 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1；其中所述金屬離子選自由鐵(III)或鎵(III)組成的組。
42.用于從起始物質(zhì)中分離磷蛋白的試劑盒，其包含一種選自如下一組的組合物 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1；其中所述金屬離子選自由鐵(III)和鎵(III)組成的組。
43.權(quán)利要求42的方法，還包括至少結(jié)合緩沖液、漂洗緩沖液和洗脫緩沖液之一。
44.用于純化蛋白質(zhì)的裝置，所述裝置含有一種置于裝置內(nèi)的組合物，所述組合物選自如下一組 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1。
45.權(quán)利要求44的裝置，其中所述裝置包括移液管頭。
46.從起始物質(zhì)中分離靶物質(zhì)的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求44的裝置。
47.權(quán)利要求46的試劑盒，還包括至少結(jié)合緩沖液、漂洗緩沖液和洗脫緩沖液之一。
48.從含有至少兩種不同類型多肽的起始物質(zhì)中序貫分級分離多肽的方法，所述方法包括(a)將起始物質(zhì)和一種組合物接觸以在多肽和組合物之間形成復(fù)合物，所述組合物選自如下一組 其中R1是 X是取代或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R2和R3獨立地選自R1、烴基、取代的烴基、鹵素原子、氫原子、羥基、硫醇、胺、鍵合所述固體載體的硅烷醇鍵、鍵合另一個硅烷配體的鍵或O-Si-Y1Y2Y3，其中Y1，Y2和Y3獨立地選自烴基或取代的烴基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；以及n是整數(shù)≥1；和 其中X是取代的或未取代的亞烷基，取代或未取代的亞芳烷基，或取代或未取代的亞芳基；R4是烴基，取代的烴基或氫原子；M+是金屬離子；n是整數(shù)≥1；以及m是0或1；其中所述金屬離子選自由銅和鈷組成的組，以在所述多肽和所述組合物之間形成復(fù)合物；以及(b)通過將所述復(fù)合物和實現(xiàn)選自如下一組效果的至少一種洗脫緩沖液接觸來序貫洗脫多肽，所述的組為改變pH值、改變至少一種鹽的濃度、提供有機(jī)溶劑、改變離子條件、改變疏水條件以及提供螯合劑，或其組合。
全文摘要
本發(fā)明提供組合物及利用金屬改性固體載體分離金屬或分子如多肽、核苷酸或內(nèi)毒素的方法。所述金屬或分子通過使用本發(fā)明改性固體載體從起始物質(zhì)中分離出來。另外，本發(fā)明還提供與所述發(fā)明方法相關(guān)使用的試劑盒。
文檔編號C02F1/28GK1922310SQ200380101590
公開日2007年2月28日 申請日期2003年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月18日
發(fā)明者丹尼爾·J.·辛普森, 托尼·約翰遜, 約翰·舒爾茨, 羅德里克·G.·弗萊明, 麗貝卡·格達(dá)特, 桑查伊塔·卡爾, 羅賓·赫斯特 申請人:普羅梅加公司