專利名稱：：一種分離小分子rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種純化小分子RNA的方法及用于該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
：目前，小分子RNA—一100個(gè)核苷酸或更小的RNA分子是極為引人關(guān)注的領(lǐng)域，并且在分子治療領(lǐng)域很有前途。這些小分子RNA主要包括微小RNA分子(microRNA，簡(jiǎn)寫做miRNA)和小干擾RNA分子(smallinterferingRNA，簡(jiǎn)寫做siRNA)，由于這兩種RNA分子都能夠與耙mRNA雜交，所以能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在不同的組織、器官和不同的發(fā)育時(shí)期，miRNA和/或siRNA的表達(dá)是不同的，它們可能在各種生物發(fā)育、生理活動(dòng)、疾病發(fā)生過(guò)程中起重要的調(diào)節(jié)作用。這些小分子RNA的錯(cuò)誤表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤、自身免疫性疾病等的發(fā)生。因此，對(duì)這些小分子RNA的研究，尤其是對(duì)它們的定量研究將對(duì)它們的生物功能的研究起到重要推動(dòng)作用。但是，以目前廣泛進(jìn)行的miRNA的研究為例，無(wú)論是Northernblot、miRNA克隆還是實(shí)時(shí)定量PCR方法，都是使用總RNA作為樣品。由于成熟的miRNA分子產(chǎn)生于miRNA前體，與其前體具有共同的序列，因此使用總RNA進(jìn)行研究必然導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。對(duì)于小分子RNA研究來(lái)說(shuō)，一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題就是分離得到這些小分子RNA。因此，本領(lǐng)域仍需提供一種簡(jiǎn)單高效的分離小分子RNA的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種小分子RNA的分離方法，該方法利用分子篩的原理，利用外力使含有小分子RNA的樣品通過(guò)固體支持物，大分子物質(zhì)被固體支持物所截留，小分子的RNA能夠通過(guò)固體支持物上的微孔并被收集。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供了一種分離小分子RNA的方法，該方法包括以下步驟1)將含有小分子RNA的樣品施加到固體支持物上；2)施加外力使含有小分子RNA的樣品通過(guò)固體支持物；3)收集通過(guò)固體支持物的小分子RNA;4)使用或表征所述小分子RNA。本發(fā)明涉及的小分子RNA，通常被理解為至多含有100個(gè)核苷酸或更少。小分子RNA包括miRNA和siRNA分子。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，小分子RNA最多有100個(gè)核苷酸或更少，最多有70個(gè)核苷酸或更少，或最多有30個(gè)核苷酸或更少，或最多有25、24.、23、22、21、20、19、18、17個(gè)核苷酸或更少。在一些情況下，小分子RNA是雙鏈的。在另一些情況下，小分子RNA是單鏈的，單鏈的小分子RNA可以含有自互補(bǔ)區(qū)域。這樣的自互補(bǔ)區(qū)域可以是l個(gè)，也可以是多個(gè)。這些區(qū)域可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多堿基對(duì)，而且這些互補(bǔ)可以是100%互補(bǔ)或包含一些錯(cuò)配，如這些區(qū)域中可包含l、2、3、4、5、6、7、8、9、IO或更多堿基錯(cuò)配。具體來(lái)講，本發(fā)明方法可用于分離最長(zhǎng)有100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17或更少個(gè)核苷酸的小分子RNA，和從這些整數(shù)中可以引出的所有范圍。可用于分離小分子RNA的樣品包括含有這種分子的任何樣品。該樣品可以是包含細(xì)胞、組織、器官或其他生物樣品的物質(zhì)，或者該樣品可以是反應(yīng)混合物，如通過(guò)酶學(xué)、合成和/或重組方法生產(chǎn)的小分子RNA的混合物。使含有小分子RNA的樣品通過(guò)固體支持物的外力包括離心力和空氣壓力。所述離心力的大小為9530g12530g，所述空氣壓力大小為函MPa2200MPa。在較佳的實(shí)施方案中，所述含有小分子RNA的樣品為自組織中提取的總RNA。分離時(shí)使用的固體支持物為離心純化柱，純化柱上的濾膜的規(guī)格為2500035000Dalton，優(yōu)選為30000Dalton。使含有小分子RNA的樣品通過(guò)離心純化柱的外力為離心力，離心力大小為953012530g，優(yōu)選為ll畫go本發(fā)明另一方面還提供了一種用于分離小分子RNA的試劑盒，該試劑盒含有固體支持物、按照上述分離小分子RNA的方法進(jìn)行純化的說(shuō)明書。由于小分子RNA在生物生長(zhǎng)發(fā)育和疾病發(fā)生過(guò)程中具有重要作用，對(duì)小分子RNA的研究具有重要的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值。因此，本發(fā)明提供的小分子RNA分離純化方法及其試劑盒對(duì)小分子RNA研究具有重要意義。圖l為純化前后RNA電泳圖，從左至右依次是純化后的RNA、未經(jīng)純化的總RNA，DL2000分子量標(biāo)記。圖2為純化前后U6snRNA熒光定量PCR曲線圖，曲線從左至右依次為未經(jīng)純化的總RNA樣品中U6snRNA擴(kuò)增的三重復(fù)曲線、純化后的RNA樣品中U6snRNA擴(kuò)增的三重復(fù)曲線、U6snRNA的無(wú)模板對(duì)照?qǐng)D3為純化前后hsa-mir-21熒光定量PCR曲線圖，曲線從左至右依次為未經(jīng)純化的總RNA樣品中hsa-mir-21擴(kuò)增的三重復(fù)曲線、純化后的RNA樣品中hsa-mir-21擴(kuò)增的三重復(fù)曲線、hsa-mir-21的無(wú)模板對(duì)照.具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例及附圖進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實(shí)施例只是為了起說(shuō)明作用，而并不是用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1總RNA的制備(1).往離心管中加入500ulEzo1。(2).稱取適量的組織樣品(1020mg左右)于2ml離心管中，勻漿。(3).勻漿后補(bǔ)加500ulEzo1，將離心管上下顛倒混勻，室溫放置10min。(4).加入200ulRNA專用的三氯甲垸，劇烈上下顛倒混勻，直至離心管中的液體徹底混勻，成乳白色狀。(5).室溫放置5min，12000rpm/min離心15min。(6).小心將上清轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5ml離心管中，避免吸動(dòng)中層蛋白相和下層有機(jī)相。(7).往上清中加入500iM預(yù)冷的RNA專用的異丙醇，室溫放置5min。10000rpm/min離心10min。(8).小心棄盡上清，加入lmlRNA專用的75%的乙醇洗滌沉淀，10000rpm/min離心10min。(9).小心棄盡上清，置于室溫晾千乙醇，每管加入20nlDEPC水溶解，混勻。實(shí)施例2cDNA的制備(1).超濾純化將按照實(shí)施例1制備的總RNA共200ul，混勻，取100ul加至超濾柱(超濾膜規(guī)格為30，000Dalton"87baseRNA，U6snRNA=106base,hsa-mir-21=22base),11000g離心15min后取21用作逆轉(zhuǎn)錄。另100ul則取出2ul直接用作逆轉(zhuǎn)錄。(2).RNA逆轉(zhuǎn)錄將上述抽提和純化得到的RNA分別用U6和hsa-mir-21兩種RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物(引物序列U6:GAACGCTTCACGAATTT;has-mir-21:5，-CGCGGTGACATCAGATGCGTTGCGTATACGCGCACCGCGTCAACA-3，)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA模板。逆轉(zhuǎn)錄中所用的緩沖液和酶均為Promega公司產(chǎn)品。(i).逆轉(zhuǎn)錄體系:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(ii).逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:反應(yīng)條件為16°C30min;42°C30min;85°C10min。。實(shí)施例3熒光定量PCR檢測(cè)(1).cDNA模板的稀釋將上述逆轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA稀釋3倍，往20n1的體系中加入40P1RNase應(yīng)asefreeddH20，混勻。(2).熒光定量PCR體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(3).反應(yīng)條件:(i)95°C3min;(ii)95°C15s;(Hi)55°C30s;(iv)72。C30s;第ii至第iv步共40個(gè)循環(huán)。圖1是利用本發(fā)明所述的分離小分子RNA方法對(duì)總RNA進(jìn)行純化前后的電泳對(duì)比圖。條帶1為對(duì)總RNA進(jìn)行純化之后的RNA，與條帶2未進(jìn)行純化的總RNA進(jìn)行比較，純化后的RNA中基本不含有100bp以上的大分子的RNA。圖2為純化前后U6snRNA熒光定量PCR曲線圖，曲線從左至右依次為未經(jīng)純化的總RNA樣品中U6snRNA擴(kuò)增的三重復(fù)曲線、純化后的RNA樣品中U6snRNA擴(kuò)增的三重復(fù)曲線、U6snRNA的無(wú)模板對(duì)照。純化過(guò)程中所采用的離心純化柱中的超濾膜規(guī)格為30000Dalton，約等于87個(gè)堿基長(zhǎng)度的RNA。實(shí)驗(yàn)中用于驗(yàn)證的U6snRNA長(zhǎng)度為106個(gè)堿基，理論上總RNA經(jīng)過(guò)純化之后應(yīng)該濾除全部U6snRNA。從圖2定量PCR的結(jié)果可以看出，未經(jīng)過(guò)純化的總RNA樣品中U6snRNA擴(kuò)增的Ct平均值為11.75，而經(jīng)過(guò)超濾純化后的RNA樣品中U6snRNA擴(kuò)增的Ct平均值為22.80，兩者相差11.05個(gè)循環(huán)，由于定量PCR中每隔3.3個(gè)循環(huán)，初始模板量就有10倍的差距，也就是說(shuō)超濾后的U6snRNA的初始含量是未經(jīng)超濾純化處理的1/2200倍，即0.04%。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明99.96%的長(zhǎng)度為106個(gè)堿基的U6snRNA被濾除了。圖3為純化前后hsa-mir-21熒光定量PCR圖，曲線從左至右依次為未經(jīng)純化的總RNA樣品中hsa-mir-21擴(kuò)增的三重復(fù)曲線、純化后的RNA樣品中hsa-mir-21擴(kuò)增的三重復(fù)曲線、hsa-mir-21無(wú)模板對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中用于驗(yàn)證的hsa-mir-21長(zhǎng)度為22個(gè)堿基，理論上hsa-mir-21不應(yīng)該被濾除。從圖3定量PCR的結(jié)果可以看出，純化前后hsa-mir-21擴(kuò)增的Ct值并未發(fā)生較大的改變，位于15.0115.82之間，表明純化前后hsa-mir-21的初始模板的含量未發(fā)生變化，即長(zhǎng)度為22bp的小分子RNA未被濾除。盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對(duì)本發(fā)明作各種變化和改動(dòng)。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動(dòng)。權(quán)利要求1.一種從樣品中分離小分子RNA的方法，該方法包括以下步驟1)將含有小分子RNA的樣品施加到固體支持物上；2)施加外力使含有小分子RNA的樣品通過(guò)固體支持物；3)收集通過(guò)固體支持物的小分子RNA；4)使用或表征所述小分子RNA。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品為從細(xì)胞或組織中提取的總RNA。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子RNA包括microRNA和/或siRNA分子。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述小分子RNA是microRNA。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固體支持物的規(guī)格為攔截分子量為25000Dalton及以上的分子。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述固體支持物的規(guī)格為攔截分子量為35000Dalton及以上的分子。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固體支持物為離心純化柱。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述外力為離心力，離心力為9530g12530g。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述外力為氣體壓力，氣體壓力為1200MPa2200MPa。10.—種分離小分子RNA的試劑盒，該試劑盒含有固體支持物、按照權(quán)利要求1所述方法進(jìn)行純化的說(shuō)明書。全文摘要本發(fā)明提供了一種新的分離小分子RNA的方法，該方法包括以下步驟1)將含有小分子RNA的樣品施加到固體支持物上，2)施加外力使含有小分子RNA的樣品通過(guò)固體支持物，3)收集通過(guò)固體支持物的小分子RNA，4)使用或表征所述小分子RNA。本發(fā)明還提供了使用上述方法的純化小分子RNA的試劑盒。文檔編號(hào)C12N15/10GK101392247SQ200810036769公開日2009年3月25日申請(qǐng)日期2008年4月29日優(yōu)先權(quán)日2008年4月29日發(fā)明者張佩琢,李志甲,段春曉,譚玉龍申請(qǐng)人:蘇州吉瑪基因藥物科技有限公司